Name: quantifying branching density in rat mammary gland whole-mounts using the sholl analysis method
Uploaded: 2017-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method at JoVE.com

Yazarlar, bu yöntemin geçerliliğine katkıda bulunmak için Dr. Michael Easterling&#39;i (Sosyal ve Bilimsel Sistemler, Inc., Durham, NC) ve Dr. Tiago Ferreira&#39;nın (McGill Üniversitesi, Montreal, Quebec, Kanada) daimi olarak çalışmasını onaylamak ister. Sholl uygulamasıyla ilgili yardım.

Bu çalışma için kullanılan tüm hayvan kullanımı ve prosedürleri, NIEHS Laboratuar Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve Laboratuar Hayvan Bakıcılığının akredite edilmiş bir kuruluşunun Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu için bir Kuruluşta yürütülmüştür. 1. Muayene Meme Bezleri <ol><li> Tüm slaytları ksilol geçirmez bir yöntem kullanarak önceden etiketleyin (kalem en iyi sonucu verir). Etiketi korumak için sonuna montaj çözeltisi ile örtün. </li><li> Hayvanı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış yöntemi kullanarak euthanize edin. </li><li> Ötenazi bittikten sonra, hayvanı bir diseksiyon tahtası üzerine sırtına yerleştirin ( Şekil 1 ). Arka kollar ters V (tutma iğneleri veya küçük iğne iğneleri iyi çalışır) ile dört uzuvun tümünü gerin ve pimleyin. </li><li> Saçları meme örneğinden uzak tutmak için karnın% 70 etanol ile bolca püskürtülmesi. </li><li> Forseps kullanarak, orta hatta karın cildi yukarı çekin ve ile küçük bir kesi yapmakMakasla diseksiyon yaparak, peritonun delinmemesine dikkat edin. <ol><li> İnsiziteden başlayarak, cildi boyun bölgesine kadar ve daha sonra ön ekstremiteye kadar kesiniz. Kasıktaki bölgeye kesin ve aynı taraftaki arka eklemin birinci eklemine kadar uzaklaşın; Bu kesi genellikle meme bezlerini 5 ve 6&#39;yı ayırır. Periton kesilmesinden kaçının. </li><li> Makasları kesmenin kör ucunu kullanarak nazikçe peritondan ayıran, forseps kullanarak bağlı meme yağ padi ile cildi geri çekin. Bildiğim kadarıyla dorsal mümkün olduğunca tamamen deri altındaki inguinal meme bezlerinde inci 4. ve 5. ortaya çıkarmak için ayırın; Cildi diseksiyon tahtasına tutturun ( Şekil 2 ). </li><li> Yavaşça kavisli bir forseps yuvarlatılmış yan kenarı ile 5. bezinin meme dokusu kavrayarak yavaşça nick için bezi veya cilt dikkat ederek, deriden uzak bezi kesin. </li><li> Döşeme işlemine devam et,4 ve 5. bezleri tamamen deriden kaldırılana kadar dorsal hareket ettirilmesi. Sholl analizi için başlangıç ​​noktası olarak görev yaptığı için bezin geri kalan kısmı ile emzik bölgesinin kaldırıldığından emin olun. Meme dokusunu, bezine 4 bağlandığı vücudun dışına kesin. </li></ol></li><li> Bez bezden çıkarıldıktan sonra, eşit derecede elektrostatik yüklü, 25 mm x 75 mm x 1 mm mikroskopik bir slayt üzerine serin ve cilde temas ettiği tarafı aşağıya bakacak şekilde yerleştirin. NOT: Yaşlı veya emzikli hayvanların bezleri için 51 x 75 x 1 mm&#39;lik bir kayma gerekebilir. </li><li> Eldiven takarken, hava kabarcıklarını yavaşça sıkıştırın. Bezi bir plastik parafin film ve başka bir mikroskop lamı ile kapatın ve bezi slayta yapıştırmak için sıkıştırın. NOT: Su ile dolu 50 mL&#39;lik konik bir tüp uygun bir ağırlık olarak işlev görür. Sürgüye uymak için gereken süre, bezin kalınlığına bağlıdır. İnce, postnahTal günde (PND) 4 bez en az 30 dakika sıkıştırılmalıdır; kalın, yetişkin bezleri ise 2-5 saat kadar sürebilir. </li></ol> 2. Meme Tam Montajları Hazırlayın <ol><li> Kaynatma ve soğutma gerektiren karmin alum çözeltisini en az 24 saat önceden hazırlayın. <ol><li> Kırmızı alum 1 g damıtılmış su, 500 mL, alüminyum potasyum sülfat, 2.5 g (alk (SO4) 2 • 12H 2 O) çözündürülür ve 1 L&#39;lik bir şişede, 20 dakika daha kaynatılır. Damıtılmış su kullanarak son hacmi 500 mL&#39;ye getirin. </li><li> Çözeltiyi bir vakum altında filtre kağıdından süzün ve saklama için soğutun. NOT: Carmine şap çözeltisi tekrar kullanılabilir ancak renk sönmeye başlarsa atılmalıdır. </li></ol></li><li> Sabitlemeden önce, bezin slayttan çekilmemesine dikkat ederek parafin filmini bezden soyun. Slaytları bir cam sürgü boyama kavanozuna yerleştirin ve fiksatif maddeye (% 100 etan) daldırınOl, kloroform ve glasiyal asetik asit 6: 3: 1 oranda) 12-48 saat süreyle salgılandı ve bezlerin kalınlığına bağlı olarak azaltıldı. </li><li> Sabitleyiciyi boşaltın ve 15 dakika boyunca% 70 etanol bezlerini ıslatın. Etan solüsyonunun 1 / 3&#39;ünü dökerek ve damıtılmış suyla değiştirerek bezlerini yavaş yavaş su haline getirin. 5 dakika boyunca ıslatın. Bu işlemi üç kez tekrarlayın. </li><li> Son durulamadan sonra, tüm etanol / su solüsyonunu boşaltın ve% 100 damıtılmış su ile değiştirin. Bezleri 5 dk bekletin. </li><li> Damıtılmış suyu boşaltın ve bezleri karamin alum çözeltisine batırın. Kalınlığa bağlı olarak bezleri 12-24 saat boyunca boyayın. NOT: Bezler aşırı boyanamaz, ancak çok sayıda yığın boyama zamanı aynı olmalı, böylece boyama yoğunluğu aynı olacaktır. </li><li> Karin alum çözeltisini boşaltın ve salgı bezlerini% 100 damıtılmış suda 30 s yıkayın. Boğazları 15 dakika boyunca% 70 etanol, 15 dakika süreyle% 95 etanol,20 dakika% 100 etanol. </li><li> Kalınlığa bağlı olarak 12-72 saat boyunca ksilende ıslatarak yağ bezlerini temizleyin. NOT: Bezler saydam olmalı (açık) olmalıdır. Herhangi bir opak (beyazımsı) alan kalırsa, yarı saydam oluncaya kadar ksilen ıslanmaya devam edin. Laktasyum veya çok kalın bezler lekelenir ve temizlenirse, bezleri tamamen temizlemek için ksilen bir kez değiştirilmelidir. </li><li> Slaytları, koldan örtmek için yeterli miktarda pipetle bir ksilen esaslı montaj ortamı ile monte edin. Hiçbir hava kabarcıklarının oluşmaması için bir lamel ekleyin. </li><li> Slaytların kurumasına izin verin. Montaj malzemesi kururken, lamelin altına katılır ve ek montaj ortamı eklemek gerekebilir. Ek ortam olmadığında, slaytların tamamen kurumasına izin verin; Bu 2-3 hafta sürebilir. </li><li> Slaytlar tamamen kuruduktan sonra kalan herhangi bir montaj ortamı pamuklu çubukla ve az miktarda ksilenle çıkartılabilir. Kullanmamaya dikkat edinÇok fazla ksilen, bu montaj ortamını eritebilir ve lamelleri gevşetebilir. Bu olur ve hava kabarcıkları lamel altına toplanırsa, lamel ksilen içinde çıkarılmalı ve montaj işlemi tekrar edilmelidir. </li></ol> 3. Analiz için bütünüyle monte edilmiş görüntüleri hazırlayın <ol><li> Makroskop veya diseksiyon mikroskopu ve uygun bir yazılım ile bir dijital kamera kullanarak tüm montajların görüntülerini ( Şekil 3 ) yakalayın. NOT: Tüm glandüler epitel&#39;i yakalayan herhangi bir büyütme seçilebilirken, aynı büyütmede birbiriyle karşılaştırılacak tüm tümüyle monte edilen görüntüleri yakalamak zorunludur. </li><li> ImageJ yazılımını (veya FIJI yazılımı) indirin 6 . </li><li> &quot;Dosya&quot; → &quot;Aç&quot; ı tıklayarak ImageJ&#39;deki mammary tüm montaj resmini açın. Freehand aletini seçin ve glandüler epitel etrafında iz yapın. &quot;Düzenle&quot; yi seçin &amp; #8594; &quot;Dışarıda temizle.&quot; <ol><li> Lenf düğümlerini düğüm etrafında dolaşarak ve Freehand aracını ve &quot;Düzenle&quot; → &quot;Kes&quot; i kullanarak çıkarın. </li></ol></li><li> &quot;Görüntü&quot; → &quot;Renk&quot; → &quot;Kanalları Böl&quot; i seçerek renk kanallarını ayırın. En iyi karşıtlığa sahip kanalı, tipik olarak mavi kanalı seçin. NOT: Bir RGB görüntüsü, o görüntünün kırmızı, yeşil ve mavi bileşenlerinden oluşan bir yığıntan oluşur. Bu eylem, bu bileşenleri üç 8-bit gri tonlamalı görüntülere ayırır. </li><li> Arka planı &quot;İşlem&quot; i seçerek çıkartın → &quot;Arka Planı Çıkart&quot;. İstediğiniz parametreleri seçin ve değişiklikleri önizlemek için &quot;Önizleme&quot; ye tıklayın. NOT: &quot;Çıktı Artır&quot; seçeneği düzgün ve sürekli arka planları kaldırır. Buna ek olarak, kontrast yaratmak için &quot;İşlem&quot; → &quot;Filters&quot; → &quot;Unsharp Mask&quot; kullanılabilir. </li><li> Th biri seçin<html> Aşağıdaki gürültüyü otomatik olarak gidermek için aşağıdaki yöntemleri uygulayın: şekilsizleştirin veya ayıktıkları çıkarın. NOT: ImageJ, otomatik gürültü giderme için üçüncü bir yöntem sunmaktadır: NaN&#39;leri kaldırın. Bununla birlikte, 32-bit görüntüleri kullandığı için NaNs kaldır komutu geçerli değildir ve geçerli yöntem 8-bit görüntüleri kullanmaktadır. <ol><li> &quot;İşlem&quot; → &quot;Gürültü&quot; → &quot;Çalkalama&quot; seçeneklerinden birini tıklayarak despeckle komutunu kullanarak gürültüyü giderebilirsiniz. NOT: Bu, her bir pikseli 3 × 3 mahalledeki medyan değerle değiştiren bir medyan filtre eklemeye eşdeğerdir. </li><li> &quot;İşlem&quot; → &quot;Gürültü&quot; → &quot;Dışarı Unsurları Kaldır&quot; ı seçerek dışlayıcıları kaldır komutunu kullanarak gürültüyü giderme. NOT: Bu işlem bir pikseli medyandan belirli bir değerden (eşik) fazla saparsa, hemen çevredeki piksellerin ortanca ile değiştirir. </li></ol></li><li> Kalan parazitleri manuel olarak çıkarın (Lass = &quot;xfig&quot;&gt; Şekil 4). <ol><li> Orijinal görüntünün bir kopyasını açın ve bunu neyin ve neyin gürültülü olmadığının bir kılavuzu olarak kullanın. Araç çubuğunun en sağındaki çift kırmızı ok düğmesini tıklayın. Çizim Araçları&#39;nı seçin; Çizim Aracı düğmeleri araç çubuğunda görünecektir. </li><li> Silgi aracını tıklayın. Silgi aletini sağ tıklayarak Silgi çapını ayarlayın. Gürültüyü silmek için sol fare tuşunu basılı tutun. NOT: Tek bir silme oturumu geri alınabilir. Sol fare düğmesi serbest bırakıldıktan ve tekrar tıklandıktan sonra, önceki silme işlemi geri alınamaz. </li></ol></li><li> &quot;Görüntü&quot; → &quot;Ayarla&quot; → &quot;Eşik&quot; i seçerek eşiği ayarlayın. Bezin yeterli gösterimi elde edilinceye kadar kaydırıcıları minimum (üst kaydırıcı) ve maksimum (alt kaydırıcı) eşik değerlerini ayarlamak için hareket ettirin. NOT: Eşik değer ayarını yapmak, gri tonlamalı görüntüleri ilgi ve arka plan özelliklerine ayırır.<ol><li> Uygula&#39;ya tıklayın. Gerekirse, 3.6.1 ve 3.6.2 adımlarını takip ederek bu noktada ek gürültüyü giderin. </li></ol></li><li> Glandüler epitelin eşik değerler ve gürültü giderme ile çıkarılan bölümlerini yeniden yapılandırın ( Şekil 5 ). <ol><li> Orijinal imajın bütünlüğünü korumak için görüntü yeniden yapılandırmayı dikkatlice ve en az düzeyde gerçekleştirin. Epitel nedir ve neyin olmadığı konusunda bir referans için orijinal görüntüye bakın. </li><li> Püskürtme Can aracı (Çizim Araçları araç çubuğunda) üzerine tıklayın. Püskürtme Cihazı alet düğmesine sağ tıklayarak püskürtme çapını ve hızını ayarlayın. Sol fare düğmesini tıklayarak veya basılı tutarak bezin eksik bölümlerini dikkatlice doldurun. </li></ol></li><li> Sholl Analizini gerçekleştirmek için bezin iskelet görüntüsünü oluşturun. Eşleştirilmiş görüntünün ikili olduğundan emin olun &quot;İşlem&quot; → &quot;İkili&quot; → &quot;B Yap<html> inary.&quot; <ol><li> Resim siyah bir zeminde beyaz ise, &quot;İşlem&quot; → &quot;İkili&quot; → &quot;Seçenekler&quot; i seçin ve &quot;Siyah Arka Plan&quot; ı işaretini kaldırın. &quot;İşlem&quot; → &quot;İkili&quot; → &quot;İskelet haline getir&quot; i seçerek görüntüyü iskelet haline getirin. NOT: Bu, art arda pikselleri, tek piksel genişliğine sahip bir şekle indirilinceye kadar ikili görüntünün kenarlarından kaldırır. </li><li> &quot;İşlem&quot; → &quot;İkili&quot; → &quot;Dilate&quot; seçeneklerini seçerek görüntüyü bir kez genişletin. NOT: Bu, ikili görüntülerin kenarlarına piksel ekleyerek eşik değerleme ve iskelet oluşturmayla oluşan boşlukları doldurur. </li></ol></li><li> &quot;Dosya&quot; → &quot;Farklı Kaydet&quot; i seçerek görüntüyü kaydedin. Bir resim türü seçin (genellikle jpeg), dosya adını girin ve &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li><li> İskeletlenmiş görüntünün orijinal resmin üzerine bindirilerek doğruluğunu kontrol edin (Ass = &quot;xfig&quot;&gt; Şekil 6). <ol><li> Hem orijinal resmi hem de iskeletlenmiş görüntüyü açarak bir kaplama oluşturun. &quot;Görüntü&quot; → &quot;Yer paylaşımı&quot; → &quot;Resim Ekle&quot; seçeneğini seçin. &quot;Resim Ekle&quot; iletişim kutusunda, &quot;Eklenecek Görüntü&quot; açılır menüsünden iskelet görüntüsünü seçin ve opaklığı% 30 olarak ayarlayın. </li><li> &quot;Dosya&quot; → &quot;Farklı Kaydet&quot; i seçerek orijinal üzerine yerleştirilen iskelet görüntüsünün görüntüsünü kaydedin. Bir resim türü seçin, dosya adını girin ve &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li></ol></li></ol> 4. Sholl Analizinin Uygulanması <ol><li> Bir iskelet görüntüsü açın ve &quot;İşlem&quot; → &quot;İkili&quot; → &quot;İkili Yap&quot; seçerek görüntü ikili yapın. <ol><li> Büyütme ölçeğini ayarlamadan önce, görüntülerin çekildiği büyütme için bir mikrometre kullanarak piksel / mm sayısını ölçün. </li><li> Ölçülen büyütme s&quot;Analyze&quot; (Analize Et) → Set Scale (Ölçeği Ayarla) seçeneklerini kullanarak seçiminizi yapın. Piksel / mm sayısını girin. &quot;Bilinen Uzaklık&quot; ve &quot;Piksel Boy Oranı&quot; nı her ikisine de 1&#39;e ayarlayın. &quot;Uzunluk Birimi&quot; için &quot;mm&quot; yazın ve &quot;Küresel&quot; seçeneğini işaretleyin (her görüntü için aynı ölçeği korur). </li></ol></li><li> Birincil kanalın başlangıcından (analiz merkezi) glandüler epitelyumun en uzak noktasına bir çizgi çizerek Sholl analizi için bitiş yarıçapını (yarıçap çevresi) belirleyin ( Şekil 7 ). <ol><li> Çıktı noktaları arasında bir çizgi çizmek için araç çubuğundaki çizgi çizim aracını kullanın. Bir ölçüm yapmak için &quot;M&quot; tuşuna basın ve bir sonuç penceresi açılacağını unutmayın. NOT: &quot;Uzunluk&quot; sütunundaki değer çizginin mm cinsinden uzunluğudur. Bu değer, Sholl parametrelerini ayarlarken Bitiş Yarıçapı olarak otomatik olarak girilir. Sholl eklentisi başlangıç ​​noktasını kullanacakÇizgisinin merkezi halkaların merkezi olarak görülmesi. </li></ol></li><li> Sholl Analizini Çalıştırmak. <ol><li> Analizleri &quot;Eklentiler&quot; &quot;Gelişmiş Sholl Analizi;&quot; seçeneğini seçerek çalıştırın. Bir parametre penceresi belirecektir. </li><li> Başlama Yarıçapını &quot;I. Kabukların Tanımı&quot; ndan 0.00 mm&#39;ye ayarlayın; Adım 4.2&#39;de ölçülen çizginin uzunluğu &quot;Sonlandırma Yarıçapı&quot; olarak otomatik olarak girilir. </li><li> &quot;Radius Step Size&quot; &#39;yi 0.1 mm olarak ayarlayın. NOT: Yarıçap basamağı boyutu, çalma sayısını belirler (etkin olarak yineleme sayısı); Daha küçük bir adım boyutu halka sayısını artıracak, daha büyük bir adım boyutu halka sayısını azaltacaktır. Çok küçük bir yarıçapa gereksiz yere fazla sayıda halka gelmesine rağmen, yarıçap çok küçük ayarlanamaz. Bununla birlikte, çok fazla ayarlanabilir, bu daha az zil sesi oluşturacak ve ardından gerçek kesişim sayısını hafife alacaktır. Stanko ve ark.(2015) adım boyutunun belirlenmesi hakkında daha fazla bilgi için. </li><li> &quot;II. Her Radius İçin Birden Çok Örnek&quot; bölümünde &quot;# Örnekler&quot; i &quot;1&quot; ve &quot;Bütünleştirme&quot; yı &quot;Ortalama&quot; olarak ayarlayın. </li><li> &quot;Kapanış yarıçapı kesilmesi&quot; ni 1 olarak ayarlayın ve &quot;III. Tanımlayıcılar ve Eğri Bağlantı&quot; daki &quot;# Birincil dallar&quot; için &quot;başlangıç ​​yarıçapından çıkarsama&quot; nı kontrol edin. NOT: &quot;Profil ve tanımlayıcı hesapla&quot; ve &quot;Dayanım detaylarını göster&quot; istenen şekilde kontrol edilebilir. </li><li> &quot;Doğrusal Olmayan Profillerde&quot; &quot;Doğrusal&quot; yı kontrol edin ve &quot;En uygun derece&quot; seçeneğini seçin; &quot;En bilgilendirici&quot; seçeneğini işaretleyin. &quot;IV.Soll Yöntemleri&quot; nde &quot;Normalleştirilmiş Profiller İçin Alan&quot; ı seçin. </li><li> Kavsakların ısı haritasını oluşturmak için &quot;V. Çıktı seçenekleri&quot; nde &quot;Kesişme Noktası Maskesi Oluşturma&quot; yı kontrol edin (isteğe bağlı). </li><li> Bölgeyi doğrulamak için halkalı görüntülerin önizleme penceresi oluşturmak için &quot;Cf. Segmentation&quot; a tıklayın.Analiz. </li></ol></li><li> Analizi çalıştırmak için &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li></ol> 5. ÇÇA&#39;nın ölçülmesi <ol><li> Epitelyal ağacın etrafındaki en kısa mesafeyi izleyerek MEA&#39;yı ölçün ( Şekil 8 ). <ol><li> ImageJ&#39;de, bezin iskelet görüntüsü açıkken, Çokgen aracını tıklatın. Poligonu başlatmak, bezin çevresini dolaşmak ve bir çizgi parçası eklemek için tıklamak için epitel ağacının çevresindeki bir noktayı tıklayın. </li><li> Epitel bölgesinin tamamı engellendiğinde, çokgeni kapatmak için çift tıklayın. Bir sonuç penceresi açmak için &quot;M&quot; tuşuna basın; &quot;Alan&quot; sütunundaki değer MEA&#39;dır. </li></ol></li><li> Glandüler epitelin lenf düğümünün ötesine geçtiği durumlarda, dallanma yoğunluğunu hesaplarken lenf nodu alanını (LNA) MEA&#39;dan çıkarın. <ol><li> Aynı adamdaki lenf nodunu izleyerek LNA&#39;yı ölçünEr epitel ağacı olarak ve &quot;M&quot; basarak. NOT: Bu durumlarda LNA, MEA&#39;dan çıkartılmalıdır, çünkü lenf düğümü analizin LNA içindeki kesişim noktalarını saymasını engeller. Epitel lenf düğümüne ulaşmadığında LNA sıfırdır. </li></ol></li></ol> 6. Raporlama Verileri <ol><li> Çevreleyen yarıçap, MEA, N, k ve dallanma yoğunluğu için rapor değerleri. NOT: Çevreleyen yarıçap adım 4.2&#39;de belirlenir ve MEA adım 5.1&#39;de belirlenir. <ol><li> Bir Sholl sonuçları penceresi oluşturmak için analizi çalıştırın. NOT: Bildirilen N toplam kesişim değeridür. Bildirilen k , Sholl gerileme katsayısının (yarı log) değeridır. Sholl analizi, glandüler epitelyumun herhangi bir ölçülen bölgesi üzerinden k değeri döndürür. Tam epitel üzerinden k için doğru bir değer elde etmek için duktal uçlar bulunmalıdır. </li><li> Değiştir değiştirE Dallanma yoğunluğunu (bu yöntemin temel bitiş noktası) hesaplamak için N için çıkış değerini kullanarak meme bezi için Sholl analizi. Dallanma yoğunluğunu N / (MEA-LNA) formülü kullanarak hesaplayın ve değeri N / mm 2 olarak kaydedin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sholl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+organization+of+the+neurons+in+the+visual+and+motor+cortices+of+the+cat.">Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat.</a> J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).</li><li>Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+receptor+1A+modulates+actin+dynamics+and+restricts+dendritic+growth+in+hippocampal+neurons.">Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons.</a> Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).</li><li>Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Sholl+analysis+to+quantify+changes+in+growth+and+development+in+rat+mammary+gland+whole+mounts.">Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts.</a> Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).</li><li>Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Mammary+Gland+Morphology+and+Breast+Cancer+Risk+in+Rats.">Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats.</a> J. Vis. Exp. (44), e2260 (2010).</li><li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Mammary+Gland+Development+and+Function+in+Mouse+Models.">Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models.</a> J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).</li><li>ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html</a> (2012)</li><li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+High-quality+Hematoxylin+and+Eosin-stained+Sections+from+Rodent+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Histopathologic+Review.">Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review.</a> Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).</li><li>Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+abnormalities+in+the+rat+mammary+gland+following+gestational+and+lactational+exposure+to+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+(TCDD).">Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD).</a> Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).</li><li>Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+gland+ductal+hyperplasias+and+carcinoma+in+situ+following+fetal+bisphenol+A+exposure.">Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure.</a> Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).</li><li>Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+exposure+to+butyl+benzyl+phthalate+induces+modifications+in+the+morphology+and+the+gene+expression+profile+of+the+mammary+gland:+an+experimental+study+in+rats.">In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats.</a> Environ Health. 10 (1), 5 (2011).</li><li>Johnson, M. D., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+multiphoton+imaging+of+fresh+and+whole+mount+developing+mouse+mammary+glands.">Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands.</a> BMC Cancer. 13, 373 (2013).</li><li>Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+gland+development+as+a+sensitive+end+point+after+acute+prenatal+exposure+to+an+atrazine+metabolite+mixture+in+female+Long-Evans+rats.">Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats.</a> Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).</li><li>Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+mammary+gland+development+in+female+Long+Evans+rats+following+in+utero+exposure+to+atrazine.">Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine.</a> Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).</li><li>Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+ethinyl+oestradiol+alters+mammary+gland+development+in+male+and+female+Wistar+rats.">Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats.</a> Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Doğumdan puberteye kadar, meme bezi büyümesi allometriktir. Ergenlikten sonra meme bezi, geniş yalın dallanma ve uzama yoluyla gelişir ve meme epiteli tüm yağ yastığını kapayana kadar devam eder. Dallanma özellikleri, meme bezi gelişiminin önemli bir yönüdür ve bu özellikleri objektif olarak ölçebilme özelliği, normal meme gelişimini değerlendirmede ve meme zehirlenmelerine erken yaşlanma maruziyetlerini takiben anormal gelişimin belirlenmesinde son derece yararlı olabilir. <p class="jove...

Meme bezi dallanma, bez gelişiminin bir göstergesi olarak yaygın olarak değerlendirilen bir özelliktir, ancak objektif olarak nicelik kazanmak zordur. 1953 yılında, Sholl 1 kedi görsel ve motor korteks nöronal dendritik arborization ölçülmesi için bir yöntem tarif edilmiştir ve bu yöntem için bir eklenti Ferriera ve arkadaşları 2 tarafından geliştirilmiştir. Hem nöronlar hem de meme bezleri benzer ağaç benzeri bir yapı sergilediğinden eklenti, peripubertal sıçan meme bezinin 2D görüntülerinde meme epitelyal dallanma yoğunluğunu belirlemek için kullanılmıştır. Peripubertal evre analiz için seçilmiştir, çünkü sütten kesme akademik laboratuvarlarda ve test kılavuz çalışmalarında değerlendirilen bir yaşam evresidir. Sholl analizi, ek eklentileri içeren, açık kaynak görüntü işleme paketi ImageJP olan FIJI ile dağıtılan bir eklentidir. Eklenti, bir predefin çevresini saran konsantrik halkalar dizisi oluşturur(Tipik olarak bir nöronun soma ya da bir meme bezinin birincil kanalının kaynağı) ve nesnenin en uzaktaki kısmına (çevreleyen yarıçap) uzanan bir bölgedir. Ardından halkaların her birinde oluşan kesişme sayısını (N) sayar. Eklenti ayrıca, epitel dallanmasının bozulma hızının bir ölçüsü olan bir Sholl geri dönüşüm katsayısı ( k ) döndürür. ImageJ kullanılarak, bir meme bezinin tümüyle monte edildiği bir iskelet görüntüsü oluşturulur ve meme epitelyal alanı (MEA) ölçülür. Görüntü, Sholl analizi eklentisi kullanılarak analiz edilir ve burada kullanılmayan diğer değerler arasında N ve k için değerler iade edilir. Göğüs epitelyal dallanma yoğunluğu N / MEA hesaplanarak belirlenir. Dallanma, glandüler epitelin dış bölgelerinde ne kadar devam ettiği dallanma karmaşıklığına eşittir ve üniform distal epitel büyümesinin bir göstergesidir. K , epiteki distal azalmanın bir ölçütüdürDallanma karmaşıklığının etkili bir ölçümüdür ve meme gelişiminin güvenilir bir göstergesidir. Bu protokol, peripubertal erkek ve dişi sıçanlarda, meme bezi tüm montajlarının iskelet görüntülerini oluşturmak ve meme dallanma özelliklerini kantitatif olarak değerlendirmek için bilgisayar destekli bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yöntem nispeten hızlıdır ve özel mikroskopi ekipmanı kullanılmasını gerektirmez. Bu yöntemin geliştirilmesi ve geçerliliği Stanko ve ark. (2015) 3 . Bu rapor aynı zamanda sıçan meme bezi bütününün hazırlanışını anlatıyor = bağlar. Benzer meme tüm montaj prosedürleri, Assis ve ark. (2010) 4 ve Plante ve ark. (2011) 5 .

<table><tbody><tr><td>Dissecting board</td><td>NA</td><td>NA</td><td>A piece of styrofoam roughly 10&quot;x12&quot; is suitable.</td></tr><tr><td>Dissecting T-Pins</td><td>Daigger</td><td>EF7419A</td><td></td></tr><tr><td>Spray bottle with ethanol</td><td>NA</td><td>NA</td><td>70% ethanol is suitable.</td></tr><tr><td>Curved dissecting scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14569-09</td><td></td></tr><tr><td>Straight dissecing scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-12</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 24 x 75 x 1 mm microscope slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td>Thermo Scientific Superfrost Plus &amp;amp; Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance.&lt;br/&gt; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Cover Glass 24 x 60 x 1 mm</td><td>Fisher scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td>Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film</td><td>Fisher scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute, &amp;ge;99.8% (GC)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24102</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Carmine alum&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum potassium sulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6435</td><td></td></tr><tr><td>Permount mounting media</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15</td><td></td></tr><tr><td>Macroscope</td><td>Leica</td><td>Z16 APO&amp;nbsp;</td><td>This is the image capturing hardware and software used in this laboratory.&amp;nbsp; As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories.</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Leica</td><td>DFC295</td><td></td></tr><tr><td>Camera software</td><td>Leica</td><td>Leica Application Suite v3.1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>Open source</td><td>http://imagej.net/Welcome</td><td></td></tr><tr><td>Sholl analysis&amp;nbsp;</td><td>Open source</td><td>http://imagej.net/Sholl_Analysis</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying branching density in rat mammary gland whole-mounts using the sholl analysis method

Artan sayıdaki çalışmalar kemirgen meme bezini bir kimyasal maruziyetin gelişimsel toksisitesini değerlendirmek için bir son nokta olarak kullanmaktadır. Bu maruziyetlerin meme bezi gelişimine olan etkileri tipik olarak ya basit boyutlu ölçümler kullanılarak ya da morfolojik özellikleri puanlayarak değerlendirilir. Bununla birlikte, gelişimsel değişiklikleri yorumlama yöntemleri geniş kapsamlı laboratuarlarda tutarsız çevirilere yol açabilir. Yaygın bir değerlendirme yöntemi gereklidir; böylece, verilerin araştırmalar arasında karşılaştırılmasından uygun yorumlamalar oluşturulabilir. Bu çalışmada meme bezi dallanma özelliklerini belirlemek için Sholl analizi yöntemi uygulanmıştır. Sholl yöntemi başlangıçta nöronal dendritik kalıpların nicelleştirilmesinde kullanılmak üzere geliştirildi. ImageJ, bir açık kaynak görüntü analiz yazılım paketi ve bu analiz için geliştirilmiş bir eklenti kullanarak, meme bezi dallanma yoğunluğu ve ameliyatın karmaşıklığıPeripubertal dişi bir sıçandan meme bezi tespit edildi. Burada açıklanan yöntemler Sholl analizinin, meme bezi gelişiminin önemli bir özelliğinin nicelenmesinde etkili bir araç olarak kullanılmasını sağlayacaktır.

Ölçülen kapalı yarıçap, MEA, N, k için değerler ve bu protokolde analiz edilen meme bezi için hesaplanan dallanma yoğunluğu Tablo 1&#39;de gösterilmektedir . Sholl analizi, her yarıçaptaki kesişim sayısının doğrusal ve yarı-loglu grafikler oluşturur ( Şekil 9 ) ve eğer seçilirse, kesişimlerin bir ısı haritasını oluşturur ( Şekil 10 ). Az gelişmiş bezler aynı MEA içeris...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method at JoVE.com

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

Kemirgen içindeki meme bezi gelişimi tipik olarak tanımlayıcı değerlendirmeler kullanılarak veya temel fiziksel özellikleri ölçerek değerlendirilmiştir. Dallanma yoğunluğu, meme gelişiminin objektif olarak ölçülmesi güç bir göstergesidir. Bu protokol, meme bezi dallanma özelliklerinin niceliksel değerlendirmesi için güvenilir bir yöntem tanımlamaktadır.

Sıçan Memesi Bezinde Dallanma Yoğunluğunun Nicelleştirilmesi Sholl Analiz Yöntemini Kullanarak Bütünüyle Tutturulur

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

quantifying-branching-density-rat-mammary-gland-whole-mounts-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.2K Görüntüleme.  National Institute of Environmental Health Sciences.  Kemirgen içindeki meme bezi gelişimi tipik olarak tanımlayıcı değerlendirmeler kullanılarak veya temel fiziksel özellikleri ölçerek değerlendirilmiştir. Dallanma yoğunluğu, meme gelişiminin objektif olarak ölçülmesi güç bir göstergesidir. Bu protokol, meme bezi dallanma özelliklerinin niceliksel değerlendirmesi için güvenilir bir yöntem tanımlamaktadır. 

Video: Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and genetic alterations. Mammary gland whole mounts are an inexpensive method to capture the progression of morphological changes that may arise after exposure. However, in later life, when abnormalities are more prone to develop, sole reliance on this one method may not always provide enough information to make a proper diagnosis of the abnormality. Historically, in chemical test guideline studies, a single mammary gland is removed at necropsy and prepared as a hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained section. The incorporation of contralateral mammary whole-mount collection and analysis decreases the likelihood of a false-negative assessment. Evaluation of the whole mount is limited by the presence of one or two entire mammary glands on a slide, and in some cases, the abnormalities observed in the whole mount are not uniformly represented in the H&#38;E section.&#160; The goal of this study was to develop a protocol for converting coverslipped mammary whole mounts to H&#38;E-stained sections so that lesions that would otherwise have been missed or that are difficult to diagnose can be identified. Here, we detail a method to produce a high-quality, paraffin-embedded H&#38;E section from a mammary gland that was initially prepared as a whole mount. In comparison to a tissue that was intentionally prepared for H&#38;E sectioning, the whole mount requires additional preparation for tissue removal and processing. However, this method is considered inexpensive, as it requires common lab reagents and little additional time. As a result, this method can provide invaluable information on how chemical and environmental exposures alter normal mammary development, as well as display changes that occur because of genetic modifications.

We developed a method to successfully remove, process, section, and stain, for histopathological evaluation, mammary tissue that had originally been fixed on slides as whole mounts. This method may promote the collection and evaluation of mammary gland whole mounts in reproductive and developmental test guideline studies.

Lezyon Tanımlaması için Meme Bandı Bütün Dağılımları

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Kanser Araştırmaları

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary epithelium using transplantation techniques takes advantage of the hormonal environment provided by the adolescent rodent host. These studies are ideally suited to explore the impact of various biological manipulations on mammary gland development and dissect many aspects of mammary gland biology. A common, but limiting, feature is that transplanted epithelial cells are strongly influenced by the surrounding stroma and outcompeted by endogenous epithelium; to utilize native mammary tissue, the abdominal-inguinal white fat pad must be cleared to remove host mammary epithelium prior to the transplantation. A major obstacle when using the rat model organism is that clearing the developing mammary tree in post-weaned rats is not efficient. When transplanted into gland-free fat pads, donor epithelial cells can repopulate the cleared host fat pad and form a functional mammary gland. The interscapular fat pad is an alternative location for these grafts. A major advantage is that it lacks ductal structures yet provides the normal stroma that is necessary to promote epithelial outgrowth and is easily accessible in the rat. Another major advantage of this technique is that it is minimally invasive, because it eliminates the need to cauterize and remove the growing endogenous mammary tree. Additionally, the interscapular fat pad contains a medial blood vessel that can be used to separate sites for grafting. Because the endogenous glands remain intact, this technique can also be used for studies comparing the endogenous mammary gland to the transplanted gland. This paper describes the method of mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad of rats.

This article describes a transplantation method to graft donor rat mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of recipient animals. This method can be used to examine host and/or donor effects on mammary epithelium development and eliminates the need for pre-clearing, thereby extending the usefulness of this technique.

Interscapular Beyaz Yağ Ped içine Rat Mammary Epitel Hücre Nakli

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These interactions are provided by junctional proteins that form nexuses between adjacent cells. Junctional protein mislocalization and reduced physical associations with their binding partners can result in the loss of function and, consequently, to organ dysfunction. Thus, identifying protein localization and protein-protein interactions (PPIs) in normal and disease-related tissues is essential to finding new evidences and mechanisms leading to the progression of diseases or alterations in developmental status. This manuscript presents a two-step method to evaluate PPIs in murine mammary glands. In protocol section 1, a method to perform co-immunofluorescence (co-IF) using antibodies raised against the proteins of interest, followed by secondary antibodies labeled with fluorochromes, is described. Although co-IF allows for the demonstration of the proximity of the proteins, it does make it possible to study their physical interactions. Therefore, a detailed protocol for co-immunoprecipitation (co-IP) is provided in protocol section 2. This method is used to determine the physical interactions between proteins, without confirming whether these interactions are direct or indirect. In the last few years, co-IF and co-IP techniques have demonstrated that certain components of intercellular junctions co-localize and interact together, creating stage-dependent junctional nexuses that vary during mammary gland development.

Intercellular junctions are requisites for mammary gland stage-specific functions and development. This manuscript provides a detailed protocol for the study of protein-protein interactions (PPIs) and co-localization using murine mammary glands. These techniques allow for the investigation of the dynamics of the physical association between intercellular junctions at different developmental stages.

Murin Makat Boğazlarında Gap, Sıkı ve Aderans Bağlantılarının Bileşenleri Arasındaki Protein-Protein Etkileşimlerinin ve Ortak Lokalizasyon Analizleri

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

Gelişim Biyolojisi

Intraductal Delivery and X-ray Visualization of Ethanol-Based Ablative Solution for Prevention and Local Treatment of Breast Cancer in Mouse Models

Breast cancer is the most prevalent cancer and the second-leading cause of cancer-related death for women in the USA. For high-risk women, prophylactic mastectomy is the most effective primary prevention strategy. Prophylactic mastectomy is an aggressive surgical procedure that completely removes the mammary epithelial cells from which breast cancer arises along with the surrounding tissue. We seek to develop a minimally invasive intraductal procedure as an alternative to prophylactic mastectomy to locally ablate the mammary epithelial cells before they can become malignant. We and others have developed an intraductal delivery procedure to reach and treat these epithelial cells in rodent models of breast cancer. While the mouse mammary gland with a single non-anastomosed ductal tree opening at the nipple has a much less complex and tortuous architecture than the human breast, chemically induced and genetically engineered mouse models of breast cancer are valuable to produce proof-of-concept studies of new preventative strategies. Here, we describe a procedure for intraductal delivery of an ethanol-based ablative solution containing micro-CT/X-ray tantalum-based contrast agent within the mouse mammary ductal tree for the therapeutic purpose of primary prevention of breast cancer. Intraductal delivery of aqueous reagents (e.g., cytotoxic compounds, siRNAs, AdCre) has been previously described in mouse models. Thus, we focus our protocol description on methodological modifications and unique experimental considerations for optimizing delivery of ethanol, for minimizing local and systemic side effects of ethanol administration, and for in vivo visualization of ductal tree filling via micro-CT/fluoroscopy imaging. Visualization of the ductal tree immediately after injection of a contrast-containing solution allows for confirmation of complete filling or unsuccessful outcomes such as underfilling or overfilling. This procedure can be applied for delivery and imaging of other ablative compounds aimed at either preventing tumor formation or locally treating early-stage tumors accessible via the ductal tree.

A method of intraductal injection of reagents for an ethanol-based ablative solution to the mouse mammary ductal tree for in vivo imaging and breast cancer prevention is described. Injection directly into the nipple opening allows for targeting mammary epithelial cells with minimal collateral tissue damage.

Fare Modellerinde Meme Kanserinin Önlenmesi ve Lokal Tedavisi için Etanol Bazlı Ablatif Çözümün İntradüktal Doğumu ve Röntgen Görselleştirmesi

Breast cancer is the most prevalent cancer and the second-leading cause of cancer-related death for women in the USA. For high-risk women, prophylactic ...

X-Ray Visualization of Intraductal Ethanol-Based Ablative Treatment for Prevention of Breast Cancer in Rat Models

There are still a limited number of primary interventions for prevention of breast cancer. For women at a high risk of developing breast cancer, the most effective intervention is prophylactic mastectomy. This is a drastic surgical procedure in which the mammary epithelial cells that can give rise to breast cancer are completely removed along with the surrounding tissue. The goal of this protocol is to demonstrate the feasibility of a minimally invasive intraductal procedure that could become a new primary intervention for breast cancer prevention. This local procedure would preferentially ablate mammary epithelial cells before they can become malignant. Intraductal methods to deliver solutions directly to these epithelial cells in rodent models of breast cancer have been developed at Michigan State University and elsewhere. The rat mammary gland consists of a single ductal tree that has a simpler and more linear architecture compared to the human breast. However, chemically induced rat models of breast cancer offer valuable tools for proof-of-concept studies of new preventive interventions and scalability from mouse models to humans. Here, a procedure for intraductal delivery of an ethanol-based ablative solution containing tantalum oxide nanoparticles as X-ray contrast agent and ethyl cellulose as gelling agent into the rat mammary ductal tree is described. Delivery of aqueous reagents (e.g., cytotoxic compounds, siRNAs, AdCre) by intraductal injection has been described previously in mouse and rat models. This protocol description emphasizes methodological changes and steps that pertain uniquely to delivering an ablative solution, formulation consideration to minimize local and systemic side effects of the ablative solution, and X-ray imaging for in vivo assessment of ductal tree filling. Fluoroscopy and micro-CT techniques enable to determine the success of ablative solution delivery and the extent of ductal tree filling thanks to compatibility with the tantalum-containing contrast agent.

A procedure for the delivery of a chemical ablative solution to the rat mammary ductal tree for image-guided preventive treatment of breast cancer is described. Mammary epithelial cells can be targeted with minimal collateral tissue damage through cannulation directly into the nipple opening and intraductal infusion of a 70% ethanol-based ablative solution.

Sıçan Modellerinde Meme Kanserinin Önlenmesi için İntraduktal Etanol Bazlı Ablatif Tedavinin X-Ray Görselleştirmesi

There are still a limited number of primary interventions for prevention of breast cancer. For women at a high risk of developing breast cancer, the most ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Sıçanlarda Meme Bezi Morfolojisi ve Meme Kanseri Riski değişiklikler

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Biyoloji

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

3-Boyutlu Histoloji hacmi ve Fare meme bezlerinin Eğitim için onun Uygulama İmar

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Sağlam, Bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi Morfoloji analizi için

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in combination with skin flap surgery or implantation of imaging windows has been used to study the dynamics of the healthy mammary gland at different developmental stages. Most mammary imaging technologies are limited to a time frame of hours to days, whereas the majority of mammary gland remodeling processes occur in time frames of days to weeks. To study mammary gland remodeling, methods that allow optical access to the tissue of interest for extended time frames are required. Here, an improved version of the titanium mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW) is described that allows high-resolution imaging of the mammary gland with a cellular resolution for up to several weeks. Importantly, the R.MIW provides tissue access over the entire duration of the intravital imaging experiment and could therefore be used for local tissue manipulation, labeling, drug administration, or image-guided microdissection. Taken together, the R.MIW enables high-resolution characterization of the cellular dynamics during mammary gland development, homeostasis, and disease.

This protocol describes a novel mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW). Intravital microscopy after implantation of the R.MIW allows for longitudinal and multi-day imaging of the healthy and diseased mammary gland with a cellular resolution during the different developmental stages.

Değiştirilebilir Kapaklı Meme Görüntüleme Penceresi Kullanarak Boyuna İntravital Mikroskopi

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>Meme bezinin intravital hücre altı mikroskobu

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

Meme bezinin intravital hücre altı mikroskobu

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...