Name: methods for the self-integration of megamolecular biopolymers on the drying air-lc interface
Uploaded: 2017-04-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface at JoVE.com

Bu çalışma hibe-in-aid Eğitim Bakanlığı, Kültür, Spor, Japonya Bilim ve Teknoloji, Kyoto teknobilime Merkezi ve Araştırma ve Geliştirme Mitani Vakfı Genç Bilim İnsanları (16K17956) için de destek verdi.

1. Araçlar <ol><li> Polarizasyon cihazı <ol><li> Bir polarizasyon aygıtı oluşturmak için, bir halojen lamba, bir ışık kılavuzu, polarize, örnek bir sahne, bir optik tren, çubuk anlamına gelir ve bir dijital tek lens refleks kamera (bir ışık kaynağı temin kutuplaşmayı Şekil 1C ve Malzeme Listesi bkz cihaz parçalar). </li></ol></li></ol> Biyopolimer Çözüm 2. Hazırlık <ol><li> polisakkarit çözümleri <ol><li> Birden fazla 12 saat boyunca ~ 80 ° C&#39;de karıştırma ile saf su (100 mL) içinde sacran 7 (0.5 g) içinde çözülür. çözünme esnasında, buharlaşmayı önlemek için bir plastik film ile bir kap kapağı. aynı şekilde, ksantan sakızının, sulu bir çözelti hazırlayın. </li><li> % 0.5 ağırlık sulu çözeltiler elde etmek için ~ 25 ° C &#39;de çözüm soğutun. </li><li> kirletici maddelerin (48.400 x g, 4 ° C, 1 saat, 3 tim kaldırmak sacran çözeltisi santrifüjes). </li></ol></li><li> MT çözümü <ol><li> Bir Britton-Robinson tamponu içinde% 0.5 ağırlık tübülin solüsyonu (1 mL) ile hazırlanması (80 mM N, N&#39;-bis piperazin (2-etansülfonik asit) (PIPES), 1 mM etilen glikol-bis (β-aminoetil eter) - N, N, N &#39;N&#39; tetraasetik asit (EGTA), buz 8 ve 5 mM MgCl2, pH 6.8). </li><li> % 0.5 ağırlık tübülin çözeltisi (50 uL) ve kullanım guanozin-5&#39; - [(α, β) -methyleno] trifosfat (GpCpp) (5 uL), bir GpCpp içeren tübülin solüsyonu (50 uL) hazırlanır. stabil bir MT çekirdeği elde etmek için 3 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. NOT: GpCpp rolü MT oluşumunu desteklemek ve tamamen tübülüne MT depolimerizasyonunu bastırmaktır. </li><li> stabil bir% 0.5 ağırlık MT çözelti elde etmek için 1 gün boyunca ~ 25 ° C &#39;de% 0.5 ağırlık tübülin çözeltisi (950 uL) ve GpCpp içeren tübülin solüsyonu (50 uL) karıştırın. </li></ol></li><li> DNA solüsyonu<ol><li> (1 mM EDTA içeren 10 mM Tris, pH 8.0,) Tris-EDTA tampon maddesi çözeltisi içinde bir% 0.5 ağırlık, DNA çözeltisi (1 ml) hazırlayın. </li></ol></li><li> Kurutma deney için, 25 ° C &#39;de% 0.5 ağırlık biyopolimer örnek eriyiği bulundurun. </li></ol> Çapraz polarize ışık altında 3. Kurutma Deneyleri ve Gözlem <ol><li> Tek taraflı açık hücre içindeki çözeltileri (Şekil 1A) <ol><li> Bir silikon levha kesme 1 mm bir kalınlığa sahip olan, uygun bir şekil (Malzeme listesi) (5-15 mm, 1 mm bir iç boyutu ve yaklaşık 20 mm, Şekil 1A). <ol><li> ~ 20 mm ve iki modifiye edilmemiş bir cam slaytlar (76 mm x 1 mm ile 26 x) 5-15 mm arasında, 1 mm bir iç boyutu olan bir silikon ayırıcı oluşan tek taraflı açık hücre monte ve. dışarı sızmasını örnek çözümü tutmak için önceden çift klipleriyle hücrenin her iki tarafını sabitleyin. </li></ol></li><li> Yavaş yavaş ~ 1 mm gözenek boyutlu bir pipet kullanılarak 0.5 ağırlık% biyopolimer çözeltisi (100-300 ul) her bir ekleme~ 25 ° C &#39;de, her bir hücreye te ucu. bir şırınga iğnesi kullanarak hücrelerin içindeki hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> buharlaştırma için atmosfer basıncı altında 60 ° C&#39;de bir hava sirkülatör bir fırında hücreleri yerleştirin; Buharlaşma yönü yerçekimi edilene tersidir. </li></ol></li><li> Çapraz polarize ışık altında Gözlemler (Şekil 1B-1C) <ol><li> Geniş bir alanı (80 mm x 80 mm) üzerinde düz bir yüzey ışık kaynağı ile 100 W halojen lamba aracılığıyla düz bir görülebilir ışık sağlar. Tutucuları (Şekil 1C) kullanılarak 45 ° ve 135 ° &#39;ye polarizörleri ayarlayın. </li><li> Bir optik tren ve çubuk standları (Şekil 1C) kullanılarak ışık kaynağı, polarizörler, numune aşamasında ve kameranın konumlarını saptamak. İki polarizörler Numune katı yerleştirin (polarizörler arasındaki mesafe ~ 5 cm olmalıdır). odaklama sağlamak için numune aşamasından ~ 20 cm kamerayı yerleştirin. </li><li> Verilen zamanlarda, pola arasındaki aşama 3.1.3 örnekler yerleştirmekXZ-düzleminde sahne paralel rizers ve siyah bir perde cihazı kapsamaktadır; Gerçek cihaz Şekil 1C &#39;de gösterilmiştir. </li><li> Standart zoom lensle dijital tek lensli refleks kamerasını kullanarak doğrusal çapraz polarize yoluyla örnekleri fotoğraflamak (Malzeme Listesi bakınız). Bilgisayar yazılımı (Malzeme Listesi bakınız) kullanılarak, bu tür odak mesafesi gibi kamera ayarlarını kontrol edin. </li></ol></li><li> Iletilen ışık yoğunluğunun uzay-zaman analizi (Şekil 1C) <ol><li> Kurutma işleminde yönelim düzeni parametre değişikliğini değerlendirmek için, 24 saat boyunca saat başı fotoğraf toplar. </li><li> (Örneğin, ImageJ) bir görüntü işleme programı kullanılarak bir gri değer olarak, Z-doğrultusunda merkez hattı boyunca geçen ışık yoğunluğu ölçülür. </li><li> üst açık tarafı olan uzaklığın bir fonksiyonu olarak, gri değer grafiğe geçirilir. </li></ol></li><li> Çapraz-polarize aydınlatabiliriz altında mikroskopik gözlemlert (Şekil 1D) <ol><li> Yöntemleri kontrol bir CCD kamera 9 ile donatılmış bir polarizasyon mikroskobu ile mikroskobik gözlemler yapmak. ışık yolu bir ilk dereceden geriliği plakasını tutun. PC yazılımı kullanılarak fotoğraflar için koşulları kontrol edin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Flemming, H. -. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix.">The biofilm matrix.</a> Nat. Rev. Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).</li><li>Osada, Y., Kawamura, R., Sano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydrogels of cytoskeletal proteins. , (2016).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440, 297-302 (2006).</li><li>Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milliscale+self-integration+of+megamolecule+biopolymers+on+a+drying+gas-aqueous+liquid+crystalline+interface.">Milliscale self-integration of megamolecule biopolymers on a drying gas-aqueous liquid crystalline interface.</a> Biomacromolecules. 17 (6), 2096-2103 (2016).</li><li>De Gennes, P. G., Prost, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The physics of liquid crystals. , (1993).</li><li>De Gennes, P. G., Brochard-Wyart, F., Quere, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Capillarity and wetting phenomena: drops, bubbles, pearls, waves. , (2003).</li><li>Okajima, M. K., Kaneko, D., Mitsumata, T., Kaneko, T., Watanabe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacteria+that+produce+megamolecules+with+efficient+self-orientations.">Cyanobacteria that produce megamolecules with efficient self-orientations.</a> Macromolecules. 42 (8), 3058-3062 (2009).</li><li>Okeyoshi, K., Kawamura, R., Yoshida, R., Osada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermo-+and+photo-enhanced+microtubule+formation+from+Ru(bpy)32+-conjugated+tubulin.">Thermo- and photo-enhanced microtubule formation from Ru(bpy)32+-conjugated tubulin.</a> J. Mater. Chem. B. 2, 41-45 (2014).</li><li>Matsuo, E. S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+discontinuous+volume-phase+transition+of+gels.">Kinetics of discontinuous volume-phase transition of gels.</a> J. Chem. Phys. 89, 1695-1703 (1988).</li><li>Okajima, K., Mishima, R., Amornwachirabodee, K., Mitsumata, T., Okeyoshi, K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+swelling+in+hydrogels+formed+by+cooperatively+aligned+megamolecules.">Anisotropic swelling in hydrogels formed by cooperatively aligned megamolecules.</a> RSC Adv. 5, 86723-86729 (2015).</li><li>Joshi, G., Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+control+of+diffusion+and+swelling+in+megamolecular+polysaccharide+hydrogels.">Directional control of diffusion and swelling in megamolecular polysaccharide hydrogels.</a> Soft Matter. 12, 5515-5518 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Dolayı iletilen ışık yoğunluğu çok düşük olmasının kamera numunesi odaklanmak için bazen zor oldu. Bu gibi durumlarda, sahnede uzun bir saydam plastik film yerleştirerek odak düzenlemek için yardımcı oldu. gözlemlenebilir çözünürlük sınırlaması ~, bu durumda 10 mikron kamera lensi bağımlıydı. örnek kalınlığı, Dy, gözlemlenebilir sınırlama ~, bu durumda 10 mm lambanın maksimum ışık şiddetine bağlı olmuştur. Şekil 1 B &#39;de gösterilen cihazın avantajı, numune yan resimlerini kurutma işlemi sırasında alınması için izin vermektedir. Gözlem tipik mikroskobu kullanılır yatay bir düzlemde, dayanmadan gerçekleştirilebilir. Kurutma deneyler sırasında bir tarafı açık hücre durarak, buharlaşma yönü düzenlenir ve yerçekimi ters yönde olup. yan görünümünü izlenmesi, kurutma sıçan hesaplanmasını sağlarE 4. Gelecekte, cihazın numune aşamasında sıcaklık ve nem düzenleyiciler yerleştirilmesiyle, otomatik olarak yönelim düzeni parametresinde zamansal değişiklikleri izlemek için mümkün olacaktır. Ayrıca, kilo değişimi izlemek için kurulumunda bir denge konsantrasyonunun tahmin yardımcı olacaktır. Bu yöntem, aynı zamanda polisakarit 11 hidroj, 12 anizotropik şişme işlemi açıklamak için kullanılabilir. Nedenle yumuşak aktüatör yapısal değişiklikleri izlemek mümkündür olacaktır.

Biyopolimerlerin katı, çubuk şeklinde yapılar üzerinde yoğunlaşarak, dinamik yumuşak malzemeler polisakarit biyofilm matrisler 1, sitoskeletal proteinler 2 oluşan &quot;aktif jeller&quot; ve istenen şekil 3 &quot;DNA origami&quot; da dahil olmak üzere, çeşitli uygulamalarda kullanılmaktadır. yapısal özelliklerini açıklamak için, bir çok stratejileri, transmisyon elektron mikroskopisi, tarama elektron mikroskopisi, atomik kuvvet mikroskopisi ve konfokal floresan mikroskobu olarak, araştırılmıştır. Bu yöntemler çoğunlukla kurutulmuş veya statik halde üstlenilen çünkü Ancak, gerçek yaşam sistemlerinde görüldüğü gibi, makroskopik ölçeklerde dinamik davranışları açıklamak zordur. Son zamanlarda, başarılı bir şekilde polarize ışığın 4 boyunca, sulu hava LC arayüzünde biyopolimerlerin dinamik davranışı görülmektedir. yönlendirilmiş bir yapı kazandırmak görselleştirilmesi sırasında biyopolimer kurutulurkenÇözelti, geçici değişiklikler kararsız hava LC arayüzünde biyopolimerlerin kendini entegrasyonunu göstermektedir. Burada, polarize enstrümanları kullanarak hava-LC arayüzü LC biyopolimer çözeltiler kurutulması için bir protokol açıklar. 5, 6 kurutma değerlendirmediğiniz LC fazının diğer analizler aksine, kurutma işlemi sırasında LC dinamikleri tek taraflı açık hücre sıvı fazın yan görünümde yönelim düzeni parametresinin değerlendirilmesinden burada incelenmiştir . Hücre buharlaştırma kombinasyonu ve kontrollü bir buharlaşma yönü ile makroskopik izlenmesi için izin polarize araçların kullanımı. Buna ek olarak, bu yöntem etkinliğini göstermek için, moleküler ağırlık, konsantrasyon vs etkilenen adsorbe mikro bölgeleri, kristalin yapılar üzerinde yoğunlaşarak kurutma kayıtları doğrulamak mümkün olduğunu, kurutma proörneğin polisakaritler, mikrotübüllerin (MTS), ve DNA olarak rijit çubuk şekilleri ile bazik biyopolimerler ve proseslerine araştırılmıştır. bunlar megamolecular ağırlıklara sahip hiyerarşik makromoleküllerin tipik örnekleridir ve bunların moleküller arası etkileşimler LC durumları meydana sağlayacak dolayı bu biyopolimerlerin seçtik.

<table><tbody><tr><td>sacran</td><td>Green Science Materials Inc., Japan</td><td></td><td>From Aphanothece sacrum.&lt;br/&gt; M&lt;sub&gt;w&lt;/sub&gt; = 1.9 &amp;times; 10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; g mol&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>xanthan gum</td><td>Taiyo Kagaku Co., Japan</td><td>Neosoft XC</td><td>From Xanthomonas campestris.&lt;br/&gt; M&lt;sub&gt;w&lt;/sub&gt; = 4.7 &amp;times; 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; g mol&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>tubulin</td><td>Cytoskeleton, Inc., USA</td><td>T240</td><td>From porcine brain.</td></tr><tr><td>GpCpp</td><td>Jena Bioscience, Germany</td><td>NU405L</td><td></td></tr><tr><td>piperazine-&lt;em&gt;N,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-bis(2-ethanesulfonic acid)</td><td>Sigma-Aldrichi, Co. LLC.</td><td>P6757-500G</td><td>PIPES</td></tr><tr><td>ethylene glycol-bis(&amp;beta;-aminoethyl ether)-&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-tetraacetic acid</td><td>Dojindo Molecular Technologies, Inc.</td><td>342-01314</td><td>EGTA</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>135-15055</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>162-21813</td><td>pellet</td></tr><tr><td>DNA</td><td>Sigma-Aldrich, Co. LLC.</td><td>D1626</td><td>From salmon testes.&lt;br/&gt;Mw = 1.3 &amp;times; 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; Da (~2,000 bp)</td></tr><tr><td>Tris-EDTA buffer solution</td><td>Sigma-Aldrich, Co. LLC.</td><td>T9285-100ML</td><td>10 mM Tris, pH 8.0, with 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>slide glass</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd., Japan</td><td>S1111</td><td></td></tr><tr><td>silicon rubber sheet</td><td>Asone Co.</td><td>6-611-32</td><td>Thickness: 1 mm</td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Beckman-Coulter, Inc., USA</td><td>Avanti J-25</td><td>equipped with a JA-20 rotor</td></tr><tr><td>light source</td><td>Sumita Optical Glass, Inc., Japan</td><td>LS-LHA</td><td></td></tr><tr><td>light guide</td><td>Sumita Optical Glass, Inc., Japan</td><td>GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M)</td><td>80 mm &amp;times; 80 mm</td></tr><tr><td>halogen lamp</td><td>Ushio Inc., Japan</td><td>JCR 15V150WBN</td><td></td></tr><tr><td>holder</td><td>Sigmakoki, Co.,Ltd.</td><td>KMH-80</td><td></td></tr><tr><td>sample stage</td><td>Sigmakoki, Co.,Ltd.</td><td>TARW-25503L</td><td></td></tr><tr><td>sample holder</td><td>Sigmakoki, Co.,Ltd.</td><td>SHA-25RO</td><td></td></tr><tr><td>rod</td><td>Sigmakoki, Co.,Ltd.</td><td>ROU-12-40</td><td></td></tr><tr><td>posts holder</td><td>Sigmakoki, Co.,Ltd.</td><td>RS-6-40</td><td></td></tr><tr><td>posts holder</td><td>Sigmakoki, Co.,Ltd.</td><td>RS-12-60</td><td></td></tr><tr><td>posts holder</td><td>Sigmakoki, Co.,Ltd.</td><td>RS-12-80</td><td></td></tr><tr><td>posts holder</td><td>Sigmakoki, Co.,Ltd.</td><td>RS-12-130</td><td></td></tr><tr><td>carrier</td><td>Sigmakoki, Co.,Ltd.</td><td>CAA-25LS</td><td></td></tr><tr><td>camera holder</td><td>Sigmakoki, Co.,Ltd.</td><td>CMH-2</td><td></td></tr><tr><td>medium optical rail</td><td>Sigmakoki, Co.,Ltd.</td><td>OBA-500SH</td><td></td></tr><tr><td>lenstube</td><td>Tomytech, BORG</td><td>lenstube BK</td><td>80&amp;phi;, L25 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>lenstube</td><td>Tomytech, BORG</td><td>lenstube BK</td><td>80&amp;phi;, L50 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>multiband</td><td>Tomytech, BORG</td><td></td><td>80&amp;phi;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>V plate</td><td>Tomytech, BORG</td><td>V plate 60S</td><td></td></tr><tr><td>plate holder</td><td>Viexen, Co.,Ltd.</td><td>plate holder SX</td><td></td></tr><tr><td>EOS Kiss X7i&amp;nbsp;</td><td>Canon Inc., Japan</td><td>8594B001</td><td>with a standard zoom lens,&amp;nbsp; EFP 18-55 mm</td></tr><tr><td>photographic software</td><td>Canon Inc., Japan</td><td>EOS Utility</td><td></td></tr><tr><td>PC</td><td>Microsoft</td><td>Surface</td><td></td></tr><tr><td>polarization microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>first order retardation plate</td><td>Olympus</td><td>U-TP530</td><td>&amp;lambda; = 530 nm</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Olympus</td><td>DP80</td><td></td></tr><tr><td>photographic software</td><td>Olympus</td><td>cellSens Standard</td><td></td></tr><tr><td>Java-based image processing program</td><td>the National Institutes of Health</td><td>ImageJ</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for the self-integration of megamolecular biopolymers on the drying air-lc interface

su kullanımı Yaşayan organizmalar daima ortamda kurutma yatkındır. damar demetleri olarak suyun hareket ettirilmesi ve cilt katmanlarında suyun nemlendirici vakalarında görüldüğü gibi Bunların faaliyetleri, biyopolimer bazlı mikro ve makro yapılar yönlendirmektedir. Bu çalışmada, kurutma üzerine biyopolimerlerin oluşan bir sulu sıvı kristalin (LC) çözeltiler etkisini değerlendirmek için bir yöntem geliştirdi. LC biyopolimerler megamolecular ağırlığa sahip olarak, polisakkaritler, sitoskeletal proteinler ve DNA çalışması seçtik. polarize ışık altında kurutma sırasında biyopolimer çözeltilerinin gözlem kararsız hava LC arayüzü başlayarak milliscale kendini entegrasyonu ortaya koymaktadır. Sulu LC biyopolimer çözeltiler dinamiklerinin bir tek taraflı açık hücreden suyun buharlaştırılması ile kontrol edilebilir. Çapraz-polarize ışık kullanılarak çekilen görüntüleri analiz ederek, yönelim düzeni parametresinde uzay-zamansal değişikliklerin tanımak mümkündür. Buyöntem yapay çeşitli alanlarda malzemeler, aynı zamanda doğal yaşam dokuların sadece karakterizasyonu için yararlı olabilir. Biz biyomedikal ve çevre alanlarında yumuşak malzemeler için bir değerlendirme yöntemi sağlayacağına inanıyoruz.

<html> Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, aygıt kullanılarak, mikro bölgesi kendi kendine entegrasyon hava LC arayüzü değerlendirilmiştir bir kurutma (Şekil 2A) ile macrodomain için. Kurutma Deneyin ilk gösterimi olarak, megamolecular polisakaritler, sacran (Mw = 1.9 x 10 7 g mol-1) ve ksantan sakızı (4.7 x 10 6 g mol-1) iki türlü karşılaştırıldı. Şekil 2B, çapraz polarize ışık altında hücrenin içinde çözeltiler fotoğraflarını göstermektedir. Kurutma önce, her iki çözümlerinde bir dağınık halde iletilen ışık ile birkaç parlak bölgeleri gözlemlemek mümkündü. 6 saat boyunca 60 ° C&#39;de kurutulduktan sonra, sacran çözelti içinde hava LC arayüzü altında bölgesi önemli ölçüde yüksek olmuştur. Bu etki, bir jel büzülme sürecine deri tabakası oluşumuna benzer arayüzde makroskopik yönlendirilmiş bir yapısı, oluşturulmuş olduğu anlamına gelir&quot;xref&quot;&gt; 10. sıcaklık sadece 60 ° C ile 25 ° C arttırıldı ve bazı küçük macrodomains arayüzü altında gözlendi Öte yandan, ksantan çözeltisi yoğunluğu önemli ölçüde azalmıştır. ksantan mikro bölgesi hareketliliği çok daha hassas sacran mikro bölgesi daha sıcaklığına olmasıdır. arabirimde yönelim kritik farklılıklar böylece polarizasyon cihazı kullanılarak tespit edilmiştir. Şekil 2C ve film S1 sacran çözelti içinde kurutma işlemi için uzay-zaman analizinin sonuçlarını göstermektedir. iletilen ışık yoğunluğu mikro bölgesi ve yönelim düzeni parametresini gösterir. hava-sıvı arayüzü etrafında en yüksek yoğunluğu önemli ölçüde artmış ve kalınlığı yaklaşık 2 mm büyüdü. Bu sonuçlar, mikro bölgeler, hava-LC arabirimi bir mesafede yönlendirmek için başlangıç ​​olduğunu göstermektedirarayüze bir milliscale alan paralel olarak büyümeye d. polarize ışık altında Bu gözlemden, kurutma işleminde sıvı hareketleri görselleştirmek için mümkündür. Macrodomain boyut ve yönlenme yönü açısından sacran ve ksantan zamkı arasındaki farklılıklar da birinci dereceden geriliği plaka (Şekil 2D), bir polarizasyon mikroskobu ile doğrulanmıştır. sacran sıvı faz, bir tek macrodomain arayüzünde oluşan, yani bir mavi bölge gösterdi. Buna karşılık, ksantan sakızı, sıvı hali birden macrodomains herhangi bir yönde oluşturulabilir, yani, mavi, sarı ve pembe bölge gösterdi. Bu yöntem, aynı zamanda megamolecular ağırlıkları ile bazik katı biyopolimer üç tip karşılaştırılması için araştırılan - polisakaritler (sacran: Mw = 1.9 x 10 7 g mol-1, mikro bölgeuzunluk&gt; 20 um), MTS (Mw = 10 9 -10, 10 g mol-1, mikro bölge uzunluğu&gt; 10 um) ve DNA (M 1.3 x 10 6 g mol-1, w = mikro bölge uzunluğu &lt;1 um) - 37 ° C&#39;de bir fizyolojik ortamda. Şekil 3B&#39;de gösterildiği gibi, kurutmadan önce, sacran çözeltisi ve MT çözeltisi bütün bölgede dağınık etki ile, benzer bir LC durumları göstermektedir. Kurutma işlemi sırasında, MT çözelti içinde etki de hava-LC arayüzünden kendini entegrasyonu uygulandı ve dağınık alanlar, tek bir macrodomain entegre edilmiştir. Öte yandan, DNA solüsyonu sıvı fazda özel bir yönünü göstermektedir. MT çözeltisi ve tampon ile hazırlanan DNA, bu çözüm durumunda, entegrasyon kurutma sırasında tuz konsantrasyonu, pH, ve iyonik güç değişikliklerden etkilenen dikkat etmek önemlidir. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pYaş = &quot;1&quot;&gt; yönelim düzeni parametresi ve adsorbe edilmiş polimer filmlerin tarifi, kurutma kayıtlar aynı zamanda, bir birinci dereceden geriliği plaka (Şekil 3C) bir polarizasyon mikroskobu kullanılarak gözlendi değerlendirmektir. sacran kurutma rekor çünkü milliscale tek macrodomain oluşumunun önemli çift kırılma yoğunluklarını sergiledi. MT kurutma kayıt için, uzun eksen x-eksenine paralel olarak dalgalı demetleri görülmektedir. Bunun tersine, DNA çözeltisi kurutma kaydı tane şekilli macrodomains &lt;5 um çapında ve rasgele doğrultularda gösterdi. Bu gözlemlerden, macrodomain boyut çubuk benzeri mikroalanları uzunluğu etkilenir olduğu açıktır. Bir polarizasyon mikroskobu kullanılarak kurutma kayıtları gözlemleyerek biyopolimer mikro bölgesini yönlü yönlendirme değerlendirmek azaltılabildi. Sonuç olarak, polarize ışık kullanılarak yöntemleri kullanıldıKurutma havası-LC arayüzünde megamolecular biyopolimerlerin kendini entegrasyonu. Sulu LC çözeltiler dinamiklerinin bir tek taraflı açık hücreden suyun buharlaştırılması ile takip edildi. Çapraz-polarize ışık kullanılarak çekilen görüntüleri analiz ederek, uzay-zamansal değişim ve yönelim düzeni parametresini tanımak mümkündü. gösterdi kurutma işleminın doğal süreçlere benzer olduğu göz önüne alındığında, bu yöntem, çeşitli alanlarda, sadece yapay malzemelerin karakterizasyonu için faydalı değil, aynı zamanda doğal yaşam dokuların olacaktır. Bu biyomedikal ve çevre alanlarında yumuşak malzemeler için bir değerlendirme yöntemi sağlayabilir inanıyoruz. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55274/55274fig1.jpg" /> Şekil 1: deney kurutma. (A), tek taraflı açık hücre içinde çözeltiler şematik gösterimi. (B)çapraz polarize ışık altında gözlemler için kullanılan deneysel cihazın şematik gösterimi. polarizörler normal olarak 45 ° ve 135 ° &#39;ye ayarlanmıştır. (C) Gerçek cihaz. Bu şekil, başvuru 6 modifiye edilmiştir. Telif Hakkı: Amerikan Kimya Derneği, 2016 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55274/55274fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55274/55274fig2.jpg" /> Şekil 2: polisakaridler sacran ve ksantan zamkı, sulu çözeltilerin Kurutma. (A) Kurutma havası-LC arayüzünde kendini entegrasyon şematik gösterimi. (B) kendi başlangıç ​​halinde ve sonra polisakarid çözümleri iki tür yan incelemelerçapraz polarize ışık altında 60 ° C&#39;de kurutma 6 saat. ilk polimer konsantrasyonları ağırlıkça% 0.5 idi. (C) Belirli bir zamanda alınan her resim için Z-yönü içinde, bir hat üzerinde bir çapraz Nicols içinden ışık yoğunluğu Bulaşan. (D) 60 ° C&#39;de kurutma, 6 saat sonra hücre içinde polimer çözeltilerinin Polarizasyon mikroskobik görüntüleri. Kırmızı oklar: arabirimde macrodomains. Bu şekil, başvuru 6 modifiye edilmiştir. Telif Hakkı: Amerikan Kimya Derneği, 2016 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55274/55274fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55274/55274fig3.jpg" /> Şekil 3: biyopolimer sulu çözeltiler ve kurutma kayıtlarının Kurutma. (A), polys Kaynaklarıaccharides (siyanobakteri), MTS (domuz beyin) ve DNA (somon testis). (B) çapraz polarize ışık altında 37 ° C&#39;de kurutma sırasında sacran, MT ve DNA çözeltilerinin yandan görüntüleridir. ilk polimer konsantrasyonları ağırlıkça% 0.5 idi. (C) çapraz Nicols verilen yön ile cam alt-tabaka üzerinde kurutuldu, polimer filmlerin mikroskobik görüntüleri. Tüm ölçekli çubukları 50 mikron. Bu şekil, başvuru 6 modifiye edilmiştir. Telif Hakkı: Amerikan Kimya Derneği, 2016 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55274/55274fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.</a> <img alt="Film S1" src="/files/ftp_upload/55274/55274vid1.jpg" /> Film S1: 60 ° C&#39;de kurutma sırasında sacran çözeltisi Kurutma işlemi kullanılarak gözlenençarpı Nicols. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55274/Movie_S1-3fps.avi" target="_blank">Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface at JoVE.com

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

hava-sıvı kristal arayüzünde megamolecular biyopolimerlerin kurutma kaynaklı kendini entegrasyon için bir yöntem olup burada sağlanır. Bu metodoloji Biyopolimerlerin makroskopik potansiyellerini anlamak için değil, aynı zamanda biyomedikal ve çevre alanlarında yumuşak malzemeler için bir değerlendirme yöntemi olarak sadece yararlı olacaktır.

Kurutma Hava-LC Arayüz üzerinde Megamolecular Biyopolimerlerin Kendinden entegrasyonu için Yöntemler

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

methods-for-self-integration-megamolecular-biopolymers-on-drying-air

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.0K Görüntüleme.  Japan Advanced Institute of Science and Technology.  hava-sıvı kristal arayüzünde megamolecular biyopolimerlerin kurutma kaynaklı kendini entegrasyon için bir yöntem olup burada sağlanır. Bu metodoloji Biyopolimerlerin makroskopik potansiyellerini anlamak için değil, aynı zamanda biyomedikal ve çevre alanlarında yumuşak malzemeler için bir değerlendirme yöntemi olarak sadece yararlı olacaktır. 

Video: Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Synthesis of Poly(N-isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Janus microparticles are compartmentalized particles with differing molecular structures and/or functionality on each of their two sides. Because of this unique property, Janus microparticles have been recognized as a new class of materials, thereby attracting a great deal of attention from various research fields. The versatility of these microparticles has been exemplified through their uses as building blocks for self-assembly, electrically responsive actuators, emulsifiers for painting and cosmetics, and carriers for drug delivery. This study introduces a detailed protocol that explicitly describes a synthetic method for designing novel Janus microhydrogels composed of a single base material, poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm). Janus microdroplets are firstly generated via a hydrodynamic focusing microfluidic device (HFMD) based on the separation of a supersaturated aqueous NIPAAm monomer solution and subsequently polymerized through exposure to UV irradiation. The resulting Janus microhydrogels were found to be entirely composed of the same base material, featured an easily identifiable compartmentalized morphology, and exhibited anisotropic thermo-responsiveness and organophilic/hydrophilic loading capability. We believe that the proposed method introduces a novel hydrogel platform with the potential for advanced synthesis of multi-functional Janus microhydrogels.

Synthesis of PolyN-isopropylacrylamide Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

We present a protocol to synthesize Janus microhydrogels composed entirely of the same base material, poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm), with a clearly compartmentalized structure base on the phase separation of a supersaturated NIPAAm monomer solution. The synthesized Janus microhydrogels show unique properties such as anisotropic thermo-responsiveness and organophilic/hydrophilic loading capability.

Poli Sentezi (<em&gt; K</em&gt; -isopropylacrylamide) Yönbağımlı Termo yanıt ve organofilik / Hidrofilik Yükleme Kapasitesi için Janus Microhydrogels

Janus microparticles are compartmentalized particles with differing molecular structures and/or functionality on each of their two sides. Because of this ...

Kimya

Orientational Transition in a Liquid Crystal Triggered by the Thermodynamic Growth of Interfacial Wetting Sheets

In liquid crystal (LC) physical chemistry, molecules near the surface play a great role in controlling bulk orientation. Thus far, mainly to achieve desired molecular orientation states in LC displays, the "static" surface property of LCs, so-called surface anchoring, has been intensively studied. As a rule of thumb, once the initial orientation of LCs is "locked" by specific surface treatments, such as rubbing or treatment with a specific alignment layer, it hardly changes with temperature. Here, we present a system exhibiting an orientational transition upon temperature variation, which conflicts with the consensus. Right on the transition, the bulk LC molecules experience the orientational rotation, with 90&#176; between the planar (P) orientation at high temperatures and the vertical (V) orientation at low temperatures in the first-order transitional manner. We have tracked thermodynamic surface anchoring behavior by means of polarizing optical microscopy (POM), dielectric spectroscopy (DS), high-resolution differential scanning calorimetry (HR-DSC), and grazing incidence X-ray diffraction (GI-XRD) and reached a plausible physical explanation: that the transition is triggered by a growth of surface wetting sheets, which impose the V orientation locally against the P orientation in the bulk. This landscape would provide a general link explaining how the equilibrium bulk orientation is affected by surface-localized orientation in many LC systems. In our characterization, POM and DS are advantageous by offering information on the spatial distribution of the orientation of LC molecules. HR-DSC gives information about the precise thermodynamic information on transitions, which cannot be addressed by conventional DSC instruments due to limited resolution. GI-XRD provides information on surface-specific molecular orientation and short-range orderings. The goal of this paper is to present a protocol for preparing a sample that exhibits the transition and to demonstrate how the thermodynamic structural variation, both in the bulk and on surfaces, can be analyzed through the abovementioned methods.

Here, we present a protocol to trigger an orientational transition of a liquid crystal in response to temperature. Methodologies are described for preparing a sample in order to observe the transition and the detailed transitional evolution.

Yüzey Islatma Levhalarının Termodinamik Büyümesi ile tetiklenen Sıvı Kristalde Oryantasyon Geçişi

In liquid crystal (LC) physical chemistry, molecules near the surface play a great role in controlling bulk orientation. Thus far, mainly to achieve ...

Mühendislik

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various surfaces and interfaces. This non-invasive optical technique can provide the local molecular-level information with monolayer or submonolayer sensitivity. We here are providing experimental methodology on how to selectively detect the buried interface for both macromolecules and biomacromolecules. With this in mind, interfacial secondary structures of silk fibroin and water structures around model short-chain oligonucleotide duplex are discussed. The former shows a chain-chain overlap or spatial confinement effect and the latter shows a protection function against the Ca2+ ions resulting from the chiral spine superstructure of water.

Being comprehensively utilized, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy can help to reveal chain conformational order and secondary structural change happening at polymer and biomacromolecule interfaces.

Toplam Frekans Üretimi TitreşimSpektroskopisi Ile Ortaya Çıkan Polimerlerin ve Biyomakromoleküllerin İnterasfer Moleküler Düzey Yapıları

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Biyokimya

Preparation of Liquid Crystal Networks for Macroscopic Oscillatory Motion Induced by Light

A strategy based on doped liquid crystalline networks is described to create mechanical self-sustained oscillations of plastic films under continuous light irradiation. The photo-excitation of dopants that can quickly dissipate light into heat, coupled with anisotropic thermal expansion and self-shadowing of the film, gives rise to the self-sustained deformation. The oscillations observed are influenced by the dimensions and the modulus of the film, and by the directionality and intensity of the light. The system developed offers applications in energy conversion and harvesting for soft-robotics and automated systems.
The general method described here consists of creating free-standing liquid crystalline films and characterizing the mechanical and thermal effects observed. The molecular alignment is achieved using alignment layers (rubbed polyimide), commonly used in the display manufacturing industry. To obtain actuators with large deformation, the mesogens are aligned and polymerized in a splay/bend configuration, i.e., with the director of the liquid crystals (LCs) going gradually from planar to homeotropic through the film thickness. Upon irradiation, the mechanical and thermal oscillations obtained are monitored with a high-speed camera. The results are further quantified by image analysis using an image processing program.

The goal of the protocol is to create liquid crystalline polymer films that can mechanically oscillate under continuous light irradiation. We describe in great detail the conception of free-standing films, from the liquid crystal alignment method to the photo-actuation. The experimental protocol applied to prepare this material is broadly applicable.

Işık tarafından indüklenen makroskopik salınım hareketi için sıvı kristal ağlar hazırlanması

A strategy based on doped liquid crystalline networks is described to create mechanical self-sustained oscillations of plastic films under continuous ...

Microfluidic Preparation of Liquid Crystalline Elastomer Actuators

This paper focuses on the microfluidic process (and its parameters) to prepare actuating particles from liquid crystalline elastomers. The preparation usually consists in the formation of droplets containing low molar mass liquid crystals at elevated temperatures. Subsequently, these particle precursors are oriented in the flow field of the capillary and solidified by a crosslinking polymerization, which produces the final actuating particles. The optimization of the process is necessary to obtain the actuating particles and the proper variation of the process parameters (temperature and flow rate) and allows variations of size and shape (from oblate to strongly prolate morphologies) as well as the magnitude of actuation. In addition, it is possible to vary the type of actuation from elongation to contraction depending on the director profile induced to the droplets during the flow in the capillary, which again depends on the microfluidic process and its parameters. Furthermore, particles of more complex shapes, like core-shell structures or Janus particles, can be prepared by adjusting the setup. By the variation of the chemical structure and the mode of crosslinking (solidification) of the liquid crystalline elastomer, it is also possible to prepare actuating particles triggered by heat or UV-vis irradiation.

This article describes the microfluidic process and parameters to prepare actuating particles from liquid crystalline elastomers. This process allows the preparation of actuating particles and the variation of their size and shape (from oblate to strongly prolate, core-shell, and Janus morphologies) as well as the magnitude of actuation.

Sıvı kristal Elastomer aktüatörler mikrosıvısal hazırlanması

This paper focuses on the microfluidic process (and its parameters) to prepare actuating particles from liquid crystalline elastomers. The preparation ...

Preparation of Monodomain Liquid Crystal Elastomers and Liquid Crystal Elastomer Nanocomposites

LCEs are shape-responsive materials with fully reversible shape change and potential applications in medicine, tissue engineering, artificial muscles, and as soft robots. Here, we demonstrate the preparation of shape-responsive liquid crystal elastomers (LCEs) and LCE nanocomposites along with characterization of their shape-responsiveness, mechanical properties, and microstructure. Two types of LCEs &#8212; polysiloxane-based and epoxy-based &#8212; are synthesized, aligned, and characterized. Polysiloxane-based LCEs are prepared through two crosslinking steps, the second under an applied load, resulting in monodomain LCEs. Polysiloxane LCE nanocomposites are prepared through the addition of conductive carbon black nanoparticles, both throughout the bulk of the LCE and to the LCE surface. Epoxy-based LCEs are prepared through a reversible esterification reaction. Epoxy-based LCEs are aligned through the application of a uniaxial load at elevated (160 &#176;C) temperatures. Aligned LCEs and LCE nanocomposites are characterized with respect to reversible strain, mechanical stiffness, and liquid crystal ordering using a combination of imaging, two-dimensional X-ray diffraction measurements, differential scanning calorimetry, and dynamic mechanical analysis. LCEs and LCE nanocomposites can be stimulated with heat and/or electrical potential to controllably generate strains in cell culture media, and we demonstrate the application of LCEs as shape-responsive substrates for cell culture using a custom-made apparatus.

We demonstrate the preparation of siloxane-based and epoxy-based liquid crystal elastomers (LCEs) and LCE nanocomposites. The LCEs are characterized with respect to reversible strain, liquid crystal ordering, and stiffness. As a potential application, we demonstrate their use as shape-responsive substrates in a custom device for active cell culture.

Monodomain Sıvı Kristal Elastomerler ve Likit Kristal Elastomer Nanokompozitlerinin Hazırlanması

LCEs are shape-responsive materials with fully reversible shape change and potential applications in medicine, tissue engineering, artificial muscles, and ...

Biyomühendislik

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

Bir polidimetilsiloksan İnce Film Kullanarak Otomatik çift katlı lipid Membran Oluşumu

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers can be readily functionalized and have been used in various applications such as bio-sensors and bio-devices. In this study, we introduced a planar organic molecule: copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) to dope lipid membranes. The CuPc/lipid hybrid membrane forms at the water/air interface by self-assembly. In this membrane, the hydrophobic CuPc molecules are located between the hydrophobic tails of lipid molecules, forming a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. Interestingly, an air-stable hybrid lipid bilayer can be readily formed by transferring the hybrid membrane onto a Si substrate. We report a straightforward method for incorporating nanomaterials into a lipid bilayer system, which represents a new methodology for the fabrication of biosensors and biodevices.

We report a protocol for producing a hybrid lipid membrane at the water/air interface by doping the lipid bilayer with copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) molecules. The resulting hybrid lipid membrane has a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. This protocol can also be applied to the formation of other functional nanomaterials.

Su/Hava Arabiriminde Hidrofobik Organik Moleküllerle Doped Hibrid Lipid Membranların Kendi Kendine Montajı

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins on-chip with the dialysis method and allowing in situ single-crystal or serial crystallography experiments at room temperature. The protocol details the fabrication process of the microchips, the manipulation of the on-chip crystallization experiments and the treatment of the in situ collected X-ray diffraction data for the structural elucidation of the protein sample. The main feature of this microfabrication procedure lies on the integration of a commercially available, semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane in between two layers of the chip. The molecular weight cut-off of the embedded membrane varies depending on the molecular weight of the macromolecule and the precipitants. The device exploits the advantages of microfluidic technology, such as the use of minute volumes of samples (&#60;1 &#181;L) and fine tuning over transport phenomena. The chip coupled them with the dialysis method, providing precise and reversible control over the crystallization process and can be used for investigating phase diagrams of proteins at the microliter scale. The device is patterned using a photocurable thiolene-based resin with soft imprint lithography on an optically transparent polymeric substrate. Moreover, the background scattering of the materials composing the microchips and generating background noise was evaluated rendering the chip compatible for in situ X-ray diffraction experiments. Once protein crystals are grown on-chip up to an adequate size and population uniformity, the microchips can be directly mounted in front of the X-ray beam with the aid of a 3D printed holder. This approach addresses the challenges rising from the use of cryoprotectants and manual harvesting in conventional protein crystallography experiments through an easy and inexpensive manner. Complete X-ray diffraction data sets from multiple, isomorphous lysozyme crystals grown on-chip were collected at room temperature for structure determination.

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This paper details the fabrication protocol of microfluidic chips developed for on-chip protein crystallization with the dialysis method and in situ X-ray diffraction experiments. The microfabrication process makes it possible to integrate a semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane with any molecular weight cut-off, between two layers of the chip.

In Situ X-ışını Kırınım Çalışmaları için Mikrodiyaliz ile Çip Üzerindeki Proteinlerin Kristalizasyonu

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...