Name: shifting zebrafish lethal skeletal mutant penetrance by progeny testing
Uploaded: 2017-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing at JoVE.com

Chuck Kimmel rehberlik için John Dowd bu üreme stratejisi geliştirme konusunda yardım için iskelet leke mükemmelleştirmek onun iş Macie Walker ve Charlene Walker ve Bonnie Ullmann yararlı Zebra balığı tavsiye için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser K99/R00 DE024190 için JTN tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneyler bu protokol için açıklanan uygun olarak ve Colorado Üniversitesi ve University of Oregon kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komiteleri (IACUC) ile uyum içinde tamamlanmıştır.
 1. Seçili olmayan başlangıç stok hazırlanması fin tarafından ilgi mutant gen <ol><li>tespit heterozigoz taşıyıcılarının küçük 11 ve Genotipleme tam kardeş hayvanların bir hisse senedi seçtiğiniz yöntemi tarafından gibi KASP 12 , 13 , 14. Bu iletişim kuralı Zebra balığı mef2ca b1086 gerilme ile gerçekleştirildi.</li>
	<li>KASP Genotipleme 
	Not: Alleli belirli astar KASP için (bkz. Tablo reçetesi) reaktifler sağlayan şirket tarafından tasarlanmıştır. Uygun 6-karboksil-X-rodamine (ROX) boya konsantrasyon belirli gerçek zamanlı PCR makinesi için elde etmek için şirket Web sitesini ziyaret edin.
	<ol><li>Yer Zebra balığı kuyruk doku 50 µL lizis arabelleği (10 mM tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, % 0.3 iyonik olmayan yüzey aktif, %0,3 Octylphenyl-polietilen glikol). 10 mg/ml İndinavir-K bir 96-şey PCR plaka ve Özet kuyu başına 10 µL termal cycler 55 ° c 2-5 h 20 min 94 ° C inactivation adım gelir için ekleyin. Lizis ürün sindirim. sonra buzdolabında Not: lizis ürünleri başarıyla hazırlık sonra birkaç ay için kullanılan. Doku 50 mM NaOH kullanarak lysed zaman KASP reaksiyonlar başarısız oldu. Bu bulgular NaOH yöntemi genomik DNA hazırlık KASP ile uyumlu değildir öneririz.</li>
		<li>Bir Spektrofotometre kullanarak genomik DNA ölçmek. Böylece yaklaşık 20-30 ng her reaksiyon içerir moleküler biyoloji sınıf su kullanarak genomik DNA şablonu sulandırmak. 
		Not: 4 veya 5 örnekleri ölçmek, onları havuz, sonra dilutions ortalama olarak dayalı tüm örnekleri için hazırlamak. Bu iletişim kuralı için yetişkin kuyruk doku kullanırken, 1: 100 seyreltme genellikle yeterli olur. DNA toplama kesin miktar gerekli değildir.</li>
		Mix <li>Ekle 0,14 µL KASP astar ve örnek bir 1.5 mL microcentrifuge tüp ve mix kısaca içeriği tüp alt toplamak için centrifuging çok önce içine buzda başına karışımı 5 µL KASP ustanın. 
		Not: KASP ana mix ısı ve hassas ışık, buz üzerinde hisse senedi tutmak ve doğrudan güneş ışığı önlemek.</li>
		<li>Kullanılan gerçek zamanlı PCR makinesi için uygun bir 96-şey optik PCR plaka kuyu içine damlalıklı 5 µL astar/Master mix çözüm.</li>
		<li>, Damlalıklı 5 µL seyreltilmiş (yaklaşık 5-7 ng/µL) DNA şablon örnekleri her şey ve karıştırmak için bir pipet ile Aspire edin.</li>
		<li>Nükleaz ücretsiz su 3 Kuyu no-şablonu denetimler (NTC) hizmet ve tür seyreltilmiş teyit homozigoz vahşi, heterozigoz ve homozigoz mutant DNA template olumlu denetimler için 5 µL eklemek için Ekle 5 µL.</li>
		<li>Bir optik net film mühür plaka film her şey tamamen mühürlü sağlanması üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Kısaca bir santrifüj kapasitesi 600 x g içeriği alt toplamak için ve baloncuklar karışımından kaldırmak için plaka. 
		Not: buz ve kalkan tabağa ışıktan devam etmek için hazır kadar devam.</li>
		<li>Ana KASP reaksiyonu gerçekleştirmek için Tablo 1 ' de gösterilen Bisiklete binme programını kullanın.</li>
		<li>Analiz bilgisayar tarafından üretilen elde edilen dağılım çizim görüntüleyin. Başarılı bir tepki Arsa ( şekil 3) puan 4 ayrı gruplandırmalar gösterecektir: üç örnek gruplandırmalar karşılık gelen genotip ve NTCs kaynağını yakınındaki bir gruplandırması. Pozitif denetimler uygun örnek gruplandırma ile ayırmak.</li>
		Eğer bilgisayar programı does değil tanımak karşılık gelen belirli genotip, kümeleri Bisiklete binme ek olarak gruplandırmalar olabilir arsa <li>(Tablo 2) gerekli. Bilgisayar sıkı gruplandırmalar tarafından genotip tanıyana kadar ek program yineleyin.</li>
		<li>Daha kolay kullanım ve analiz için bir elektronik tablo dosyasına Genotipleme sonuçlarını aktarın.</li>
	</ol></li> <li>Birlikte ana su sistemi üzerinde tanımlanan heterozigoz hayvanlar evi.</li></ol>
 2. ilk yuvarlak döl puanlama <ol><li><ol>hayvanlar fin klipten kurtardıktan sonra <li>ikili kardeş heterozygotes çapraz ikili intercrosses kadar ayarla. Bölücüler embriyolar zaman uyumlu 16 emin olmak için kullanın.</li>
		<li>Embriyo toplamak ve kafesleri ıslahı izole ebeveyn çiftleri devam.</li>
		<li>İzlemek izole yetişkin böylece ayrılmış veya kapak ile sağlanan agresif balık (rendelenmiş balık ağları iş güzel). Balık beslenen ve onların su değişti statik su iken IACUC yönergeleri izleyerek.</li>
	</ol></li> <li>Embriyo yetiştirme <ol><li>sahne ve Zebra balığı embriyolar için standart koşullar 17 altında larvaların yükseltmek.</li>
		<li>Phenotypically vahşi türü hayvanlar Yüzme kesesi debriyaj % 75'i şişirilir, günde 5 veya 6 cam pipet kullanırken toplamak. Fenotipik vahşi türleri hangi ebeveynlerinin onları vermiştir kayıt odasında yerleştirin. 
		Not: birçok iskelet mutantlar doğrudur, çekinik öldürücü, çoğu mutant gen ile form yüzmek sidiktorbası 18 , 19 için homozigoz mutantlar başarısız. Bu nedenle, fenotipik vahşi türleri kolayca şişirilmiş yüzmek bladders dayalı mutant onların kardeşleri dan ayırt edilebilir.</li>
	</ol></li> <li>Alcian mavi/Alizarin Red kıkırdak ve kemik boyama <ol><li>0,17 g/L Tricaine kullanarak kendi yüzme bladders şişirmek değil larva anestezi-S embriyo medya. Hayvanlar bir geniş-geçişli cam Pasteur damlalıklı 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine toplamak. Tüp başına en fazla 100 larva ekleyin.</li>
		<li>Her tüpünden embriyo su kaldırmak ve 1 mL 1 x PBS tüp başına % 2 paraformaldehyde hayvan düzeltin. 
		Uyarı: Sulu PFA yanıcı ve ciddi deri ve göz tahrişine neden olur. Uygun kişisel koruyucu ekipman eldiven ve göz koruması gibi giymek ve yıkama eller iyice kullanımdan sonra.</li>
		<li>İçin 1 h rock; uzun fiksasyonu ve kemik boyama bozar. Tüpler bu sırasında düzenli olarak kontrol edin ve hiçbir larvaların sağlamak için tüm sonraki sallanan adımlar tarafına sıkışmış olmak veya tüpün dibine clumped.</li>
		<li>Cam pipet kullanarak tüpler üzerinden sabitleştirici kaldırmak, 1 mL % 50 etanol, ve 10 dakika süreyle rock eklemek</li>
		<li>Hazırlama 20 µL % 0,5 ekleyerek çözüm boyama taze Alizarin Red başına Alcian 1 mL premix (%0,04 Alcian mavi/10 mM MgCl 2 / %80 etanol). % 50 etanol kaldırmak için çözüm her tüp ve rock gecede boyama 1 mL ekleyin. Larvalar 5 gün için leke kalır.</li>
		<li>Leke çözüm tüpler kaldırın ve 1 mL % 80 etanol/10 mm MgCl 2 çözüm her tüp için ekleyin. Tüpler için en az 1 h rock; bir gecede durulama daha net bir Alcian mavi leke üretebilir.</li>
		<li>% 80 etanol/10 mM tüpler MgCl 2 çözümden kaldırmak ve 1 mL % 50 etanol ekleyin; 5 dk. için rock</li>
		<li>Tüpler % 50 etanol çözümden kaldırmak ve % 25 etanol ve rock 5 dakika süreyle 1 mL ekleyin</li>
		<li>% 50 etanol çözüm tüpler kaldırın ve 1 mL taze hazırlanan % 3 H 2 O ekleyin 2 /0.5% KOH beyazlatma çözüm. Kapaklar açık ve tüpler yaklaşık 10 dk ya kadar soluk kahverengi renklendirme çözüm üst kısmında görülebilir bir mikro-tüp rafa stand izin bırakın. 
		Not: Çözüm üstüne kabarcıklar formunun bir katmanı. Dikkatli zamanlama bu adımda gerekli olarak üzerinde beyazlatma zavallı bir çift leke sonuçlanır.</li>
		<li>Beyazlatma çözüm kaldır ve 1 mL % 25 glycerol/0.1% KOH ekleyin; 10 dk 1 h. kaya</li>
		<li>%25 glycerol/0.1% KOH çözeltisi tüpler kaldırmak için her tüp, kaya gece için 10 dakika için 1 mL % 50 glycerol/0.1% KOH çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>% 50 glycerol/0.1% KOH çözüm tüpler kaldırın ve tekrar her tüp için %50 glycerol/0.1% KOH çözeltisi ekleyin. Sallanan bir gecede larva içinde birikebilir hava kabarcıkları kaldırmak yardımcı olacaktır. Mağaza lekeli 4 ° C'de iskelet hazırlıkları ne zaman kullanılıyor.</li>
	</ol></li> <li>Fenotip puanlama <ol><li>puan için seçili fenotip alellerle mutant çoluk çocuk lekeli. Nichols vd. 1 mutantlar Ektopik kemik herhangi bir olay için attı. 
		Not: Zebra balığı anne statik suda ve Alizarin Red leke zamanla, iskelet iskelet hazırlama tamamlama bir kaç gün içinde puanı önemlidir çünkü.</li>
		<li>Alellerle bir fenotip vardır bir genotip oranıdır. Yüzde alellerle aşağıdaki formülle hesaplama: % alellerle (fenotip mutantlarla) = / (mutant toplam sayısı) × 100</li></ol></li></ol> 3. Aile seçimi <ol><li>Seç iki yüksek alellerle ve iki düşük alellerle aile için en yakın üretme. Alellerle ek olarak, verimlilik ve canlılığı yaymak için hangi aileleri seçerken dikkate almanız önemlidir; tartışma bu konuda daha fazla bilgi için bkz:.</li>
	<li>Her ebeveyn çifti bir alt hisse senedi tanımlayıcı vermek: aile.01,.02, vb</li>
	<li>Ev çeşitli karma seks ile ana sistemdeki ebeveyn çiftleri &#39; eşlik eden &#39; balık. Arkadaşı balık herhangi bir Zebra balığı satırı değiştirilmiş pigmentasyon veya fin yapısı gibi kalıcı, belirgin ayırt edici özellikler olabilir. 
	Not: pek çok araştırmacı başarıyla sadece çift olarak bir tank doğurmak devam ederken, olumlu sonuçlar ile birlikte birkaç arkadaşı balık konut tarafından görülür. Bu isteğe bağlı adım çiftleri daha büyük okullarda tutulması hayvanların üreme sağlar ve onlar tekrar tekrar gerektiği gibi geçti bu yüzden kolayca alındı. Ebeveyn çiftleri art arda büyük tam kardeş aileler oluşturmak için çarpı işareti; en az bir hafta önce aynı ebeveyn çifti geçiş tekrar bekleyin.</li>
	<li>Adım 2.2.2 larva ailelerden itlaf. nesil için seçilmiş değil.</li>
	<li>Mutant onların kardeşleri dan alellerle ile seçilen ailelerden gelen vahşi tipi kardeş larva içeren tankları etiket ve yetişkinliğe normal olarak yükseltmek.</li>
	<li>Yeni nesil en az dört tam kardeş aile, iki yukarı doğru satır ve iki aşağı doğru satır için olacak.</li>
	<li>Larva cinsel olgunluğa ulaştığında, yeni nesil bir adımla başlayan Protokolü yineleyin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nichols, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligament+versus+bone+cell+identity+in+the+zebrafish+hyoid+skeleton+is+regulated+by+mef2ca.">Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca.</a> Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).</li><li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ahsa1+and+Hsp90+activity+confers+more+severe+craniofacial+phenotypes+in+a+zebrafish+model+of+hypoparathyroidism,+sensorineural+deafness+and+renal+dysplasia+(HDR).">Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR).</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).</li><li>Cox, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+of+variant+histone+H3.3+for+ectomesenchyme+potential+of+the+cranial+neural+crest.">An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).</li><li>DeLaurier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mef2ca+in+developmental+buffering+of+the+zebrafish+larval+hyoid+dermal+skeleton.">Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton.</a> Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).</li><li>McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Craniofacial+Morphogenesis+in+Zebrafish+Using+4D+Confocal+Microscopy.">Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (83), e51190 (2014).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. (29), e1394 (2009).</li><li>Lush, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progeny+test+and+individual+performance+as+indicators+of+an+animal's+breeding+value.">Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value.</a> J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).</li><li>Lerner, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Population Genetics and Animal Improvement. , (1950).</li><li>Shinya, M., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Highly+Homogeneous+Strains+of+Zebrafish+Through+Full+Sib-Pair+Mating.">Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating.</a> G3. 1 (5), 377-386 (2011).</li><li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dCAPS,+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms:+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics.">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).</li><li>Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Efficient+Zebrafish+Genotyping+Using+PCR+with+High-resolution+Melt+Analysis.">Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).</li><li>He, C., Holme, J., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping:+the+KASP+assay.">SNP genotyping: the KASP assay.</a> Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).</li><li>Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+Kompetitive+Allele+Specific+PCR+(KASP):+overview+of+the+technology+and+its+application+in+crop+improvement.">Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement.</a> Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).</li><li>Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+high+throughput+and+cost+effective+SNP+genotyping+platforms+in+soybean.">Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean.</a> Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).</li><li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae.">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).</li><li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment.">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Schilling, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaw+and+branchial+arch+mutants+in+zebrafish+I:+branchial+arches.">Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches.</a> Development. 123, 329-344 (1996).</li><li>McCune, A. R., Carlson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+ways+to+lose+your+bladder:+common+natural+mutants+in+zebrafish+and+widespread+convergence+of+swim+bladder+loss+among+teleost+fishes.">Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes.</a> Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).</li><li>Mrakov&#269;i&#269;, M., Haley, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inbreeding+depression+in+the+Zebra+fish+Brachydanio+rerio+(Hamilton+Buchanan).">Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan).</a> J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).</li><li>Charlesworth, D., Willis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+inbreeding+depression.">The genetics of inbreeding depression.</a> Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).</li><li>McCune, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+genomic+number+of+recessive+lethals+in+natural+populations+of+bluefin+killifish+and+zebrafish.">A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish.</a> Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).</li><li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li><li>Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+social+behavior+in+young+zebrafish.">Development of social behavior in young zebrafish.</a> Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).</li><li>Eames, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FishFace:+interactive+atlas+of+zebrafish+craniofacial+development+at+cellular+resolution.">FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution.</a> BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).</li><li>Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=barx1+represses+joints+and+promotes+cartilage+in+the+craniofacial+skeleton.">barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton.</a> Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).</li><li>Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edn1+and+hand2+Interact+in+early+regulation+of+pharyngeal+arch+outgrowth+during+zebrafish+development.">edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development.</a> PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Seçici ıslahı Gene işlevi inceliklerini örtüsünü açmak
Daha fazla veya daha az seçici ıslahı tarafından şiddetli olmak mutant fenotipleri değişen gen işlevi yeni anlayışlar kazanmak için basit bir yoludur. Seçili olmayan üreme standart yöntemlerle karşılaştırıldığında, burada sunulan Protokolü mutant fenotipleri çok daha tam bir anlayış yol açabilir. Özellikle, ciddi suşları oluşturarak, mutant fenotipleri tam genişliğini, seçili olma...

Zebra balığı iskelet gelişimi anlamak için güçlü modeli bir sistemdir. Zebra balığı mutant suşları ile biyologlar gen işlevini skeletogenesis sırasında çözebilir. Ancak, Zebra balığı iskelet mutant fenotipleri gelişimsel ve genetik analizler engel olabilir değişken alellerle1,2,3,4 ile sunabilir. Bu yöntemin amacı üç katlı. İlk olarak, sürekli olarak ciddi fenotipleri üretmek Zebra balığı mutant satırlar gibi hızlandırılmış kayıt5 ve nakli6aşağı akım gelişim çalışmaları sağlar. Bu tür çalışmalar sadece tutarsız bir şekilde tezahür fenotipleri çalışmaya çalışırken tarafından sakat kalabilir. İkinci olarak, Zebra balığı suşları akraba evliliği genetik arka plan varyasyon, böylece deneysel tutarlılık ve tekrarlanabilirlik teşvik düşürebilir. Örneğin, tüm in situ hibridizasyon analizlere bir seçmeli olarak doğuştan zorlanma karıştırıcı değişkenliği azaltmak gerçekleştirip sonuçlara güçlendirmek. Üçüncü olarak, ağır ve hafif suşları üreten belirli bir mutasyon neden olabilir tüm fenotipik serisi ortaya çıkaracaktır.
İlk bakışta, ölümcül mutantlar seçici üreme imkansız görünüyor. Seçim için attı hayvanlar ölü olduğunda nasıl bir cins alellerle için? Neyse ki, Aile seçimi, özellikle test, döl tarafından seçici ıslahı için yöntemleri programları birçok yıl7,8için yetiştiriciliği hayvancılık etkinliğini göstermiştir. Bu programlar çoğunlukla sadece bir seks, ineklerin süt üretimi veya tavuk yumurta üretimi gibi mevcut özellikleri için seçici ıslahı için kullanılır. Bu tür erkekler doğrudan, attı olamaz ama onların döl attı ve bir değer daha sonra ailesine atanır. Bu stratejiden borçlanma, burada sunulan Protokolü faiz bir mutant gen için heterozigoz olan sabit ve lekeli mutant yavruları Zebra balığı bir çift gelen puanlama içerir. Bir fenotip içinde homozigoz öldürücü mutant çoluk çocuk alellerle ailesine hangi bireyler nesil satırında üretecek karar verirken atanır. Biz bu yöntemi alellerle Zebra balığı öldürücü iskelet mutantlar1vites için etkili bir yol bulmak.
Benzer şekilde diğer çalışmalar, bu seçici ıslahı Protokolü dikkate ölçütü debriyaj boyutu, çoluk çocuk yaşama, embriyo ve cinsiyet oranı9normal gelişimi gibi altında alır. Ancak, bu faktörlerin tüm mutant alellerle değişen hedefi mutant bir arka plan bağlamında kabul edilir. Bu nedenle, bu iletişim kuralı önceki seçici ıslahı paradigmalar gelişimsel mutant analizleri güçlendirmek hem de arka plan homojenliği artırmak için bir yöntem sunarak genişletir.
Güvenilir, hızlı Genotipleme Protokolü önceden geliştirmek önemlidir bu yüzden geniş Genotipleme, bu iletişim kuralı gerektirir. Orada birçok Genotipleme protokolleri kullanılabilir10,11, ancak biz KASP Genotipleme12,13,14 bulmak daha hızlı, daha verimli ve daha güvenilir--dan yöntemleri maliyetidir restriksiyon enzimi bölünme güçlendirilmiş dizileri10üzerinde temel. Bu nedenle, bu çalışmada KASP iletişim kuralı içerir. Ayrıca, bu iletişim kuralını iskelet mutant fenotipleri odaklanmak ve Alcian mavi/Alizarin Red önceki iletişim kuralları15değiştirilmiş boyama için bir yordam içerir.
Burada açıklanan yöntemi öldürücü mutant alellerle yukarı veya aşağı doğru kayması için basit bir stratejidir. Bu iletişim kuralı iskelet mutant fenotipleri üzerinde duruluyor olsa da, tüm mutant Zebra balığı satırlarının yetiştiriciliği için yararlı bir strateji olacağına inanıyoruz. Aslında, büyük olasılıkla bu üreme stratejisi yarar Zebra balığı uzanır. Biz bu protokolü alellerle organizmaların geniş bir aralıktaki kaydırmaya değiştirilebilir tahmin. Döl sınayarak öldürücü alellerle değişen ileri herhangi bir gelişimsel genetikçi ilerlemesini itme yardımcı olabilir.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde, pelleted, solid</td><td>Ted Pella Co.</td><td>18501</td><td>Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride, solid</td><td>Acros Organics</td><td>223210010</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, Aqueous</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>190 proof Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue, solid</td><td>Anatech Ltd.</td><td>867</td><td>Must be from Anatech</td></tr><tr><td>Alizarin Red, solid</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol, liquid</td><td>Fisher</td><td>BP229 1</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide, liquid</td><td>Fisher</td><td>BP263500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide,&amp;nbsp; solid</td><td>Fisher</td><td>P250 500</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-time PCR Machine</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Microseal &#039;B&#039; seal</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>KASP Master Mix, High ROX</td><td>LGC</td><td>KBS-1016-022</td><td>https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk</td></tr><tr><td>KASP By Design Primer Mix</td><td>LGC</td><td>KBS-2100-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl, solid</td><td>Fisher</td><td>BP153 500</td><td></td></tr><tr><td>potassium chloride, solid</td><td>Fisher</td><td>BP366 500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, liquid</td><td>Fisher</td><td>BP337 100</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fisher</td><td>BP1700 100</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Drop Pasteur Pipets</td><td>Fisher</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>for DNA quantitation</td></tr></tbody></table>

shifting zebrafish lethal skeletal mutant penetrance by progeny testing

Zebra balığı mutant fenotipleri çoğu kez eksik olarak penetrant, sadece bazı mutantlar tezahür. Tutarsız bir şekilde görünür ilginç fenotipleri çalışmaya zor olabilir ve sonuçları semptomlarıdır için yol açabilir. Burada açıklanan artırmak ve öldürücü Zebra balığı iskelet mutantlar alellerle azaltmak için bir basit üreme paradigma protokolüdür. Ölümcül mutantlar seçerek doğrudan yetiştirilmiş olamaz çünkü döl test klasik seçici üreme stratejisi istihdam edilmektedir. Bu yöntem aynı zamanda Kompetitive alleli belirli PCR (KASP) Genotipleme Zebra balığı ve boyama larva Zebra balığı kıkırdak ve kemik için protokolleri içerir. Burada açıklanan yetiştiriciliği strateji uygulayarak downstream uygulamalarında daha fazla tekrarlanabilir sonuçlar sağlayan ilginç bir iskelet fenotip alellerle artırabilir. Buna ek olarak, bu seçici üreme stratejisi aracılığıyla mutant alellerle azalan en önemlisi mutasyona uğramış gen işlevi gerektiren gelişim süreçlerini ortaya çıkarabilir. İskelet özellikle burada kabul edilir iken, önerdiğimiz bu yöntemi tüm Zebra balığı mutant satırları için faydalı olacaktır.

Bu iletişim kuralı bir uzun vadeli hayvancılık anlayış Zebra balığı iskelet mutantlar (şekil 1) yararlı bir tekniktir. Döl test ederek seçici üreme bir kayma genel alellerle hem aşağı hem de yukarı doğru birkaç nesil (Şekil 2) verim. Önceki çalışmalarda, seçici ıslahı iki tur ortalama alellerle aşağı doğru 17'den % %31' e gittim. Benzer şekilde, bizim yukarı doğru çizgi,...

Watch this Scientific Journal Video about Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing at JoVE.com

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Zebra balığı içinde öldürücü iskelet mutant fenotipleri alellerle tarafından seçici üreme değiştirmek için bu iletişim kuralını hedefidir. Ölümcül mutantlar yetişkinliğe büyüdü ve kendilerini bred, bu nedenle bu protokolü izleme ve sınama döl tarafından birden fazla nesilden alellerle seçmek için bir yöntem açıklanır.

Zebra balığı öldürücü iskelet Mutant alellerle test döl tarafından değişen

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

shifting-zebrafish-lethal-skeletal-mutant-penetrance-progeny

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Developmental Biology

Unit 2

Mendelian Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

7.5K Görüntüleme.  University of Colorado Anschutz Medical Campus. Zebra balığı içinde öldürücü iskelet mutant fenotipleri alellerle tarafından seçici üreme değiştirmek için bu iletişim kuralını hedefidir. Ölümcül mutantlar yetişkinliğe büyüdü ve kendilerini bred, bu nedenle bu protokolü izleme ve sınama döl tarafından birden fazla nesilden alellerle seçmek için bir yöntem açıklanır.

Video: Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Genetik

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

Nöroblastom Metastaz Zebra Balığı Modeli

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Kanser Araştırmaları

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

Zebrabalığında Situ Hibridizasyon Boyamada Genotibrasyon ve Nicelik

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Gelişim Biyolojisi

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. Despite a broad genetic heterogeneity, germline gain-of-function mutations in key regulators of the RAS-MAPK pathway underlie the majority of the cases, and, thanks to advanced sequencing techniques, potentially pathogenic variants affecting the RAS-MAPK pathway continue to be identified. Functional validation of the pathogenicity of these variants, essential for accurate diagnosis, requires fast and reliable protocols, preferably in vivo. Given the scarcity of effective treatments in early childhood, such protocols, especially if scalable in cost-effective animal models, can be instrumental in offering a preclinical ground for drug repositioning/repurposing. 
Here we describe step-by-step the protocol for rapid generation of transient RASopathy models in zebrafish embryos and direct inspection of live disease-associated ERK activity changes occurring already during gastrulation through real-time multispectral F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging. The protocol uses a transgenic ERK reporter recently established and integrated with the hardware of commercial microscopes. We provide an example application for Noonan syndrome (NS) zebrafish models obtained by expression of the Shp2D61G. We describe a straightforward method that enables registration of ERK signal change in the NS fish model before and after pharmacological signal modulation by available low-dose MEK inhibitors. We detail how to generate, retrieve, and assess ratiometric FRET signals from multispectral acquisitions before and after treatment and how to cross-validate the results via classical immunofluorescence on whole embryos at early stages. We then describe how, via examining standard morphometric parameters, to query late changes in embryo shape, indicative of a resulting impairment of gastrulation, in the same embryos whose ERK activity is assessed by live FRET at 6 h post fertilization.

RASopathies are multisystem genetic syndromes caused by RAS-MAPK pathway hyperactivation. Potentially pathogenic variants awaiting validation emerge continuously while poor preclinical evidence limits therapy. Here, we describe our in vivo protocol to test and cross-validate RASopathy-associated ERK activation levels and its pharmacological modulation during embryogenesis by live FRET imaging in Teen-reporter zebrafish.

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. ...

Biyokimya

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Biyoloji

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Haploit Zebra balığı Embriyolar üretimi ile<em&gt; In Vitro</em&gt; Gübreleme

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but protospacer adjacent motif (PAM) limitations are a major obstacle to creating accurate animal models of human genetic disorders caused by single-nucleotide variants (SNVs). Until now, some SpCas9 variants with broad PAM compatibility have shown efficiency in zebrafish. The application of the optimized SpRY-mediated adenine base editor (ABE), zSpRY-ABE8e, and synthetically modified gRNA in zebrafish has enabled efficient adenine-guanine base conversion without PAM restriction. Described here is a protocol for efficient adenine base editing without PAM limitation in zebrafish using zSpRY-ABE8e. By injecting a mixture of zSpRY-ABE8e mRNA and synthetically modified gRNA into zebrafish embryos, a zebrafish disease model was constructed with a precise mutation that simulated a pathogenic site of the TSR2 ribosome maturation factor (tsr2). This method provides a valuable tool for the establishment of accurate disease models for studying disease mechanisms and treatments.

This protocol describes how to perform efficient adenine base editing without PAM limitation to construct a precise zebrafish disease model using zSpRY-ABE8e.

zSpRY-ABE8e ile İnsan Genetik Hastalığının Zebra Balığı Modellemesi için Verimli PAM-Less Temel Düzenleme

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...