Name: multimer-page: a method for capturing and resolving protein complexes in biological samples
Uploaded: 2017-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples at JoVE.com

NIH / NİDA DA034783 tarafından desteklenir. Biz multimeir-PAGE ile teknik yardım için Bryan A. Killinger teşekkür ederim.

1. Doku Hazırlanması <ol><li> 4x BN-PAGE numune tampon maddesi (200 mM Bis (2-hidroksietil) amino-tris (hidroksimetil) metan (Bis-Tris), 200 mM NaCI,% 40 a / h gliserol,% 0.004 Ponceau S, pH 7.2, 10 mL hazırlanması ). NOT: Bu stok solüsyon önceden yapılmış ve 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> 1x ticari proteaz inhibitörü kokteyli içeren 750 uL dH 2 O 4x numune tamponu 250 uL seyreltin. Girdap ve buz üzerinde soğuk. </li><li> Temiz bir Dounce homojenleştirici 30 vuruş 1 mL 1x buz soğukluğunda BN-PAGE numune tampon maddesi içinde, hedef doku, 20 mg homojenize edilir. NOT: Bu gösteri deneme için, hedef doku bütün sıçan beyni dokudur. Homojenleştirmeden sonra, numuneler çözünür ve zar proteinlerinin elektroforezi izin vermek üzere hafif bir deterjan gibi% 2 digitonin ile muamele edilebilir. </li><li> 30 dakika çözünmeyen hücre içeriği: pelet 14,000 x g&#39;de bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne Homojenat, ve santrifüj aktarın. AfteR santrifüj, buz üzerinde temiz bir tüp içine süpernatant süzün. </li><li> bisinkoninik asit (BCA) ya da benzer protein kantitatif analizi kullanılarak Üst faz, protein konsantrasyonunu ölçmek için üretici talimatları takip edin. </li><li> Homojenat örnek (ler) deterjan ihtiva ise,% 0.25 Coomassie için homojenat çözüm getirmek için yeterli bir sulu çözelti içinde% 5, Coomassie Mavi G-250, bir miktar ilave edin. </li></ol> 2. BN-PAGE <ol><li> 25 ml 20x mavi yerli seyreltin (BN) içine tampon stok (1.0 M Bis-Tris, 1.0 M Trişin, pH 6.8) elektroforez 475 ml dH 1x çalışan tampon 500 mL olmak üzere% 0.002 Coomassie Blue ihtiva eden 2 O. <ol><li> Numuneler deterjan ihtiva bunun yerine% 0.02 Coomassie içeren 1x çalışan tampon 250 mL ve hiçbiri içeren başka bir 250 mL olun. </li></ol></li><li> 4 ° C&#39;ye soğutma tamponu (ler). </li><li> Temizleyin ve üretici talimatlarına göre kaset dökme bir poliakrilamid jel toplayın. </li><li&gt; Bir standart tarif 7&#39;ye göre BN poliakrilamid jeli (% 3, T istifleme katman,% 6, T çözme tabakası) dökün ve iyi tarak. </li><li> Jeller polimerize sonra, DH 2 O ile kaseti yıkayın ve üretici talimatlarına göre elektroforez aygıtı monte edin. </li><li> Kuyucuklu bir tarak çıkarın ve 1x BN-PAGE çalışma tamponu ile kuyu doldurun. Numuneler yüklenene kadar tampon ile bütün iç odasının doldurulması kaçının. <ol><li> Numuneler deterjan ihtiva ise,% 0.02 Coomassie Blue içeren tampon ile kuyu doldurun. NOT: 4 ° C&#39;de adımları 2.7-2.9 gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Jel yükleme ipuçları kullanarak, arzu edilen kuyulara proteinin 20 ug içeren homojenat bir hacim pipetle. kullanılmayan herhangi bir kuyulara 1x BN-PAGE numune tampon maddesi eşdeğer bir hacmi Pipet. Not: eklemek için homojenat uygun hacmi hesaplamak için bir BCA aracıyla tespit protein konsantrasyonunu kullanmakuyu. </li><li> Örnekler yüklendikten sonra, 1 x BN-PAGE çalışma tamponu ile iç bölmeyi doldurmak. Jel tamamen tampon altında olduğundan emin olun. Daha sonra, üretici tarafından belirtilen seviyeye 1x çalışma tamponu ile dış oda doldurun. <ol><li> Numuneler deterjan ihtiva ise,% 0.02 Coomassie mavisi içeren 1 x tampon ve boya içermeyen 1x çalışan tamponu ile dış hücre iç bölmeyi doldurmak. </li></ol></li><li> güç kaynağına Elektrotlar ve boya bant katmanı çözme içine ~ 2 cm ilerler kadar 150 V&#39;de jelde proteinleri Electrophorese. Dur ve güç kaynağını kesin. </li></ol> 3. Çapraz bağlanma NOT: 4 ° C&#39;de Adımları 3.1-3.6&#39;da gerçekleştirin. <ol><li> elektroforez aygıtı sökün ve jel kasetinin cam levhaların ayrılması. Çıkarın ve yığma tabakasını atın. </li><li> Dikkatle boya ön alt kenarının altında jel kesti. almakBu kesim olarak yumuşak ve düz bir şekilde mümkün kılmak için bakım ve daha sonra jel kullanılmamış parça atılır. Bu homojenat, numunedeki tüm protein içerecektir geniş bir ~ 2 cm, poliakrilamid jel yatay şerit bırakacaktır. </li><li> Jel şeridin kenarları boyunca kullanılmamış herhangi bir kısmı Trim. </li><li> Dikkatli bir şekilde küçük bir kap içinde 10 ml fosfat tamponlu salin (PBS) içine şerit yerleştirin, yavaşça dengelenmeye 30 dakika nutation karıştırın. </li><li> Dengelemeden sonra, atmak ve başka bir 10 mL PBS ile değiştirin. Pipet 500 uL 25 mM DSP PBS içine dimetil sülfoksit içerisinde çözündürüldü ve 30 dakika boyunca, yukarıdaki (aşama 3.4) karıştırın. </li><li> DSP çözümü kapalı dökün. Reaksiyona girmemiş DSP gidermek için% 2 sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren 0.375 M tris (hidroksimetil) aminometan hidroklorür (tris-HCl), pH 8.8, 10 ml ekleyin. 15 dakika üğrüm devam edin. </li></ol> 4. SDS-PAGE <ol><li> Jel şerit söndürme iken, SDS-PA hazırlanmasıStandart yöntemler 9&#39;a göre GE jel çözeltileri. Polimerizasyon reaktif eklemeyin. </li><li> Söndürüldükten sonra, oda sıcaklığına kadar ΒΝ jel şeridi dönmek ve yeni bir jel kasetine şerit dökme. <ol><li> Bunu yapmak için, dikkatle jel alıp temiz bir jel kaset boşluk tabağa yerleştirin. </li><li> Orient boya ön alt yani BN-PAGE sırasında en uzak tarafında yeni bir kaset üstüne yakın gereken yeni kasetinin üst (en yakın olan ve şerit, jel şeridi, önceden gelen çevrilmiş olmalıdır oryantasyon). Şekil 3&#39;e bakınız. </li><li> Üst kenarı da kapak plakasının üst kenarı olacak burada ile yer alacağı şekilde şerit yerleştirin (yani, yeni bir jel üstünde olacaktır). boya ön cam levha yatay kenarlarına paralel olduğundan emin olun. </li><li> t yer bırakarak ara duvarların birine karşı kesilmiş şeridin bir yan itinjel o diğer tarafı dökülecek ve bir protein standardı veya merdiven yüklenmesine olanak sağlamaktadır. </li><li> Jel bandın alt kenarı bir tırtıklı veya alanlar varsa, dikkatli bir şekilde kesilmiş. Eğer mevcut ise, bunlar jel sırasında tuzak kabarcıklar dökme olacaktır. </li><li> Jel şerit doğru bir biçimde pozisyonlandığı zaman, ara plaka üzerinde kapak plakası yerleştirin. sıkışan hava kabarcıklarını dışarı itmek için hafif bir baskı uygulayın. </li><li> Üretici talimatlarına göre jel-dökme aygıtı monte devam edin. </li></ol></li><li> çözündürücü jel tamponuna polimerizasyon reaktifleri ekleyin ve serolojik bir pipet kullanarak hazırlanan jel kaset içine dökün. istif tabakası için oda bırakmak için, kesilmiş BN-PAGE jel şeridin altında yaklaşık 2 cm jel kaseti doldurun. </li><li> döküldü jel üst üzerinde 100 uL butanol ekleyin ve çözme tabakasının polimerizasyonu için 30 dakika izin verir. butonalün kapalı dökün. </li><li> Istifleme jeli çözeltisine polimerizasyon reaktifleri ekleyin. Bir serolog kullanmaik pipet, jel kasetinde kalan boş alanı doldurmak için istifleme tabaka dökülür. <ol><li> bu jel bir şeridin altında alanı doldurur ve hava kabarcıklarının değildir bu nedenle yığın tabaka dökülür gibi jel kaseti yatırın. </li><li> istifleme jeli tamponu jel şeridin altında boş alanı doldurur, giderek düzeyde bir taban üzerine jel kaseti döndürür. </li><li> yaklaşık taşmaları o kadar bir sonraki istifleme jeli tamponu ile kesilmiş jel şerit boş alanı doldurmak için devam edin. </li></ol></li><li> istifleme tabaka 30 dakika boyunca polimerize olmaya bırakın. Not: jel polimerize ise 10 x SDS-PAGE çalışma tamponu (250 mM tris (hidroksimetil) aminometan (tris), 1.9 M glisin,% 1 SDS) konur. Bu aynı zamanda önceden yapılmış ve oda sıcaklığında saklanabilir. </li><li> 1x çalışma tamponu yapmak için 450 ml dH 2 O içine 50 ml 10X SDS-PAGE çalışma tamponu stokunu. </li><li> istifleme tabaka polimerize sonra, dökme elde edilen jel kaseti çıkarmakcihaz, dH 2 O ile durulayın ve üretici talimatlarına göre elektroforez aygıtı monte edin. </li><li> Bundan sonra, imalatçı tarafından belirtilen seviyeye dış bölmeyi doldurmak, 1 x SDS-PAGE çalışma tamponu ile tamamen iç bölme doldurun. </li><li> Bir sonraki bir molekül ağırlığı merdiven ya da uygun protein standardı ile kesilmiş jel şeride yer yükleyin. </li><li> güç kaynağına elektrotları takın ve Coomassie boyası jel kapalı çalışır zaman 120 V&#39;ta örnekleri Electrophorese, dur ve güç kaynağı ayırın. </li><li> 10 bağlayıcı antikor tarafından elektrobeneklenme ile ve protein saptaması standart yöntemler kullanılarak jel analiz edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+as+a+collection+of+protein+machines:+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists.">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li><li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network.">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).</li><li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+methods+for+detection+and+analysis.">Protein-protein interactions: methods for detection and analysis.</a> Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).</li><li>Ho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+protein+complexes+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+mass+spectrometry.">Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry.</a> Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Beisiegel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Blotting.">Protein Blotting.</a> Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).</li><li>Killinger, B. A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+alpha-Synuclein+Multimer+Stoichiometry+in+Complex+Biological+Samples+by+Electrophoresis.">Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis.</a> Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).</li><li>Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+alpha-synuclein.">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein.</a> PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).</li><li>Wong, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , (1991).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+proteins+in+detergent+solutions.">Characterization of membrane proteins in detergent solutions.</a> Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).</li><li>Peters, K., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking:+reagents+and+problems+in+studies+of+membrane+structure.">Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure.</a> Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).</li><li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+of+extended+biological+structures:+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+[35S]dithiobis(succinimidyl+propionate).">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate).</a> J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).</li><li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+mitochondrial+respiratory+membrane+protein+complex+II.">Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II.</a> Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Protein-protein etkileşimleri canlılar yürütmek her görev için önemlidir. Bu nedenle, bunlar yoğun inceleme ve araştırma konusudur. Multimer-PAGE yakalama ayrılması ve protein kompleksleri çok çeşitli analiz etmek için bir yeni yöntemdir. Daha önce hastalıkla bağlantılı protein α-sinüklein 11 oligimerization okuyan uygulanabilirliğini ortaya koymuştur. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi Bununla birlikte, pek çok protein kompleksleri için uzatılabilir. protein kompleksleri okuyan diğer yöntemler ile karşılaştırıldığında, multimeri-PAGE basitliği nedeniyle ve kısalık avantajlıdır. doku örneğinden zaman tam SDS jel, yaklaşık 8 saat olan ayrılmış için. Algılama tipik western blot ile yapılabilir için, protokol açılan deneyleri ile bağlantılı çok daha düşük tespit limitleri ile, modifiye edilmemiş doku lizatındaki gerçekleştirilebilir. Buna ek olarak, en iyi donatılmış moleküler biyoloji soylarınaratories biraz açık yatırımla tekniğini gerçekleştirmek mümkün olacak. daha sonra tartışıldığı üzere, multimeri-PAGE ile bağlantılı cebine en giderme ve çalışılan her bir protein kompleksi yöntemi optimize gelir. multimeir-PAGE en moleküler biyologlar için erişilebilir olması gerekirken, başarı araştırmacının beceri ve deneyimine bağlıdır. Kritik olarak, yeni, SDS jel içine BN jel bandın kesilmesi ve yeniden döküm bakımı yapılmalıdır. Elektroforez paralel bantlar SDS jel içine geçirmek için proteinlerin neden olduğu şekilde jel şeridi yönlendirmek önemlidir. Jel şerit eğri döküm durumunda, protein bantları birbiri içine göç edecek ve veriler kaybolacaktır. Özellikle büyük kompleksleri için SDS-PAGE jeli içine döküm öncesinde jel şeridin Benzer önemlidir. Bu çözme laye içine çekilmiş olması çok uzak BN-PAGE jeli içine göç etmiş olabilir büyük kompleksler, daha fazla zaman verirSDS-PAGE jel r. Önemli bir şekilde, çapraz bağlama neden olduğu protein boyut ve fiziksel özelliklerine değişiklikler ayrıca analiz sırasında göz önüne alınmalıdır. Örneğin, bu gibi α-sinüklein gibi bazı düşük molekül ağırlıklı proteinler, iyi PVDF membranları üzerinde tutulan değildir, ancak bunların çapraz bağlı oligomerler 12 vardır. Bu karşılaştırmalı analizleri etkileyebilecek edebilir ve dikkate alınmalıdır. İlk kez multımer-PAGE ile bir kompleks ayırma, yöntem doğrulamak için önemlidir. Biz üç doğrulama / giderme testleri düşündürmektedir. İlk olarak, söz konusu peptid, daha sonra, durdurma PVDF zarı üzerine şerit leke jel şeridin eksizyonu kadar multimeri-PAGE protokolü izlenerek BN jel içine geçer sağlamak ve ilgi konusu alt-birimi için sonda. sinyal ise, karmaşık bir olasılıkla daha gözenekli yapılmalıdır, ya da örnek RESOLV içine daha fazla göç etmesine izin olmalıdır, yani BN jel içine taşınmıyorduing katmanı. bir sinyalin varlığı, en azından bağlanmamış alt-birim jel göç onaylar. Bu aşamada, tam kompleksinin varlığını teyit etmek zor olacaktır. alt-biriminin kanıtı BN jel şeridi algılanırsa, ikinci test hareket. , Bir çapraz bağlama aşaması olmadan multımer-PAGE gerçekleştirmek daha sonra alt-birimi için PVDF membran ve prob üzerine leke. alt birim SDS varlığında denatüre SDS jeline normal geçmeleri gerekmektedir. Bu gerçekleşmezse, muhtemelen araştırmacının tekniği ile bazı sorun var. BN jel şeridi kötü arkasında bir protein bırakarak kesilmiş olabilir, ya da SDS jel yanlış dökme olabilir. Şekil 1 &#39;de ele alındığı gibi, son olarak, daha sonra leke ve prob, bir de çapraz bağlayıcı bölünme aşaması ile multimer-PAGE gerçekleştirin. Bu multimerdir-PAGE protokolünün diğer bazı bölümünün beklenmedik sonucu kompleksinin toplama DSP eklenmesi nedeniyle olduğu doğrulanırsa değil. dilinim bir azaltmaya yol açmalıdırD-yoğunluk toplam bant ve görüntüleme sırasında artmış yoğunluklu alt birim monomer bandı. bir toplu bant, normal multimer-PAGE görüldüğü takdirde, ancak yoğunluğu monomer bandı artar DSP koparıldıktan sonra, kompleks muhtemelen SDS jeli üzerine yapılmış, ancak çözme katmana göç başarısız olmuştur. Mevcut durumda, multimeri-PAGE birçok protein kompleksleri için geçerli olmakla birlikte, bir tek kalıpta tüm protokol değildir. Muhtemelen ilgi her kompleks için değiştirilmesi gerekiyor. Ortak bir problemi, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir: Çekilen kompleksler genellikle ancak SDS-PAGE üzerinde göç o kadar büyüktür. Bu SDS jel gözenekliliğe değiştirmek veya daha uzun zaman dönemleri için elektroforezi tarafından idare edilebilir. Diğer bir sorun da jel üzerinde ikiden fazla bantların arada bulunmasıdır. Çapraz bağlayıcı ile tamamlanmamış reaksiyon orta molekül ağırlıklı bant 13 bir dağıtım neden olabilir. Bu dif yapabilirsinizBirden fazla bantlar fizyolojik açıdan önemli oligomerik ara maddeler, ya da kısmen çapraz bağlanma, sadece istenmeyen sonuçlar temsili olup olmadığını belirlemek için ficult. Analizden önce eritilmesi gerekir zar proteinleri için, deterjan seçimi protein komplekslerinin davranışları üzerindeki etkisini dikkate almak da önemlidir. Membran proteinleri çözmek için kullanılan bir deterjan 15, bağlama ortakları ile konformasyonları, dernekler etkiler ve 14 çalışır. Deterjan seçimi de etkiler 16 çapraz bağlama etkinliğini. Böylece, ideal eritici koşulları karmaşık çalışılan ile değişecektir olasıdır. Şekil 2. Süksinat dehidrogenaz SDHA blot üzerinde gösterildiği gibi, multimer-PAGE zaman zaman jele kolayca hareket etmelidir kadar küçüktür 124 kDa mitokondriyal Kompleks II parçası olan, bir kompleksini yakalamak için başarısız olur.o saptanmadığını multimeir-PAGE yakalamaya açamadı olduğunu gösterir. bunun gibi olgularda birçok olası açıklamaları var. En çok çapraz bağlama reaktifleri, amino asit yan zincirleri olan kovalent bağlar oluştururlar, iki tepkin ucu içerir. verim hangi çapraz bağlama reaktifleri yakalama protein kompleksleri reaktif artıkları kendi erişilebilirliğine bağlıdır. DSP durumda, çapraz-bağlama, solvent maruz primer ve sekonder alifatik amino grupları, lisin 17 genellikle ε-amino gruplarının asilasyonu ile gerçekleştirilebilir. Lizin kalıntıları genellikle protein yüzeyinde bulunan, ancak hidrofobik merkezlerinde kendi zaman ayırma 13&#39;e çapraz bağlama etkinliğini azaltmaktadır. Kompleks II alt-birimleri mitokondriyal zarın gömülü ve hatta digitonin 18 çözünme sonrasında, DSP erişilemez olabilir. Böyle amiloid oligomer olarak çok büyük ve yoğun paketleme kompleksleri,r, aynı zamanda çapraz bağlama maddeleri, yüzey lizin kalıntılarının kullanımını sınırlayabilir. Bunun bir sonucu olarak, bir protein düzeneklerinin bu tür multimeri-PAGE ile uyumlu olmayabilir. Hidrofobik bölgeleri ve katyonik artıkları bağlanan Coomassie Blue, ve bazı durumlarda 19 PBS ve bloklar çapraz bağlama bölgesindeki dengelemeden sonra uzayıp olması da mümkündür. Bu, azaltan veya multimer-PAGE ile etkilenen oligomerlerin algılama ortadan kaldırabilir. Bu durumda, yöntem, tüm protein ilişkileri karakterize etmek için, evrensel deney değildir, ve miktar, istenen yerde olduğu düşünülmemelidir. Bununla birlikte, multimeri-PAGE protein kompleksleri analizi için ucuz, nispeten hızlı bir araç ve diğer kurulan aracı ile birlikte kabul edilebilir.

<html> Normal hücre fonksiyonlarını protein-protein etkileşimleri, 1, 2 bağlıdır. Bunun bir sonucu olarak, insan hastalıkları genellikle çeşitli protein kompleksleri 3 montajı ve davranış düzensizlik tarafından işaretlenir. Böyle etkileşimleri karakterize yeteneği dolayısıyla çok önemlidir. Bu etkileşimlerin tespit Mevcut araçları genellikle etkileşim ortakları çekme-aşağı ve ardından hedef proteinler, saflaştırılmasını gerektirir. Geleneksel saflaştırma diferansiyel santrifüj, çökeltme ve / veya kromatografi 4 ile gerçekleştirilir. Bu yöntemler zaman alıcıdır, her bir hedef protein için değiştirilmesi gerekir, ve genellikle düşük verimlerle sonuçlanabilir. Modern saflaştırma yöntemleri, bir yakalama molekülü 5 bağlanmış boncuklarıyla yüklenmiş sütunlar üzerinde bağışıklık çökeltmesi ya da ekstre proteinleri hedef peptid etiketleri kaynaşmasını içerenBu, bir çok proteinin şekilde uzatılabilir da &quot;&gt; 6., Potansiyel olarak her zamanki bağlanma partnerleri için afinite açısından farklılık yapılarda ortaya çıkan hedef sekansı, bir modifikasyonunu gerektirir. Bazı protein-protein etkileşimleri, hassas doğası, bu yöntem uygulanabilir olmayabilir demektir birçok senaryolara. Ayrıca, protein-protein etkileşimleri eşleştirmek için kullanılan açılan tahliller nedeniyle özgürlük ve yem proteinin yerli olmayan seviyelerinin kısıtlı derecelerde, doğru bir hücresel resim toplayamaz. İdeal olarak, protein kompleksleri saflaştırma veya çekme aşağı gerek kalmadan, doğal hallerine tespit edilebilir. Mavi doğal poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE), sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) için daha az denatüre alternatif olarak geliştirilen ve biyolojik örnekler 7 bazı proteinler ve komplekslerin ayrılması için izin veriliyordu. Bununla birlikte, BN-PAGE&#39;de proteinler lar göre ayırmakdiğer moleküllerle boyut, yük ve üç boyutlu yapı ve birlikte dahil olmak üzere değişkenlerin ge sayısı. Bu faktörlerin etkileşimler genellikle proteinlerin eş ayrılması, agregat oluşumu ve kötü protein bandı çözünürlüğü ile sonuçlanır. İki boyutlu yerli-poliakrilamid jel elektroforezi bu sorunların 8, hepsi bir giderir, ama. Doğal ayrılması ile ortaya çıkan komplikasyonları aşmak için, bazı yazarlar, doku lysate&#39;lerin 4 protein kompleksleri yakalamak için bu ditiyobis (süksinimidil propionat) gibi amin-reaktif çapraz bağlama reaktifleri, (DSP) kullanır. Bu muamele edilmiş Lizatlar daha sonra denatüre edilmiş ve protein kompleksleri doğal boyutu ve makyaj korurken, SDS-PAGE ile ayrılabilir. çapraz bağlama reaktifleri, doku lizatlarında başka bir molekülün yakınlığı ve proteinlere dayalı tepki Bununla birlikte, çok serbestlik derecelerine sahip ve stokastik, spesifik olmayan arka plan çapraz etkileşim-linking özellikle konsantre örneklerinde, yüksek olabilir. Bu zor-yorumlama sonuçlara yol açabilir. Burada, bir hibrid BN-PAGE / SDS-PAGE yöntemiyle kullanımını gösteren, ayrı ve kompleks karışımlar protein derlemeleri tespit etmek için, multimeri-poliakrilamid jel elektroforezi (multimer-PAGE) olarak adlandırılır. Başlangıçta, hücre lizatı, BN-PAGE ile poliakrilamid jel içinde süspansiyon haline getirilir. lizat içeren Jel daha sonra çapraz bağlama reaktifi DSP ile reaksiyona sokulur. Sözde hareketsiz ve biraz jeli üzerinde ayrıldı, proteinler arka çapraz bağlayıcı tepkime azalır, yani daha az spesifik olmayan bir tepki muhtemeldir. Çapraz bağlanma sonrası, jel, bantlar kesilir ve SDS-PAGE ile ayrılmıştır. Elde edilen jel daha sonra, tipik olarak poliakrilamid jel elektroforezi ile ilişkili herhangi bir yolla analiz edilebilir. Bu yöntem, ilave saflaştırma veya çekme Dow gerek kalmadan, modifiye edilmemiş doku lizatındaki doğal protein komplekslerinin ayrıştırılması ve algılanması amacıyla sağlarn.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;epsilon;-Aminocaproic acid</td><td>Sigma</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Acros Organics</td><td>164855000</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)</td><td>BioRad</td><td>161-0148</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Anti rabbit IgG-HRP from goat</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid assay kit</td><td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris</td><td>Sigma</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescence substrate kit</td><td>ThermoFisher</td><td>24078</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie blue G-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiobis(succinimidylpropionate)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22585</td><td></td></tr><tr><td>Dry nonfat milk</td><td>LabScientific</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Thermofisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td>For titration. Caustic.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>For PVDF membrane activation. Toxic.</td></tr><tr><td>Monoclonal anti &amp;alpha;-synuclein IgG from rabbit</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7011-R</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&#039;,N&#039;-tetramethylethylenediamine</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N&#039;-methylenebisacrylamide</td><td>Acros Organics</td><td>16479</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>NP40</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-872</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (tween-20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene fluoride transfer membranes</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Thermo Scientific</td><td>88265</td><td></td></tr><tr><td>SDS solution (10% w/v)</td><td>BioRad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)</td><td>BioRad</td><td>161-0799</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)</td><td>BioRad</td><td>161-0798</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE Imagequant LAS 4000</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9558-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 microplate reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Former + Stand</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL dounce homogenizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic tissue homogenizer</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120220</td><td></td></tr></tbody></table>

multimer-page: a method for capturing and resolving protein complexes in biological samples

arındırıcı ve tek proteinler ve peptidler çalışmak için pek iyi gelişmiş yöntemler vardır. Bununla birlikte, en çok hücresel işlev, sıklıkla, kovalent olmayan ve kolay bir saflaştırma teknikleri ile bozulmuş olan bir bağlanma araştırılması için zor olan etkileşimli protein komplekslerinin ağlar tarafından gerçekleştirilmektedir. Bu çalışma, stabilize edici ve iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez ile modifiye edilmemiş dokusundan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem tarif eder. Doku lisatı, protein jel içine kısa bir mesafede yer değiştirmektedir kadar sonra bir elektrik akımı uygulandığında, bir denatüre edici olmayan mavi doğal poliakrilamid jel üzerine yüklenir. Taşınan protein ihtiva eden jel şeridi daha sonra kesilmiş ve kovalent protein kompleksleri stabilize amin reaktif çapraz bağlama reaktifi ditiobis (sukinimidil propionat) ile inkübe edilir. çapraz bağlı kompleksler ihtiva eden jel şeridi daha sonra bir sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel içine dökülür, ve t,O kompleksleri tamamen ayrılır. yöntem ucuz ve öğrenmesi kolay, yani teknikleri ve en moleküler biyologlar için tanıdık malzemelere dayanır. yeterince aşırı büyük kompleksleri ayırmak için yeteneği sınırlıdır ve evrensel başarılı olmamıştır da, yöntem iyi çalışılmış komplekslerinin çeşitli yakalamak başardı ve ilgi birçok sistemde muhtemelen geçerlidir.

Bu gösteri deneyinde, multimeir-PAGE bütün sıçan beyni lizatının gerçekleştirildi. Elde edilen ayrılan proteinler poliviniliden diflouride (PVDF) membran üzerinde lekelenir ve sonra kompleksler oluşturmak üzere bilinen proteinlere karşı antikorlar ile problanmıştır. Şekil 1, iki ile protokolünün bir doğrulama gösterir. İlk olarak, çapraz bağlanmış proteinler, çapraz bağlama reaktifi ile oluşturulmaktadır gözlenen daha yüksek molekül ağırlıklı türlerin, yani bir indirgeyici maddenin eklenmesiyle bölünebilecek ve protokol (Şekil 1A) herhangi bir başka bileşenine bağlı olmadığını göstermek . İkinci olarak, bu durum, çapraz-bağlama, çapraz-bağlama kompleks proteinlerine özel ve jel üzerinde yakınlığı nedeniyle rasgele reaktivite en aza indirecek anlamı, deterjanlar (Şekil 1B) ilave duyarlı olduğunu göstermektedir. Şekil 2, bir yöntem resp yakalamak için başarısız olduğunu göstermektedirAksi iratory kompleksi II de, ancak çözünebilir ve zara bağlı kompleksleri, hem yakalamak için geniş ölçüde tatbik edilebilir olmasıdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55341/55341fig1.jpg" /> Şekil 1: multimer-PAGE yönteminin doğrulanması. -Jel DSP ile çapraz bağlama ile protein kompleksleri (A), yakalama dithiothretol (DTT) ile bölünmeye karşı duyarlı olan. Multimer-PAGE (A1) ya da kaplamalı olmayan bütün sıçan beyni lizat üzerinde gerçekleştirilmiştir (A2), 5 mM Tris / SDS su verme çözeltisi dahil dithiothretol. Jel PVDF membran üzerinde elektrobotlandı ve kinesin ağır zincir için problanmıştır. Yüksek moleküler ağırlıklı bir bandı benzer şekilde tümünü veya kinesin motoru protein kompleksinin kısmına uygun olarak, her iki membranlar üzerinde görülmektedir. DTT ile muamele blot üzerinde 126 kDa, kinesin ağır zincir peptid moleküler kütlesi meydana gelen ek bir band bulunmaktadır. Ditiyotreitol, bir indirgeyici madde, ve cr geri yapabiliyorDSP disülfid bağı mevcut bölünmesiyle OSS bağlama. kinesin agrega DTT ile bölünmeye karşı hassastır. (B) protein kompleksi yakalama deterjanlar denatüre edici ilave duyarlıdır. SDS (sol) veya Triton X-100 (sağ) lizat numuneleri ilave edildi ve daha sonra buz üzerinde inkübe edildi, artan miktarlarda (% 0 ila 2) dışında, metinde anlatıldığı gibi multimer-PAGE bütün sıçan beyni lizat üzerinde gerçekleştirilmiştir ilk jel yüklemeden önce 30 dakika karıştırıldı. Nihai jeller PVDF üzerinde lekelenir ve α-sinüklein için problanmıştır. artan molekül ağırlığı en az üç grup, sırasıyla, monomerin, tetramer ve oktameri-sinüklein &#39;a karşılık gelen gözlenir. Oligomerik bantlarının sinyal yoğunlukları etkinliğini çapraz bağlama doğal protein konformasyonunun bağlı olduğuna işaret etmektedir, artan deterjan konsantrasyonu azalır. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55341/55341fig1large.jpg" target="_blank">Vi lütfen tıklayınız</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu Ew. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55341/55341fig2.jpg" /> Şekil 2: multimer-PAGE kullanılarak protein kompleksleri yakalama gösterilmesi. (A) Çözünür ve zara bağlı protein kompleksleri (A), bütün sıçan beyni lizatı veya metinde anlatıldığı gibi multımer-PAGE yöntemiyle, 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca% 2 digitonin ile inkübe (B) lizattan yakalandı. Jeller daha sonra lekelenir ve PVDF membranları çeşitli komplekslerinin bileşenleri için problanmıştır. Yüksek moleküler ağırlıklı türler mikrotübülleri stabilize etmek için bilinen asetile tubulin için problanmıştır zar üzerinde gözlenmektedir. Ve dinein kinesin sırasıyla 1.5 MDA ve 380 kDa&#39;lık bir molekül kütlesine sahip çoklu bir alt birim motoru protein kompleksleridir. Bu komplekslerin bileşenleri için lekelenen membranlar, yüksek molekül ağırlıklı türlerin göstermektedir. Buna ek olarak, multimeri-PAGE başarıyla CHSP90 dımerı aptured. a-Sinükleinin tetramerler ve oktamer, aynı zamanda, nörotoksik, yüksek molekül ağırlıklı oligomerler oluşturur. oktamer ve daha yüksek ağırlıklı türlerin bir çizgi lekelenir zar üzerinde görülür. SSVD dimerizasyon de gözlenmektedir. Yüksek moleküler ağırlıklı türler mitokondriyal kompleksleri I ve IV bileşenleri için lekelenen zarlar üzerinde tespit edilir. Bununla birlikte zar, uygun olan herhangi bir yüksek molekül ağırlıklı grup göstermeyen, SDHA, kompleks II &#39;nin bir elemanı için lekelenir. AcetTUB: α-tubulin asetile; βTUB: β-tübülin; Dinein: dinein ağır zincir; HSP90: Isı şoku proteini 90; Kinesin: ağır zincir kinesin; NDUFS3: mitokondriyal kompleks demir-sülfür merkezi 3 I; SSVD: porin; SDHA: mitokondriyal kompleks II süksinat dehidrojenaz; COXIV mitokondriyal kompleks IV sitokrom C oksidazı. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55341/55341fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> Şekil 3: Genel multimer-PAGE akış şemasıdır. (A), örneğin BN-PAGE numune tampon maddesi içinde homojenize olarak denatüre edici olmayan yöntemler kullanılarak doku lizat hazırlayın. (B), BN-PAGE jeli pipetleyin lizat daha sonra BN-PAGE çalıştıran tamponda elektroforez (150 Volt) gerçekleştirmek. boya ön geçirilmiş kadar numune çözme jele ~ 2 cm geçirmek için izin verir. (C), istif tabakası ve çözme tabakanın kullanılmayan kısmı çıkartın. (D) ile PBS içinde jel şeridi daldırın ve 30 dakika boyunca çalkalama ile dengeye getirin. (E) PBS çıkarın ve 2.5 mM DSP içeren PBS içinde jel şerit yeniden daldırın. 30 dakika çalkalayın. (F) DSP çözeltisini çıkarın ve ardından% 2 SDS ihtiva eden 375 mM Tris, jel şerit yeniden su altında ve 30 dakika çalkalayın. Jel şeridi içinde bulunan Kompleksi hemen Cros stabilizes-bağlama. (G) jel 180 ° şerit ve yeni bir SDS-PAGE jel içine dökme döndürün. Her iki istifleme ve katmanlar çözme içerir. (H) &#39;elektroforesis (120 volt) ile örnek giderin. (I), daha sonra gerektiğinde tabaka çözme analiz, jel şerit ve istifleme tabakayı çıkarın. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55341/55341fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples at JoVE.com

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

multimer-page-method-for-capturing-resolving-protein-complexes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K Görüntüleme.  Michigan State University.  stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur. 

Video: Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Biyokimya

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this work, the pre-endosomal anthrax toxin is assembled and transitioned into the endosomal complex. First, the N-terminal domain of a cysteine mutant lethal factor (LFN) is attached to a biolayer interferometry (BLI) biosensor through disulfide coupling in an optimal orientation, allowing protective antigen (PA) prepore to bind (Kd 1 nM). The optimally oriented LFN-PAprepore complex then binds to soluble capillary morphogenic gene-2 (CMG2) cell surface receptor (Kd 170 pM), resulting in a representative anthrax pre-endosomal complex, stable at pH 7.5. This assembled complex is then subjected to acidification (pH 5.0) representative of the late endosome environment to transition the PAprepore into the membrane inserted pore state. This PApore state results in a weakened binding between the CMG2 receptor and the LFN-PApore and a substantial dissociation of CMG2 from the transition pore. The thio-attachment of LFN to the biosensor surface is easily reversed by dithiothreitol. Reduction on the BLI biosensor surface releases the LFN-PAprepore-CMG2 ternary complex or the acid transitioned LFN-PApore complexes into microliter volumes. Released complexes are then visualized and identified using electron microscopy and mass spectrometry. These experiments demonstrate how to monitor the kinetic assembly/disassembly of specific protein complexes using label-free BLI methodologies and evaluate the structure and identity of these BLI assembled complexes by electron microscopy and mass spectrometry, respectively, using easy-to-replicate sequential procedures.

Here we present a protocol to monitor the assembly and disassembly of the anthrax toxin using biolayer interferometry (BLI). Following assembly/disassembly on the biosensor surface, the large protein complexes are released from the surface for visualization and identification of components of the complexes using electron microscopy and mass spectrometry, respectively.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed complexes. The latter can be elegantly resolved according to molecular size using native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Coupling of such separations to sensitive mass spectrometry (BN-MS) has been well-established and theoretically allows for exhaustive assessment of the extractable complexome in biological samples. However, this approach is rather laborious and provides limited complex size resolution and sensitivity. Also, its application has remained restricted to abundant mitochondrial and plastid proteins. Thus, for a majority of proteins, information regarding integration into stable protein complexes is still lacking. Presented here is an optimized approach for complexome profiling comprising preparative-scale BN-PAGE separation, sub-millimeter sampling of broad gel lanes by cryomicrotome slicing, and mass spectrometric analysis with label-free protein quantification. The procedures and tools for critical steps are described in detail. As an application, the report describes complexome analysis of a solubilized endosome-enriched membrane fraction from mouse kidneys, with 2,545 proteins profiled in total. The results demonstrate identification of uniform, low-abundance membrane proteins such as intracellular ion channels as well as high resolution, complex protein assembly patterns, including glycosylation isoforms. The results are in agreement with independent biochemical analyses. In summary, this methodology allows for comprehensive and unbiased identification of protein (super)complexes and their subunit composition, providing a basis for investigating stoichiometry, assembly, and interaction dynamics of protein complexes in any biological system.

A versatile cryoslicing BN-MS protocol using a microtome is presented for high-resolution complexome profiling.

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This publication presents a complete interaction proteomics workflow designed for identifying low abundance protein-protein interactions from the nucleus that could also be applied to other subcellular compartments. This workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, sample preparation, offline cleanup, single-shot label-free mass spectrometry, and downstream computational analysis and data visualization. Our protocol is optimized for detecting compartmentalized, low abundance interactions that are difficult to identify from whole cell lysates (e.g., transcription factor interactions in the nucleus) by immunoprecipitation of endogenous proteins from fractionated subcellular compartments. The sample preparation pipeline outlined here provides detailed instructions for the preparation of HeLa cell nuclear extract, immunoaffinity purification of endogenous bait protein, and quantitative mass spectrometry analysis. We also discuss methodological considerations for performing large-scale immunoprecipitation in mass spectrometry-based interaction profiling experiments and provide guidelines for evaluating data quality to distinguish true positive protein interactions from nonspecific interactions. This approach is demonstrated here by investigating the nuclear interactome of the CMGC kinase, DYRK1A, a low abundance protein kinase with poorly defined interactions within the nucleus.

Described is a proteomics workflow for identifying protein interaction partners from a nuclear subcellular fraction using immunoaffinity enrichment of a given protein of interest and label-free mass spectrometry. The workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, filter aided sample preparation, offline cleanup, mass spectrometry, and a downstream bioinformatics pipeline.

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Biyoloji

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

Protein Etkileşimleri keşfetmek ve HaloTag Teknoloji Kullanımı Protein Fonksiyonu Karakterizasyonu

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...