Name: patterning bioactive proteins or peptides on hydrogel using photochemistry for biological applications
Uploaded: 2017-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications at JoVE.com

Bu çalışmada özellikle Amerikan Kalp Derneği bilim adamı kalkınma hibe gelen hibe tarafından desteklenmiştir (G.D. 12SDG12050083), Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21HL102773, R01HL118245 G.D. için) ve Ulusal Bilim Vakfı (CBET-1263455 ve G.D. CBET-1350240).

1. hazırlık malzemeleri hidrojel sentezi için <ol><li>hazırla hisse senedi çözümler PEGDA, lityum fenil-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) ve steril koşullarda fibronektin ve temel Hesaplamalar (tablo 1A).
	<ol><li>Tartmak ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) bileşikler geçiyoruz. Tipik olarak, çözüm konsantrasyonu 50 ve 200 mg/mL (5-%20 ağırlık/hacim) arasında çalışma PEGDA korumak. Sterilizasyon için 0,22-µm şırınga filtre aracılığıyla PEGDA çözüm pipette. 
		Not: gelen ışık onları korumak için kaydırma bir folyo ile kaplı PEGDA çözümleri tutun. (Her deneme için önerilir) PEGDA taze bir çözüm hazırlayın.</li>
		Üretici firmaya esaslı <li>reconstitute fibronektin protein toz &#39; s tavsiye. 1 mg/mL, aliquot, fibronektin hisse senedi çözüm korumak 60 ila 100 µL aliquots, içine ve onları kadar kullanmak-20 ° C'de depolayın. Aliquots 4 ° C'de defrost için birkaç saat veya gece kullanmadan önce. Protein hisse senedi steril koşullarda verilmediyse, sterilizasyon için 0,22 µm şırınga filtre kullanın. 
		Not: Fibronektin hücre eki için kullanılır. Diğer ECM proteinler yerine.</li>
		<li>LAP stok belgili tanımlık eriyik için tartmak ve içinde PBS çözülür; 25 mg/mL tipik bir hisse senedi toplama olduğunu. Eriterek ile herhangi bir sorun olursa solüsyon içeren temizleyicide. Çözüm sterilizasyon için 0,22 µm filtre geçişi. Kapak folyo sarma ile tur ve 4 ° C'de için birkaç ay kadar devam. 
		Not: Photochemistry için kullanılan photoinitiator kucak mı.</li>
	</ol></li> <li>Hidrojel oluşumu için steril cam slayt kalıpları hazırlamak.
	<ol><li>Otoklav bir polyester sayfası; bir her jel kalıp için gereklidir. İki cam slayt ve üç plastik çubukları (0.5 mm kalınlığında) her jel kalıp için en az 2 h için % 70 etanol içinde emmek, ancak genellikle geceleme ıslatın izin verin. % 70 etanol için kullanmadan önce 10 dk içinde beş bağlayıcı klipleri her jel kalıp için emmek.</li>
		<li>Hücre kültür hood hava kuru birkaç saat için izin için cam slaytlar, çubukları ve bağlayıcı klipleri bir küçük autoclaved levha üzerine koyun.</li>
		<li>Bir cam slayt kenarındaki plastik çubukları yerleştirerek hidrojel kalıpları hazırlama. İkinci cam slayt üstüne yerleştirin. Çubukları bağlayıcı klipleri, iki uzun her tarafı ve bir top ile yanyana sıkıca güvenli. 
		Not: Eğer bu düzgün monte değil, jel çözüm sızıntısı olacak.</li>
		<li>Yüzey sterilize hücre kültürü ile kalıp kullanmadan 30 dk önce ışık UV hood. Yarım aracılığıyla, flip her iki yüzeyler maruz kalıp.</li>
	</ol></li></ol> 2. Proteinler ile ücretsiz Thiol değiştirme <ol><li>thiol proteinler (tablo 1A) üzerinde Amin dönüştürme için elektronik tablo hesaplamalar kullanarak hisse senedi çözümleri hazırlayın.
	<ol><li>Tepki tampon yapmak için PBS pH 8 için ayarlamak ve 5 mM EDTA ekleyin. Pipet tepki arabelleğe 0,22 µm şırınga filtre sterilizasyon için. 
		Not: disülfür bağları oluşturan thiols korur gibi EDTA, önemlidir. Thiol grupları yapılmasına tepki için azaltılmış formunda kalmalı.</li>
		<li>Tartmak 2-iminothiolane (Traut &#39; s reaktif) ve 2 mg/mL (14 mM) hisse senedi çözüm konsantrasyon için tepki arabellekte geçiyoruz. Çözüm 0,22-µm şırınga filtre sterilizasyon için geçişi. 4 ° C'de için birkaç ay kadar hisse senedi çözüm mağaza. 
		Not: 2-iminothiolane ücretsiz aminler solvent maruz üzerinde proteinler tepki verir ve bunları ücretsiz thiols dönüştürür moleküldür.</li>
		<li>Reaksiyon arabellek 0,1 ve 1 mg/mL arasında bir konsantrasyon, protein reconstitute. Sürece daha önce steril, sterilizasyon için 0,22-µm şırınga filtre aracılığıyla bu çözüm pipette. 
		Not: Bu proteinin hidrojel yüzeye desenli biyokimyasal sinyal buydu. Protein konsantrasyonları farklılık gösterebilir, Ayrıca, daha yüksek konsantrasyonlarda güçlü protein desenler için ideal iken.</li>
	</ol></li> <li>Her iki hisse senedi çözümleri birlikte karıştırılarak 2-iminothiolane ile protein tepki; tablo 1B doğru hacim oranı hesaplamak için kullanın. Genelde 8:1 2-iminothiolane protein molar oranını kullanırsınız. 
	Not: Daha büyük proteinler bir veya daha fazla konsantrasyonları sulandırmak, 2-iminothiolane daha yüksek bir molar oranını kullanın. Üreticiye başvurun &#39; s protokolü 15.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 h için tepki kuluçkaya. Thiolated protein ürün üretici takip kalan Reaktanları kaldırmak için desalting spin mikro-sütun kullanmak &#39; s protokolü 16. 
	Not: Dışlama bu reçine 5 KDa sınırıdır.</li>
	<li>Kullanım Ellman &#39; s tahlil kantitatif ölçmek için ücretsiz thiols protein başına sayısı. Üretici takip &#39; s Protokolü tahlil 17.</li>
</ol> 3. Hidrojel oluşumu <ol><li>jel öncü çözüm temel alan değerleri üzerinde Oluştur Tablo 1 c hesaplanır. Mix birlikte PEGDA, fibronektin ve kucak birimleri. Şiddetle homojen bir çözüm olun ama kabarcıklar iç karışıklık yaratarak önlemek için çözüm pipette. Işıktan korunan çözüm devam.</li>
	<li>Jel öncü çözüm jel kalıp iki cam slayda dikkatle pipette. Tipik olarak, kalıp için 800 ile 1.000 µL arasında bir birim eklemek. Jel çözüm için UV ışık kalıp içinde maruz (dalga boyu: 365 nm, güç: 3-4 mW/cm 2) 1-2 hidrojel oluşturmak üzere min için. 
	Not: yetenekleri biçimlenme yüzey proteini sınırlar gibi hidrojel uzun süreli UV ışığa maruz bırakmayın.</li>
	<li>Bağlayıcı klipleri almak ve iki yan çubukları basınç uygulayarak üst cam slayt yavaşça çıkarın.</li>
	<li>Bir uygun ölçekli biyopsi yumruk hidrojel örnekleri kesmek için kullanın. Birden çok hydrogels çoğaltır hizmet ve örnekleri denetlemek için jel dikdörtgenden dışarı yumruk.</li>
</ol> 4. Hidrojel sertlik ölçümleri <ol><li>yumruk hydrogels 8'li ile dışarı mm çap biyopsi yumruk için bir 8 mm paralel plaka rheometer. Bir hidrojel örnek rheometer yük (Tablo reçetesi görmek).</li>
	<li>Alt paralel plaka geometri yani 8 mm çapında yapımı kadar jel yüzeyi ile temas. Gap mesafe 0.5 mm kalınlığında hidrojel örnek için 0.5 mm.</li>
	<li>Gerçekleştir zaman piyango % 0.1 soy, 0.1 Hz frekans ve 37 5 min için ° C. ortalama G &#39; değerleri arasında her zaman süpürme. Çoğaltır her kompozisyon için bağımsız hydrogels çalışacak. 
	Not: G &#39; değer-meli var olmak kararlı zaman puan arasında; Eğer onlar are değil, yüzde süzün ve sıklığı piyango uygun seçmek için gerçekleştirilmesi 14 değerleri.</li>
</ol> 5. Protein desenlendirme <ol><li>hazırla bir bilgisayar destekli tasarım (CAD) programı kullanarak photomask için gerekli kalıbı. Photomask yüksek çözünürlüklü bir yazıcı kullanarak bir şeffaf kağıda yazdırmak. Photomask % 70 etanol için kullanmadan önce 10 dk bekletin. Hava photomask kuru bir hücre kültür başlıklı kullanmadan önce izin.</li>
	<li>Adımında hidrojel 2 yüzeye yüzey desenlendirme için hazırlanan thiolated protein çözüm ekleyin. 1-2 µL/cm 2 thiolated protein çözüm her boşaltma jel yüzeyine pipette. 
	Not: Protein birimin en aza indirmek önemlidir; Sadece hidrojel örnek tüm yüzeyine eşit olarak örtecek kadar eklemek.</li>
	<li>Dikkatle photomask hidrojel bir yüzeye yerleştirin. Hava kabarcıkları hidrojel yüzey arasındaki photomask izin verme. Yavaşça aşağı oluşturan herhangi bir kabarcıklar kaldırmak için maskeyi basın.</li>
	<li>Ortaya çıkarmak için UV ışığı ikinci turunda hidrojel (dalga boyu: 365 nm, güç: 3-4 mW/cm 2) için 30-60 s. 
	Not: Protein fonksiyon kaybına neden olmadan güçlü bir desen oluşturmak için yeterli UV ışık desen maruz önemlidir.</li>
	<li>Hydrogels unreacted tür kaldırmak ve her hidrojel iyi plaka içinde yerleştirmek için PBS ile yıkayın. Jeller her kuyunun içine yerleştirirken dikkatli olun; desenli yüzeyi yukarı yüz olduğundan emin olun. Jelleri PBS içinde 4 ° C'de yıkama; jelleri istikrarlı en az iki hafta 4 ° C.</li>
</ol> 6. Hydrogels hücre tohum için hazırlık <ol><li>5-10 dk 37 ° C'de tohum önce Bazal ortamda jelleri kuluçkaya. İnsan göbek damar endotel hücreleri (HUVECs) için EGM-2 Orta büyüme faktörleri olmadan kullanın. Her eklenen orta hacmi en aza indirmek iyi hidrojel yüzen önlemek için. 48-şey plaka için orta 250 µL hacmi kullanın.</li>
	<li>Spin aşağı 300 x plaka g hydrogels kuyu alt kısmında bulunur ve değil yüzer emin olmak için 3 dakika için. Bunu hemen hücre tohum önce.</li>
</ol> 7. Hücre tohumlama Hydrogels üzerinde hücre Tohumculuk <ol><li>kullanımı Standart steril memeli hücre kültür yordamları ve deneysel prosedürler. HUVECs Standart hücre dekolmanı protokolleri kullanarak doku kültürü şişeler kaldırın. Steril PBS ile doku kültürü çanak yıkama ve tripsin 3-5 dk 37 ile kuluçkaya ° C.</li>
	<li>Trypsinized hücre süspansiyon aşırı hücre orta veya tripsin nötrleştirici çözümü ile yavaşlaması.</li>
	<li>Santrifüj 300 x g de hücre süspansiyon aşağı spin için 5 dk. dikkatle süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet devam.</li>
	<li>Hücre Pelet Bazal EGM-2 hiçbir büyüme faktörleri ile resuspend. Bir hemasitometre Hücre sayımı için kullanın.</li>
	Yavaş yavaş her de bu yüzden jelleri rahatsız etmemek için merkezi haline pipetting tarafından <li>eklemek 75.000 hücreler/cm 2 her hidrojel için yüzey. Bir hücre kültür kuluçka 37 ° C'de iyi tabak yerleştirin İçin birkaç çıkarmak günler, düzenli aralıklarla yemek gözlem için.</li>
</ol> 8. Bioactivity değerlendirilmesi <ol><li>kültür E. coli LB suyu 37 ° C ve 200 rpm yörünge bir süspansiyon süspansiyon geceleme. E. coli kültür spin, dikkatle boşaltmak ve PBS asgari miktar hücre Pelet sulandırmak. Lizozim tartmak ve 1 mg/mL için stok belgili tanımlık eriyik, sulandırmak.</li>
	<li>Küçük hacimli (25 µL) lizozim hisse senedi çözümü microcentrifuge tüpler içine pipette. KUCAK photoinitiator (0-12 mM) çeşitli düzeylerde ekleyin ve UV ışık 1 dk örnekleri ortaya çıkarmak. Ayrı bir grup tur (2 mM) aynı miktarda lizozim ekleyin ve örnekleri için değişen UV ışık kez açığa (0-4 dk). Her tedavi için çoğaltır içerir.</li>
	Lizozim örnekleri için bir final lizozim protein konsantrasyonu 0.5 mg/mL <li>Ekle eşit birim konsantre E. coli çözüm. Oda sıcaklığında 4 h için karma çözümler kuluçkaya. 
	Not: Bu süre bakteriyel hücre duvarı parçalayıcı ve proteinler çözüm içine serbest bırakmak fonksiyonel lizozim sağlar.</li>
	<li>Tedavi edilmezse lizozim E. coli ile olumlu bir denetim için inkübe kullanın; bu % 100 biyoaktif ölçüm düşünün. PBS bir negatif kontrol yalnız ile inkübe lizozim çözüm kullanın.</li>
	<li>Hücre artıkları kaldırmak ve süpernatant korumak için örnekleri spin. Toplam konsantrasyonu protein içinde bakteriyel lysate miktarını ölçmek için süpernatant ölçmek için bir Bradford tahlil çalıştırın.</li>
	<li>Çalıştırmak üretici aşağıdaki Bradford tahlil &#39; s protokolü 18. Kat değiştirme protein konsantrasyon negatif denetimine göre hesaplamak.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-effects+of+matrix+low+elasticity+and+aligned+topography+on+stem+cell+neurogenic+differentiation+and+rapid+neurite+outgrowth.">Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth.</a> Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).</li><li>Evans, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffness+affects+early+differentiation+events+in+embryonic+stem+cells.">Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells.</a> Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).</li><li>Ye, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Stiffness+and+Nanoscale+Spatial+Organization+of+Cell-Adhesive+Ligands+Direct+Stem+Cell+Fate.">Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate.</a> Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).</li><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate.">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li><li>Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently+tethered+TGF-beta1+with+encapsulated+chondrocytes+in+a+PEG+hydrogel+system+enhances+extracellular+matrix+production.">Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production.</a> J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).</li><li>Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decorin+moieties+tethered+into+PEG+networks+induce+chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells.</a> J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).</li><li>Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+gradients+of+chemotropic+factors+from+immobilized+patterns+to+guide+axonal+growth+and+regeneration.">Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration.</a> Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).</li><li>Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+controlled+simultaneous+patterning+of+multiple+growth+factors+in+three-dimensional+hydrogels.">Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels.</a> Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biomaterials+as+instructive+extracellular+microenvironments+for+morphogenesis+in+tissue+engineering.">Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).</li><li>Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+hydrogels+with+immobilized+ephrinA1+for+therapeutic+angiogenesis.">Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).</li><li>McCall, J. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-ene+photopolymerizations+provide+a+facile+method+to+encapsulate+proteins+and+maintain+their+bioactivity.">Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity.</a> Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).</li><li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate:+polymerization+rate+and+cytocompatibility.">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).</li><li>Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+rheological+characterization+of+hydrogels+for+tissue+engineering+strategies.">A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).</li><li>Truat's Reagent Instructions. Thermo Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Ellman's Reagent Instructions. Thermo Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Desalting Columns. GE Life Sciences Available from: <a target="_blank" href="https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf">https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf</a> (2017)</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı biyolojik uygulamalar için biyoaktif protein desen oluşturmak için bir yöntem sağlar. Bu iletişim kuralı farklı deneyler için adapte yapılan birçok değişikliği vardır. İlk olarak, hücre ek gereksinimleri için farklı hücre türleri değişir. Zavallı hücre eki jeller için başlangıçta gözlem yapılırsa, öncü çözüm içindeki ECM protein konsantrasyonu artan tavsiye edilir. Diğer ECM protein kollajen, laminin veya bunların bir arada farklı türleri dahil olmak üzere fibronektin yerine kullanılabilir. Her yeni hücre tipi için hücre eki hidrojel desenlendirme önce optimize edilmelidir. Bu iletişim kuralı da photomasks için kullanıcı tasarlanmış sağlar. İstenen uygulama dayalı, photomasks üretilebilecek çeşitli boyut, şekil ve genel desenleri bulunmaktadır. Tek tip immobilizasyon bir photomask yokluğunda elde edilebilir.
Bu iletişim kuralı belirli sınırlamaları vardır. Vurgulanmış olarak Temsilcisi sonuçları, bu yöntem her adımda UV ışık miktarını duyarlıdır. Dozun hidrojel oluşumu adım sırasında sonraki yüzey bioconjugation için kullanılabilir akrilat grupları sınırlar. Bu nedenle, bu protokolü anahtar bir adımda iyi yönetilen UV ışık pozlama süreleri her adımı için. Ayrıca, bu iletişim kuralı bir yüksek konsantrasyon protein hisse senedi için başarılı desenlendirme gerektirir. Düşük protein konsantrasyonları yoksul yüzey desenleri neden olur. Ayrıca, onlar sadece ayrı desen üretebilir o photomasks da sınırlı hale gelir. Daha karmaşık desenler benzer yaklaşımlar ile elde edilebilir ama daha gelişmiş bir metodoloji gerektirir.
Bu iletişim kuralı mevcut yöntemler için önemli olduğu yüzey sertliği ve protein desenlendirme ayarlamak için basit bir yöntem sağlar. Yüzey sertliği fizyolojik Aralık içinde bir büyüklük aralığı için akrilat kimya hidrojel oluşumu için kullanarak sağlar. Sadece PEGDA konsantrasyonu habercisi çözümünde ayarlama hidrojel sertlik üzerinde kontrol sağlar. Ayrıca, hidrojel substrat ve thiolated arasında hızlı konjugasyon için protein desenlendirme için tıklayın kimya kullanımını sağlar protein değiştirilmiş. Herhangi bir protein veya peptid ilgi uygulanabilir olması için bu iletişim kurallarını sağlar gibi bir anahtar tasarım özelliği bu.
PEG hydrogels biyolojik sistemlere biyokimyasal ipuçlarını görüntülemek için yeni platformlar keşfetmek için kullanılan umut verici Biyomalzeme vardır. İster tek tip yüzey immobilizasyon veya dağınık şekilde belirli kalıpları, bu teknikleri hücre davranışını denetlemek için yeni yollar sağlar. İleride, biomaterial teknolojinin ilerlemesi hücre davranış içine yeni anlayışlar sağlamak ve bizim yetenekleri içinde vivo sinyal motifleri vitro sistemleri içinde özetlemek için daha fazla. Bu kök hücre farklılaşma ve gelişimsel bir kontrollü deneysel sistem içinde sinyal modelleme için yararlı olabilir.

Hücre davranışını etkiler birçok çekim gücü vardır. Genel olarak, tipik hücre kodlamayla teknikleri çözünür faktörler üzerinde hücresel yanıt temin için itimat; Ancak, bu yaklaşım için sınırlamalar vardır. Bu yöntemler yaygın bulunan tüm sinyal motifleri doğru görüntüleyemiyor içinde vivo. Böyle sinyal mekanizmaları münzevi büyüme faktörleri, hücre-hücre sinyallemesi ve dağınık şekilde özel biyokimyasal ipuçları içerir. Ayrıca, yüzey sertliği hücre davranış ve kök hücre farklılaşması içinde önemli bir rol oynayabilir ve kolaylıkla ortak hücre kodlamayla uygulamaları1,2kullanarak yönetilebilir değil. Biomaterial yaklaşımlar sinyal mekanizmaların keşfetmeye başlamak için yeni bir platform sunuyoruz. Özellikle, hydrogels yüzey sertliği3,4, immobilizing proteinler ve peptidler5,6, ayarlama ve dağınık şekilde belirli kalıpları7, oluşturmak için mükemmel aday olan 8.
Hydrogels doku Mühendisliği hücre dışı Matriks (ECM)9,10ile onların biyofiziksel ve biyokimyasal ortak nedeniyle iskele olarak yaygın olarak kullanılır. Biyouyumlu ve vücudun birçok dokularda bulunan doğal polimerler için iskele, ortak seçenekleri bulunmaktadır. Doğal polimerler yüzeyler kullanma sınırlaması onlar bioconjugation için kolay elde edilebilir kimyasal moieties olmaması. Öte yandan, sentetik hydrogels, bu nedenle PEG, hedeflenen kimyaları11,12mükemmel platformlar şunlardır. Ayrıca, PEG hydrogels hücresel yanıt temin değil ve bu nedenle inert omurgalarına biyoaktif iskele oluşturmak için kullanılır.
Biyoaktif hydrogels oluşturmak için kimya reaksiyonları istihdam edilmektedir photopolymerization ve thiol-KD'ı tıklatın. Bu photoreactions bir photoinitiator ve UV ışık kaynağı gerektirir. Photoinitiators UV ışığına tanıttığında, formu radikaller koparamaz. Tezler radikaller reaksiyonu başlatmak için gerekli olan ancak protein bioactivity12,13olumsuz yönde etkileyebilir. Bu nedenle, photoinitiator ve UV pozlama süreleri protein bioactivity korumak için en iyi duruma getirmek çok önemlidir.
Bu yöntemde, hydrogels akrilat akrilat zinciri büyüme photopolymerization sentezlenmiş. PEG-diacrylate (PEGDA) monomerleri dallı polimer ağlar hidrojel yapısı için sorumlu oluşturmak için birbirleri ile tepki. PEGDA monomerleri jel öncü çözüm içindeki konsantrasyonu substrat sertlik kontrol edecek. Hidrojel boyutu nedeniyle küçük gözenek, ECM proteinler fibronektin gibi kolayca hidrojel hücre eki amacıyla içinde dahil edilebilir. Son olarak, bu hydrogels yüzey ile biyoaktif peptidler desenli olabilir veya proteinler thiol-KD ile kimya reaksiyonları tıklatın. Burada, unreacted ücretsiz İnceltilebilen hidrojel sistemi içinde protein veya UV ışığına maruz kaldığında peptid bulunan ücretsiz thiols ile tepki olacaktır. Proteinler veya peptidler hidrojel yüzeyinde immobilize sonra hidrojel 4 ° C'de birkaç hafta için bioactivity kaybetmeden depolanabilir. Bu kolaylık, esnek deneysel planlama ve labs arasında işbirliği imkanı sunmaktadır. Genel olarak, bu platform biyomekanik ve mekansal biyokimyasal kontrol, bağımsız birbirlerinin hücresel davranışlarını etkilemek belgili tanımlık fırsat sağlar.

<table><tbody><tr><td>PEG-diacrylate (PEGDA)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-3400</td><td>Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used.</td></tr><tr><td>Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td><td></td><td></td><td>Synthesized in lab</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Corning</td><td>356008</td><td>Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Photomask</td><td>FineLine Imaging</td><td>n/a</td><td>Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI.</td></tr><tr><td>Binder Clips</td><td>Various Vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compact UV Light Source (365nm)</td><td>UVP</td><td>UVP-21</td><td>Other UV light sources can be used, calibration of power is required.</td></tr><tr><td>2-iminothiolane (Pierce Traut&amp;rsquo;s Reagent)</td><td>Thermo Sci.</td><td>26101</td><td></td></tr><tr><td>Ellman&amp;rsquo;s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)</td><td>Thermo Sci.</td><td>22582</td><td></td></tr><tr><td>human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td><td>Lonza</td><td></td><td>passage number between 6- 10</td></tr><tr><td>EGM-2 Media</td><td>Lonza</td><td>CC31-56, CC-3162</td><td>EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin EDTA</td><td>Life Tech</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Neutralizer</td><td>Life Tech</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Various Venders</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Sci. Bright-line</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>0.22&amp;micro;m filter</td><td>Cell Treat</td><td>229743</td><td></td></tr><tr><td>1mL Syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Microscope Slides</td><td>Fisher Sci.</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>Plastic spacers</td><td>Various Venders</td><td></td><td>0.5mm thickness</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>BICCA</td><td>2546.70-1</td><td></td></tr><tr><td>Bio-shield</td><td>Bio-shield</td><td>19-150-0010</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagent&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desalting Resin - Sephadex G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>95016-754</td><td></td></tr><tr><td>Microspin Columns</td><td>Thermo Sci.</td><td>PI69725</td><td></td></tr><tr><td>AR-G2 rehometer</td><td>TA Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

patterning bioactive proteins or peptides on hydrogel using photochemistry for biological applications

Hücre davranış ve kök hücre farklılaşması etkileyebilecek birçok biyolojik bir çekim gücü vardır. Genel hücre kültür yaklaşımlar içinde orta kontrol hücre davranış olarak çözünür faktörler güveniyor. Ancak, çözünür eklemeler belirli motifler içeren hikâyeler, matris bağlı büyüme faktörleri gibi sinyal, hücre-hücre sinyallemesi ve hücreleri üzerinde ortak etkiler vardır kayma biyokimyasal cues taklit edemez. Ayrıca, yüzey sertliği gibi Matrix biyofiziksel özellikleri geleneksel hücre kültürü çalışmalarının yöntemler kullanarak kolaylıkla yönetilebilir değil hücre kader, önemli rol oynarlar. Bu yöntemde, desenli biyoaktif proteinler sentetik polietilen glikol (PEG) hydrogels photochemistry kullanarak sağlamak için basit bir protokol tanımlayan. Bu platform yüzey sertliği ve kayma biyokimyasal cues bağımsız kontrol için sağlar. Bu hydrogels çok sayıda fizyolojik ilgili sertlik değerleri elde edebilirsiniz. Ayrıca, bu hydrogels yüzeylerin photopatterned biyoaktif peptidler ile olabilir veya proteinler thiol-KD ile kimya reaksiyonları tıklatın. Bu yöntemler protein işlevi sonra yüzey immobilizasyon korumak için optimize edilmiştir. Bu, herhangi bir protein veya peptid ilgi desenleri çeşitli oluşturmak için uygulanacak çok yönlü bir protokoldür. Son olarak, onlar dağınık şekilde belirli sinyallere yanıt olarak bu biyoaktif hydrogels yüzeyler numaralı seribaşı hücreler zamanla izlenebilir.

PEG hydrogels yüzeyinde biyoaktif desenleri oluşturmak için protokol şekil 1' de gösterilmiştir. Bir elektronik tablo birim ve konsantrasyon için her hisse senedi eriyik (tablo 1A) hesaplamak için geliştirilmiştir. Proteinler hidrojel yüzey immobilize 2-iminothiolane (şekil 1B) ile değiştirilir. Bu reaksiyon tablo 1Bbirimlerden kullanılarak gerçekleştirilir. Öncü hidrojel çözüm ile % 10 ağırlık/hacim PEGDA kucak (şekil 1A) ile hazırlanır. Çeşitli öncü PEGDA konsantrasyonları istenilen yüzey sertliği (Şekil 2A) verim için kullanılabilir. Fibronektin hücre eki amaçlar için bu öncü çözüm içinde yer alır. Ayrıntılı karıştırma sonra bu çözüm hazır kalıp içine pipetted ve UV ışığı (şekil 1C) maruz. UV ışık pozlama indirilmelidir; pozlama bir hidrojel üretmek için yeterli olmalıdır. Hidrojel örnekleri için istenen iyi plaka (şekil 1C) için uygun çap yumruk. Yüzey desenlendirme için değiştirilmiş protein çözüm bir hidrojel yüzeyine pipetted ve eşit yayılmış. Asgari miktar kullanılmalıdır; protein birim hidrojel tüm yüzeyine karşılamak için yeterli olmalıdır. Önceden tasarlanmış photomask doğrudan hidrojel yüzey yerleştirilir; Hava kabarcıkları maske ve hidrojel arasında kaçınılmalıdır. UV ışığı ikinci turunda kovalent UV maruz protein hidrojel çekimlerine kullanılır. Hidrojel örnekleri unreacted proteinler kaldırmak ve immobilize protein desen (şekil 1D) ortaya çıkarmak için durulanır.
Photoinitiator konsantrasyonu ve UV pozlama süresi ne zaman proteinler mevcuttur en aza indirmek önemlidir. Lizozim bioactivity bir göstergesi olarak kullanarak, biz tur photoinitiator konsantrasyonu daha az 2 mM (Şekil 2B) olmalıdır ve UV pozlama süresi daha az 2 bir protein korumak için min (Şekil 2C) toplam bulundu bioactivity % 80'den büyük.
UV çekim hızı hidrojel oluşumu ve protein desenlendirme sırasında başarılı Protokolü (şekil 3) geliştirmek için her iki önemli parametre vardır. Her şeyden önce UV Işınlarına maruz kalma hidrojel oluşumu sırasında en aza indirmek ücretsiz akrilat fonksiyonel gruplar için sonraki protein immobilizasyon reaksiyonlar (şekil 3A) korumak açısından önemlidir. UV ışığı 2 dk daha uzun süre maruz Hydrogels immobilize protein desenleri oluşturmak mümkün değildir. Ayrıca, UV Işınlarına maruz kalma protein desene arttıkça, daha fazla protein yüzeye (şekil 3B) tepki.
Son olarak, hücreleri bunlar kültürlü desenli hücre davranış işlemek için hidrojel yüzeylerde. Hydrogels üzerinde immobilize desenleri potansiyelini göstermek için VEGF, endotel hücreleri için önemli bir büyüme faktörü desenli ve HUVECs Bazal EGM-2 Orta (şekil 4) kullanarak yüzeyde kültürlü. HUVECs düzgün VEGF desenli PEG hydrogels(şekil 4)yüzeyine numaralı seribaşı. Tohum sonra iki gün HUVECs immobilize VEGF (şekil 4B, C) bulunan hidrojel kayma bölgeler doğru geçirmek için tespit edildi. Bu hücre davranışlarını etkilemek için kullanılan PEG hydrogels biyoaktif protein izi bir örnektir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55873/55873fig1.jpg"> 
Şekil 1: Hidrojel oluşumu ve protein desenlendirme şematik. (A)habercisi hidrojel çözüm PEGDA monomerleri, photoinitiator ve ekstraselüler protein ile hücre eki için hazırlamak. 2-iminothiolane ile tepki tarafından thiol grupları proteinler ile ücretsiz (B) Değiştir. (C) öncü çözüm hazır kalıp içine Pipette ve hidrojel oluşturmak için UV ışığına maruz kalmaktadır. İstediğiniz boyuta hidrojel örnekleri yumruk. (D) pipet değiştirilmiş protein çözüm hidrojel yüzeyinin bir photomask yüzeye ve UV ışığı ikinci bir tur için maruz kalmaktadır. Unreacted türler önce görüntüleme ve hücre tohum kaldırmak için jel durulayın. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55873/55873fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55873/55873fig2.jpg"> 
Resim 2 : Sertlik ve protein bioactivity oransal. PEGDA monomerleri habercisi jel çözüm içindeki konsantrasyonu(a)değişiklikleri alter hidrojel sertlik. (B) kucak photoinitiator konsantrasyonu artan UV Işınlarına maruz kalma 1 dakika sonra protein işlevi düşürür. (C) artan UV pozlama süresi 2 mM tur işleviyle protein düşürür. Tüm hata çubuklarını temsil eden standart sapması çoğaltır. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55873/55873fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55873/55873fig3.jpg"> 
Şekil 3: Protein desenlendirme için en iyi duruma getirilmiş desen ve hidrojel UV pozlama süreleri. (A) Minimizing UV pozlama kez hidrojel oluşumu için yüzey desenlendirme sağlar. (B) artan UV pozlama süreleri yüzey desenlendirme için desen gücü artar. Ölçek çubukları 200 µm. = <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55873/55873fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55873/55873fig4.jpg"> 
Şekil 4: Endotel hücreleri VEGF desen yanıt. (A)tek tip hydrogels üzerinde tohumlari HUVECs. (B ve C) HUVECs VEGF desen duygusu ve immobilize VEGF doğru göç. Görüntüleri (B) 4 X ve (C) 10 X büyütme tohum sonra iki gün alındı. Ölçek çubukları 500 µm. = HUVEC-DC'de (kırmızı) ve VEGF-488 desen (yeşil) 528/553 ve 465 uyarma ve emisyon filtreleri ile yakalanan edildi/495, anılan sıraya göre.<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_u href=""></a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_u>pload/55873/55873fig4large.jpg"hedef ="_blank"> Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55873/55873table1.jpg"> 
Tablo 1: stok ve jel öncü çözümler hesaplamalarını. Kırmızı bir kutu gibi molekül ağırlığı, kullanıcı tanımlı değerler istenen stok konsantrasyonları ve tartılır-out kitleler gösterir. Mavi kutu kullanıcı tanımlı değerlere göre hesaplanan değerleri temsil eder.

Watch this Scientific Journal Video about Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications at JoVE.com

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Bu yöntemde, photopolymerization kullanıyoruz ve polietilen glikol (PEG) hydrogels, sağlayan yüzeyinde protein veya peptid desen oluşturmak için tıklatın kimya teknikleri biyoaktif sinyaller hücresel yanıt vitro incelenmesi için immobilize .

Biyoaktif proteinler veya peptidler hidrojel Photochemistry biyolojik uygulamalarda kullanarak üzerinde desenlendirme

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

patterning-bioactive-proteins-or-peptides-on-hydrogel-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K Görüntüleme.  Rensselaer Polytechnic Institute. Bu yöntemde, photopolymerization kullanıyoruz ve polietilen glikol (PEG) hydrogels, sağlayan yüzeyinde protein veya peptid desen oluşturmak için tıklatın kimya teknikleri biyoaktif sinyaller hücresel yanıt vitro incelenmesi için immobilize .

Video: Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Biyomühendislik

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large variety of PEG molecular weights and configurations (arm number, arm length, and branching pattern) affords researchers tight control over resulting hydrogel structures and properties, including Young&#8217;s modulus and mesh size. This video will illustrate a rapid, efficient, solvent-free, microwave-assisted method to methacrylate PEG precursors into poly(ethylene glycol) dimethacrylate (PEGDM). This synthetic method provides much-needed starting materials for applications in drug delivery and regenerative medicine. The demonstrated method is superior to traditional methacrylation methods as it is significantly faster and simpler, as well as more economical and environmentally friendly, using smaller amounts of reagents and solvents. We will also demonstrate an adaptation of this technique for on-resin methacrylamide functionalization of peptides. This on-resin method allows the N-terminus of peptides to be functionalized with methacrylamide groups prior to deprotection and cleavage from resin. This allows for selective addition of methacrylamide groups to the N-termini of the peptides while amino acids with reactive side groups (e.g.&#160;primary amine of lysine, primary alcohol of serine, secondary alcohols of threonine, and phenol of tyrosine) remain protected, preventing functionalization at multiple sites. This article will detail common analytical methods (proton Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (;H-NMR) and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight mass spectrometry (MALDI-ToF)) to assess the efficiency of the functionalizations. Common pitfalls and suggested troubleshooting methods will be addressed, as will modifications of the technique which can be used to further tune macromer functionality and resulting hydrogel physical and chemical properties. Use of synthesized products for the formation of hydrogels for drug delivery and cell-material interaction studies will be demonstrated, with particular attention paid to modifying hydrogel composition to affect mesh size, controlling hydrogel stiffness and drug release.

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

This video will illustrate a rapid, efficient method to methacrylate poly(ethylene glycol), enabling chain polymerizations and hydrogel synthesis. It will demonstrate how to similarly introduce methacrylamide functionalities into peptides, detail common analytical methods to assess functionalization efficiency, provide suggestions for troubleshooting and advanced modifications, and demonstrate typical hydrogel characterization techniques.

Mikrodalga destekli Poli işlevselleştirilmesi (etilen glikol) ve zincir polimerizasyonu ve Hidrojel formasyonunda kullanılan On-reçine Peptides

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Kimya

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

Mechanotransduction Cues Etkileri Ayırma için Hidroksi-PAAm Hidrojeller hazırlanması

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe a novel protocol employing the TiO2 photocatalysis to locally alter cell affinity of the substrate surface. For this experiment, a thin TiO2 film was sputter-coated on a glass coverslip, and the TiO2 surface was subsequently modified with an organosilane monolayer derived from octadecyltrichlorosilane (OTS), which inhibits cell adhesion. The sample was immersed in a cell culture medium, and focused UV light was irradiated to an octagonal region. When a neuronal cell line PC12 cells were plated on the sample, cells adhered only on the UV-irradiated area. We further show that this surface modification can also be performed in situ, i.e., even when cells are growing on the substrate. Proper modification of the surface required an extracellular matrix protein collagen to be present in the medium at the time of UV irradiation. The technique presented here can potentially be employed in patterning multiple cell types for constructing coculture systems or to arbitrarily manipulate cells under culture.

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.

TiO kullanarak sulu bir ortamda Proteinler ve Hücreler photopatterning<sub&gt; 2</sub&gt; Photocatalysis

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

Tedavi Uygulamaları için bir alet olarak RGD-fonksiyonelleştirilmiş Hidrojeller Sentezi

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single cell resolution. Current state-of-the-art single cell micropatterning techniques involve soft lithography and micro-contact printing, which is a powerful technology, but requires trained engineering skills and certain facility support in microfabrication. These limitations require a more accessible technique. Here, we describe a simple alternative lithography-free method: stencil-based single cell patterning. We provide step-by-step procedures including stencil design, polyacrylamide hydrogel fabrication, stencil-based protein incorporation, and cell plating and culture. This simple method can be used to pattern an array of as many as 2,000 cells. We demonstrate the patterning of cardiomyocytes derived from single human induced pluripotent stem cells (hiPSC) with distinct cell shapes, from a 1:1 square to a 7:1 adult cardiomyocyte-like rectangle. This stencil-based single cell patterning is lithography-free, technically robust, convenient, inexpensive, and most importantly accessible to those with a limited bioengineering background.

This protocol introduces a lithography-free micropatterning method that is simple and accessible to those with a limited bioengineering background. This method utilizes customized laser-cut stencils to micropattern extracellular matrix proteins in a shape of interest for modulating cell morphologies. The procedure for micropatterning is demonstrated using induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes.

Lazer Kesim Şablonlar Kullanılarak Basit Litografisiz Tek Hücreli Mikrodesenleme

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

Gelişim Biyolojisi

<meta charset="utf8"></head><body> Peptit Hidrojeller: ECF-5'in Çevreye Duyarlı Jelasyonu için Yöntemler

Preparation of Mechanically Stable Self-Assembled Peptides Hydrogels

Peptide hydrogels are highly hydrophilic, three-dimensional network gels formed by the self-assembly of nanofibers or polymers, creating water-locking networks. Their morphology closely resembles that of the extracellular matrix, allowing them to exhibit both the biological functions of peptides and responsive gelation properties. These unique characteristics have led to their extensive application in tissue engineering, three-dimensional cell culture, cancer therapy, regenerative medicine, and other biomedical fields. This article describes three methods for preparing ECF-5 peptide hydrogels using self-assembling peptides with environmentally responsive gelation processes: (1) pH-responsive gelation: varying pH levels induce the protonation or deprotonation of amino acid residues, altering electrostatic interactions between peptide molecules and promoting their self-assembly into hydrogels; (2) Metal ion addition: polyvalent metal ions chelate with negatively charged amino acid residues, acting as bridges between peptides to form a network hydrogel; (3) Solvent exchange: hydrophobic peptides are initially dissolved in non-polar organic solvents and subsequently induce self-assembly into hydrogels upon transitioning to a polar aqueous environment. These methods utilize conventional experimental procedures to facilitate peptide self-assembly into hydrogels. By designing peptide sequences to align with specific gelation-inducing conditions, it is possible to achieve finely tuned micro/nanostructures and biological functions, highlighting the significant potential of peptide hydrogels in the biomedical domain.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spot Işığı: Üstün Biyouyumluluk için Kendi Kendine Birleşen Liflerin ve Peptit Hidrojellerin Üretiminin İyileştirilmesi

This protocol presents three fast and simple preparation methods that use environmental conditions to trigger the self-assembly of peptides into hydrogels. Additionally, the characterization of peptide hydrogels is described, demonstrating that mechanically stable peptide hydrogels can be formed under these straightforward conditions.

Mekanik Olarak Kararlı Kendinden Montajlı Peptitler Hidrojellerin Hazırlanması

Peptide hydrogels are highly hydrophilic, three-dimensional network gels formed by the self-assembly of nanofibers or polymers, creating water-locking ...

Biyoaktif proteinler veya peptidler hidrojel Photochemistry biyolojik uygulamalarda kullanarak üzerinde desenlendirme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

Mikrodalga destekli Poli işlevselleştirilmesi (etilen glikol) ve zincir polimerizasyonu ve Hidrojel formasyonunda kullanılan On-reçine Peptides

Mechanotransduction Cues Etkileri Ayırma için Hidroksi-PAAm Hidrojeller hazırlanması

TiO kullanarak sulu bir ortamda Proteinler ve Hücreler photopatterning

Tedavi Uygulamaları için bir alet olarak RGD-fonksiyonelleştirilmiş Hidrojeller Sentezi

Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Lazer Kesim Şablonlar Kullanılarak Basit Litografisiz Tek Hücreli Mikrodesenleme

Mekanik Olarak Kararlı Kendinden Montajlı Peptitler Hidrojellerin Hazırlanması

Mekanik Olarak Kararlı Kendinden Montajlı Peptitler Hidrojellerin Hazırlanması

Mekanik Olarak Kararlı Kendinden Montajlı Peptitler Hidrojellerin Hazırlanması