Name: combining wet and dry lab techniques to guide the crystallization of large coiled-coil containing proteins
Uploaded: 2017-01-06T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins at JoVE.com

This work was supported by grant NIH R01 GM097204 (APV and JDH). Funding for JHM was supplied by an HHMI Undergraduate Research Summer Fellowship.

NOT: kavramsal çerçeve ya da iş akışı şeması başvuru için Şekil 1&#39;de açıklanmıştır. hesaplamalı veya sıra tabanlı tahminler, protein ekspresyonu ve saflaştırılması, biyokimyasal karakterizasyonu ve kristalleşme: protokol dört aşamaya bölünebilir. gösterilen örnekler Shroom SD2 etki ve / veya Shroom-kaya kompleksleri analizi, ancak herhangi bir protein ile kullanılabilir. 1. Kullanım Coiled-bobin Alan Sınırları Hesaplamalı Tahminleri oluşturmak için Web tabanlı Araçlar kurulan <ol><li> Dizi homologları bir Evrimsel Farklı Set toplayın. <ol><li> www.uniprot.org gidin ve üst arama çubuğuna Shroom yazın. </li><li> Seç dizileri yanında onların katılım numarasına kutuyu işaretleyerek indirmek için. yıldızla Diziler UniProt tarafından gözden dizileri gösterir ve genellikle daha güvenilirdir. tüm diziler tam ve doğru olmasını sağlamak için özen gösterin. </li><li> Seçilen s kaydetYükle düğmesini tıklayarak equences. </li><li> Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) kullanarak Shroom dizilerinin koleksiyonu aynı hizaya getirin. Gönder itme sonra Shroom dizileri ile dosyayı seçmek için &quot;Browse&quot; düğmesini tıklayın ve. </li><li> Hizalama işlemi tamamlandıktan sonra, &quot;Hizalama İndir Dosya&quot; düğmesini tıklayın. </li><li> (Dosyadan | | Giriş Hizalama Dosyası) Jalview kullanarak 1.1.5 oluşturulan çoklu dizi hizalama açın. (| Yüzde Kimlik Color) kimliği ile yeni hizalama penceresinin, renk içinde. </li></ol></li><li> İkincil yapının tahminler, esnek veya düzensiz dizinin tahminler hesaplayın ve ilgi protein (ler) içinde sarmal-bobin bölgelerini öngördü. <ol><li> Spiral-Coil tahminler hesaplamak için, http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi~~pobj gidin. Kopyala ve Dizi Kutusuna dizisi yapıştırın ve Gönder&#39;i tıklayın. NOT: Bu analiz kompozisyonu birkaç saat sürebilirlete. Shroom sekansları oldukça büyük olduğundan, sekanslar, web sunucusu boyutu kısıtlama uyacak şekilde en az 1000 amino asit bloklar halinde bölünmüş gerekebilir. Shrm2 analiz ederken, bu bölüm, sargılı-sargı bölgesi içerdiği bilinmektedir SHRM SD2 alanını ihtiva 1.000 C-terminal amino asitler kullanılır önerilir. Diğer proteinler ile bu analizi tekrar, mümkün tam boyda bir protein dizilerini kullanmak tavsiye edilir. Bu bir seçenek değilse, bilinen biyokimyasal veya fonksiyonel verilere dayalı diziyi mümkün olan en büyük parçasını kullanabilir veya teşrih. </li><li> Spiral-Coil tahminler hesaplamak için, http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi~~pobj gidin. Kopyala ve Dizi Kutusuna dizisi yapıştırın ve Gönder&#39;i tıklayın. </li></ol></li><li> Shroom dizisinin tek bir kapsamlı açıklama içine 1.2.2 adımlar 1.1 sonuçlarını birleştirin. NOT: son derece de her türlü ilgili i içerecek şekilde teşvik edilmektedirbelirtilen bilgi Literatürde da bu aşamada, protein işlevi veya saflaştırma ile ilgili diğer kaynaklardan çıkarılabilir. </li><li> Bu kapsamlı açıklamalı dizisi kullanarak, koruma maksimize etmek için çalışıyoruz, protein alan sınırları (ya da olası sınırları bir dizi) tahmin ve düzensiz veya esnek dizisinin miktarını en aza indirerek yapısal özelliklerini öngördü. Eğer biliniyorsa, oluşan protein ilgi fonksiyonel özelliklerini muhafaza edilmelidir. </li></ol> Bölüm 1&#39;de Tanımlanan Alan Sınırları 2. Express ve Arındırmak Proteinler NOT: Bu bölümün amacı, Bölüm 1&#39;de oluşturulan hipotetik etki sınırlarını ekrana hızlı ve kolay bir şekilde ölçülebilir deneyleri bir dizi kullanmaktır. <ol><li> Standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak, His 10 -mRuby2-XH2 plazmid olan çerçeve istenen kodlama dizisinin bir sentezleme plazmidi üretmek (vektör haritası, için Şekil 3&#39;e bakınıznd ek ayrıntılar). </li><li> 18-24 saat boyunca oda sıcaklığında autoinduction ortam 1 BL21 (DE3), E. coli ya da başka uygun bir ifade suşu kullanılarak her bir ifade plazmidi için test ekspresyon seviyeleri. <ol><li> örneğin burada bir (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial gibi hücreler ile birlikte ya da sağlam bir transformasyon protokolü kullanılarak talimatlar aşağıdaki sentezleme plasmidleri ve BL21 (DE3) içine boş plazmid kontrol Dönüşümü -Dönüşüm /). </li><li> Taze dönüştürülmüş plaktan, tek bir koloni almak ve 34 ug / ml kanamisin ile gece boyunca lizojeni Broth&#39;ta 37 ° C (LB) ortamı bir 5 mi Başlangıç ​​kültürünün yetiştirilmesi. </li><li> Ertesi gün, kültür pelet ve taze LB ile pelet yıkayın </li><li> 34 ug / ml kanamisin ile autoinduction ortam, 50 ml başlatıcı kültürün ekleyin. Kültür oda sıcaklığında ya da 37 ° C&#39;de, ya da doygunluk büyümeye olanak sağlar. Tipik olarak, 18-24 saat ~ için büyür. </li><li> Pelet hücresis ve saflaştırmaya süresiz önce -80 ° C &#39;de elde edilen hücre pelletleri dondurma. </li><li> en verimli istenen füzyon proteinini üreten soy belirlemek için her sentezleme gerilme ve SDS-PAGE ile, boş vektör kontrol alınmış bütün hücre özütleri karşılaştır. Onun 10 -mRuby2-Shroom SD2 füzyon proteinleri için, 50 dakika ~ ya da boya cephesinin, jel 22 alt ulaşıncaya kadar 180 V,% 10 SDS-PAGE jellerinin çalıştırın. </li><li> Coomassie Mavisi ile Leke jel her bir suş 23 içinde toplam hücresel protein görselleştirmek için. </li></ol></li><li> başarılı bir şekilde mRuby2-füzyon proteinini ifade her bir suş ile ilgili bir ilk afinite kromatografi aşamasında gerçekleştirin. Tipik haliyle, protein, 4 ° C de saflaştırma gibi değişen koşullara yararlanacaktır sürece saflaştırma, oda sıcaklığında 2.3.2-2.3.7 adımları gerçekleştirmek. <ol><li> Aşama 2.2.5 gelen çözülme hücre topakları. </li><li> liziz tamponu (% 10 gliserol, 500 mM NaCI, 40, 1.5 ml, her hücre pelletinimM imidazol, 20 mM Tris pH 8.0, 1 mM p-merkaptoetanol). uygun protez önleyicileri ile liziz tamponu Ek. </li><li> 10 mg / ml lizozim, 30 ul ilave edin ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. enstrüman için yönergeleri izleyerek sonikasyon kullanılır. </li><li> çözünmeyen materyal ya da çözünen hücreler pelet 14,000 x g&#39;de 30 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj içinde 1.5 ml tüp ve santrifüj içine aktarın. SDS-PAGE yoluyla sonraki analiz için supernatant ve pelet hem kaydedin. </li><li> Ni-NTA boncuk 100 uL eriyebilir kısma kuluçkalanması, nikel afinite saflaştırma gerçekleştirmek. boncuk karıştırmak için birkaç kez ters yüz, 5-10 dakika boyunca Çözünür lizat boncuk inkübe edin. </li><li> boncuk pelet bir masaüstü santrifüj 30 saniye boyunca 800 x g&#39;de santrifüjleyin. non-spesifik kirleticiler temizlemek için lizis tamponu ile pelet 3-5 kez yıkayarak bu izleyin. </li><li> liziz tamponu ile boncuk elute Ruby füzyon proteini 1 ile desteklenmişM imidazol. </li><li> Yukarıda &quot;hızlı ve kirli&quot; saflaştırma His-mRuby2-Shroom proteinlerinin davranışını karşılaştırmak için SDS-PAGE kullanın. </li></ol></li></ol> 3. karakterize Protein Numune Avantajlı özellikleri olanlar tanımak <ol><li> Yakut füzyon proteini konsantrasyonunu ölçmek ve sonra da ana PAGE jeli 24 üzerinde füzyon proteininin 1-5 ug yükleme numunenin homojenliğini değerlendirmek için 280 nm&#39;de bir spektrofotometre seti kullanın. 175 V 140 dakika boyunca, 4 ° C&#39;de,% 10 yerel PAGE jel üzerinde çalıştırıldı <ol><li> Görüntü mruby-etiketli füzyon bu testte göç nerede gözlemleyerek, floresan görselleştirmek için donanımlı bir görüntüleyici kullanarak yerel SAYFA. NOT: Bu proteinin muhtemelen toplandığında sıra kalmış füzyon proteini gözlemlemek için dikkatli olun. Bir floresan görüntüleme mevcut değilse, bir çoğu görselleştirmek ve Ruby görüntü konsantre örnekleri siyah ışık altında ya da bir UV ışık kutusu ile protein etiketledi. </li></ol></li><li> stabil katlanmış etki tespit etmek sınırlı proteoliz gerçekleştirin. % 0.025 subtilisin A. 5 ul / ~ 1 mg ml Ruby-SHRM SD2 füzyon 95 ul inkübe <ol><li> zaman noktalarında reaksiyonu Örnek 0, 0.5, 2, 5, 15, 60 ve 120 dakika sonra, her bir zaman noktası için reaksiyonundan 10 ul çıkarılması ve% 15 akrilamid jel kullanılarak, SDS-PAGE yoluyla tepkimenin ilerleyişinin görüntülenmesi . </li><li> Adım 2.2.7 olarak Coomassie Mavisi ile leke ve bir proteaz dirençli türler tespit edilebilir olup olmadığını değerlendirir. </li></ol></li><li> çözelti, bu proteinlerin genel davranışı hakkında kapsamlı bir değerlendirme olarak, kısmen saflaştırılmış mRuby2-Shroom füzyon proteinlerinin üzerinde saflaştırma verimi, davranış yerel PAGE ve sınırlı proteoliz veri entegre. <ol><li> Uygun fonksiyonel tahlil varsa (İsteğe bağlı), bu noktada etkinlik için kontrol edin. </li></ol></li></ol> 4. Coiled-coil SD2 Yüksek Kalite Kristaller ÜretenShroom Etki Alanı Not: Protein, genellikle farklı sıcaklıkta saflaştırma 4 ° C yararlanacak sürece bölüm 4.1 içinde Bütün aşamalar oda sıcaklığında gerçekleştirilir. <ol><li> İfade ve saflaştırma potansiyeli kaba bir tahmin olarak 50 mi büyümeleri kullanarak, tamamen saflaştırılmış örnek 5-20 mg elde etme amacı ile mRuby2-Shroom SD2 büyük ölçekli ifadeleri gerçekleştirin. Tipik olarak kültür 2L yeterli başlangıç ​​malzemesi sağlar. 10 dakika için 8000 x g&#39;de santrifüjleme ile büyüme pelet sonra hücreler. <ol><li> liziz için lizozim kullanılarak donmuş hücre peleti gramı başına liziz ~ 2 ml kullanılarak, daha önce parçalama tamponu içinde 2 L büyüme pelletini. Alternatif olarak, ~ 8 ml / g pelet de tekrar süspansiyon bir homojenleştirici veya Fransızca basın kullanarak eğer. 30 dakika süre ile 30,000 x g&#39;de santrifüj ile hücre yıkıntıları pelet haline. </li><li> Toplu Ni-NTA reçinesi 10 ml kullanılarak 4.1.1 çözünür fraksiyonu bağlanır. Uygun yerçekimi sütunu içine dökünve ilişkisiz proteinler boşalmasını sağlayın. </li><li> Yıkama, 1 M NaCl ilave lizis tamponu ile yıkama, ardından liziz tamponu, 40 ml ile 3-5 kez reçine. </li><li> 80 mM imidazol ile takviye liziz tamponu, 40 ml ile yıkayın reçinesi. </li><li> 1 M imidazol ilave lizis tamponu 40 ml Ruby Shroom füzyon proteinini ayrıştırmak. El 4-10 ml&#39;lik kısımlar halinde elüt protein fraksiyonlanması. </li><li> % 10 SDS-PAGE kullanılarak Ruby-Shroom füzyon proteinini ihtiva eden fraksiyonlar teyit edin. </li><li> % 8 gliserol, 250 mM NaCI, 15 mM imidazol, 20 mM Tris pH 8.0 içinde (tipik olarak 2-4 kısım), uygun fraksiyonlar Dialyze, 1 mM β-ME 6-8 kDa&#39;lık bir MWCO diyaliz tüpü kullanılarak. Füzyon proteininin her 25-50 mg TEV proteaz 1 mg ekleyin. Yavaş karıştırma ile gece boyunca oda sıcaklığında dialyze. </li><li> Tekrarlama nikel yakınlık arıtma 4.1.2 adımları. 4.1.6 için. Onun 10 -mRuby2 bağlı kalır iken Shroom SD2 alanı artık ilişkisiz fraksiyon kalmalıdırReçine ve elüsyon fraksiyonlarında bulunur. Coomassie Mavisi ile bu kullanarak% 12 SDS-PAGE boyama onaylayın. </li><li> % 8 gliserol, 100 mM NaCl, 5 mM p-merkaptoetanol tamponu, gece boyunca 20 mM Tris, pH 8.0 içine Shroom SD2 domenini ihtiva eden fraksiyonlar dialyze. </li><li> Bir FPLC kullanılması ile anyon değişim kromatografisi 25 gerçekleştirin ve 0.1-1.0 M NaCI bir NaCI gradyanı ile elüt edilerek kromatograflanmıştır. % 12 SDS-PAGE kullanılarak kesirler analiz edin. </li><li> Bir spin konsantratör (10. kDa&#39;lık bir MWCO veya daha proteini çalışılan bağlı olarak),% 12 SDS-PAGE ile zirve fraksiyonları analiz ~ 0 mg / ml, ve daha sonra, boyut dışlama kromatografisi 26 gerçekleştirmek için pik fraksiyonlar konsantre edilir. </li><li> Havuz tepe fraksiyonları ve 20 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCI,% 2 gliserol içine diyaliz 1 mM β-ME ve / ml kristalleştirmeden önce 10 mg konsantre edilir. İsteğe bağlı: Bu adımda, bir konsantrasyonda 5 ul numune kaldırma 1, 2, 5, ve 10 mg / ml lik bir numuneyi konsantre sırasında.Bu adım sırasında, örneğin davranış bakmak her numunenin bir nativ PAGE yükleme 2-5 ul çalıştırın. </li></ol></li><li> kristallendirme çalışmalarında için en uygun protein konsantrasyonunun tespit etmek 12 koşulları küçük dizisi taramasında. Bu koşulların bileşim olup, Şekil 7&#39;de tarif edilmektedir. <ol><li> Buhar difüzyon yönteminde, pipetleme ile kristalizasyon denemeler gerçekleştirmek 24-çukurlu, kuluçka süresi, damla kristalleştirme tepsileri, ilk başta çözelti 1 ul lamelleri protein örneğinin 1 ul içeren damlalar, ardından ayrı bir kuyu içine 12 koşullarının her birinin 500 ul . Bu teknikle ilgili ek bilgi için 27 bakınız. </li><li> Hızla şeffaf bir bantla tepsiyi mühür ve titreşimsiz bir uygun sıcaklık kontrollü bir ortamda kaseti taşıyın. değişebilir kullanılan sıcaklık, ancak 4 ° C, 16 ° C ve 20 ° C oldukça yaygındır. </li><li> Sonraki 3 gün boyunca tepsilere damla incelemek100X büyütme kadar bir mikroskop kullanılarak ays. 3 günlük dönemin sonunda, hiçbir yağış (net), hafif yağış, ağır yağış (kahverengi), ya da kristaller içeren her damla puan. Uygun bir protein konsantrasyonu en fazla 6, ağır çökeltilerin içermelidir. </li><li> 4.2 tanımlanan protein konsantrasyonu, ticari olarak temin edilebilir kristalizasyon ekranlar geniş bir ekran. Ayrıca damla hatayı en aza indirerek bir sıvı taşıma veya kristalleşme robotun kullanımı büyük ölçüde bu süreci hızlandırır. Bu kullanıcı tek bir örnek ile daha fazla koşul ekrana izin, hem de çok daha az protein gerektirir. </li><li> sistematik olarak daha önce 24-iyi tarama tepsileri kullanarak kristalleşme damla içinde değişkenlerin her değiştirerek geniş ekranlarından tespit başlangıç ​​koşullarını iyileştirmek. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+clones+and+auto-induction+for+protein+production+in+E.+coli.">Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli.</a> Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).</li><li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes.">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).</li><li>Chapman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification:+pure+but+not+simple.">Protein purification: pure but not simple.</a> Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+coiled+coils+from+protein+sequences.">Predicting coiled coils from protein sequences.</a> Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).</li><li>Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+Crick+equations+for+modeling+noncanonical+coiled+coils.">Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils.</a> J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).</li><li>Lupas, A. N., Gruber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+alpha-helical+coiled+coils.">The structure of alpha-helical coiled coils.</a> Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).</li><li>Hernandez Alvarez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+expression+system+for+protein+crystallization+using+trimeric+coiled-coil+adaptors.">A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors.</a> Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).</li><li>Slabinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+protein+structure+determination--lessons+from+structural+genomics.">The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics.</a> Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).</li><li>Slabinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XtalPred:+a+web+server+for+prediction+of+protein+crystallizability.">XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability.</a> Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).</li><li>Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shroom+induces+apical+constriction+and+is+required+for+hingepoint+formation+during+neural+tube+closure.">Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure.</a> Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).</li><li>Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shroom+regulates+epithelial+cell+shape+via+the+apical+positioning+of+an+actomyosin+network.">Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).</li><li>Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+actin-dependent+localization+modulates+the+evolutionarily+conserved+activity+of+Shroom+family+proteins.">Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins.</a> J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).</li><li>Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+isoforms+of+drosophila+shroom+define+spatial+requirements+for+the+induction+of+apical+constriction.">Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction.</a> Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).</li><li>Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shroom2+regulates+contractility+to+control+endothelial+morphogenesis.">Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis.</a> Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).</li><li>Das, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+Shroom3+and+Rho-kinase+is+required+for+neural+tube+morphogenesis+in+mice.">The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice.</a> Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).</li><li>Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+interaction+of+ROCKI+with+the+switch+regions+of+RhoA.">Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA.</a> J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).</li><li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+highly+conserved+domain+of+Rock1+required+for+Shroom-mediated+regulation+of+cell+morphology.">Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology.</a> PLoS One. 8 (12), e81075 (2013).</li><li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+Shroom+domain+2+reveals+a+three-segmented+coiled-coil+required+for+dimerization,+Rock+binding,+and+apical+constriction.">Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction.</a> Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).</li><li>Tu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+coiled-coil+domain+from+human+ROCK+I.">Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I.</a> PLoS One. 6 (3), e18080 (2011).</li><li>Sievers, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+scalable+generation+of+high-quality+protein+multiple+sequence+alignments+using+Clustal+Omega.">Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.</a> Mol Syst Biol. 7, 539 (2011).</li><li>Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels.">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li><li>Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+protein+staining+in+polyacrylamide+gels+with+a+new+type+of+Coomassie+Brilliant+Blue.">An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue.</a> Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+clear-native+PAGE.">Advantages and limitations of clear-native PAGE.</a> Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).</li><li>Jungbauer, A., Hahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-exchange+chromatography.">Ion-exchange chromatography.</a> Methods Enzymol. 463, 349-371 (2009).</li><li>Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+analysis+of+the+effects+of+reversible+dimerization+in+size+exclusion+chromatography.">Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography.</a> J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).</li><li>Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+historical+perspective+on+protein+crystallization+from+1840+to+the+present+day.">A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day.</a> FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).</li><li>Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGenTHREADER+and+pDomTHREADER:+new+methods+for+improved+protein+fold+recognition+and+superfamily+discrimination.">pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).</li><li>Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+protein+domain+assignment+from+amino+acid+sequence+using+predicted+secondary+structure.">Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure.</a> Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).</li><li>Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phyre2+web+portal+for+protein+modeling,+prediction+and+analysis.">The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis.</a> Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).</li><li>Elsliger, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JCSG+high-throughput+structural+biology+pipeline.">The JCSG high-throughput structural biology pipeline.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).</li><li>Bach, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+maltose-binding+protein+as+a+molecular+chaperone+for+recombinant+intracellular+cytoplasmic+single-chain+antibodies.">Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies.</a> J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).</li><li>Strong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+structural+genomics+of+complexes:+crystal+structure+of+a+PE/PPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li><li>Heras, B., Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-crystallization+treatments+for+improving+diffraction+quality+of+protein+crystals.">Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada açıklanan protokol kullanıcı kristalleşme kolaylaştırmak için büyük sarmal-coil proteinler içinde etki alanı sınırları belirlemeye yardımcı olmak için tasarlanmıştır. protokol potansiyel etki alanı sınırları bir dizi oluşturmak için hesaplamalı tahminler ve diğer kaynaklardan gelen verilerin çeşitli bütünsel dahil dayanır. Bu hızlı ve ucuz ve daha bu ilk hipotezleri geliştirmek için kullanılan biyokimyasal deneyler bir dizi tarafından takip edilmektedir. Bu yaklaşımı kul...

X-ışını kristalografisi yoluyla yapı tayini modern biyolojinin her alanda temel katkılarda bulunmuştur; yaşamı destekleyen ve çeşitli bağlamlarda birbirleriyle nasıl etkileşimde makromoleküllerin bir atom bir görünüm sağlayan; Hastalık ve sağlayan fırsatlar rasyonel hastalığı tedavi etmek için ilaçlar tasarlamaya neden mekanizmaları anlamak için bize izin. Kristalografi uzun makromoleküler yapısını belirlemek için baskın deneysel teknik olmuştur ve şu anda yapısal veritabanı (www.rcsb.org) içinde% 89.3 hesapları vardır. Bu teknik çok yüksek çözünürlükte potansiyeli dahil olmak üzere birçok avantajı vardır, bir boyutlarda geniş, nispeten kolay veri toplama ve makromolekül çözücü yanı sıra ligandlar nasıl etkileşimde görselleştirmek için fırsat makromolekülleri görselleştirmek için yeteneği. Rekombinant protein ifadesi 1,2, pur sayısız teknolojik gelişmelere rağmenification 3 ve bu sistemleri 4, kristalografik süreçte tek en büyük engel oluşturmak için kullanılan moleküler biyoloji kırınım kaliteli kristaller büyümeye yeteneği kalır. Bu büyük sarmal-coil etki içermeyen protein için özellikle doğrudur olmuştur. Tüm amino asitler kadar 5%, bu çok ortak yapısal özelliği 7 hale sarılmış bobinler 5,6 içinde bulunan olduğu tahmin, ancak bu proteinler çoğu zaman arındırmak ve küresel proteinlerin 8-10 den kristalize etmek daha zordur edilmiştir . Bu ayrıca sarılmış bobin etki genellikle bu nedenle doğru sık kristalleşme için zararlı olduğunu yapılandırılmamış veya esnek dizisinin oluşumunu önlemek için önemlidir bu alanların sınırlarını tahmin, daha büyük bir proteinin kapsamında bulunduğu gerçeğine ile birleşir. Burada birleştiren kavramsal bir çerçeve sunmak web tabanlı hesaplama experimenta analizleryapısal çalışmalar ve nasıl hazırlamak ve kristalleşme girişimleri öncesinde protein örneklerinin karakterize etmek için protein parçası (ler) nasıl seçileceğini: tezgah l veri kristalografik sürecinin ilk aşamalarında dahil yoluyla kılavuz kullanıcılara yardımcı olmak için. Biz büyük sarmal-coil alanlarını içeren iki protein üzerinde analizimizi odaklanmak, Shroom (SHRM) ve Rho-kinaz (Rock). Her ikisi de halkalaştırılmış halka alanları içerir ve biyolojik olarak alakalı kompleks 11-16 oluşturulması için bilinen bu proteinleri seçilmiştir. Shroom ve Rho-kinaz (Rock), sırasıyla sarılmış-bobinin ~ 200 ve 680 artıkları tahmin edilen, çok sayıda kısımları, yapısal olarak 17-20 karakterize edilmiştir. Burada tarif edilen yöntem, hızlı bir şekilde kristalleşme için müsait olacak halkalı-halka ihtiva eden protein parçalarını tanımlamak için bir iş akışı sağlanmakta, ancak tarif edilen teknikler kolayca en protein veya protein-kompleksleri için uyarlanmış veya yüksek verimli arayışlara dahil etmek üzere modifiye edilebilirches olarak kullanılabilir. Son olarak, bu yöntemler, pahalı olmayan ve hemen hemen tüm seviyeden kullanıcılar tarafından gerçekleştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3) Rosetta</td><td>Emd Millipore</td><td>70954-3</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Codon Plus</td><td>Agilent Technologies</td><td>230245</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Spectrum Chemical Mfg Corp</td><td>L3008-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA resin</td><td>Life Technologies</td><td>25216</td><td></td></tr><tr><td>SubtilisinA</td><td>Spectrum Chemical Mfg Corp</td><td>S1211-10ML</td><td></td></tr><tr><td>24 well Cryschem Plate</td><td>Hampton research</td><td>HR3-160</td><td></td></tr><tr><td>INTELLI-PLATE &amp;nbsp;96:</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Hampton research</td><td>HR2-591</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Hampton research</td><td>HR2-515</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Hampton research</td><td>HR2-603</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4000</td><td>Hampton research</td><td>HR2-605</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-Clover-mRuby2</td><td>Addgene</td><td>49089</td><td></td></tr><tr><td>Overnight Express Autoinduction System 1</td><td>Emd Millipore</td><td>71300</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeny Broth powder</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12795027&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

combining wet and dry lab techniques to guide the crystallization of large coiled-coil containing proteins

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are found throughout nature, however, because of their physical properties and tendency to aggregate, they are traditionally viewed as being especially difficult to crystallize. Here, we utilize a variety of quick and simple techniques designed to identify a series of possible domain boundaries for a given coiled-coil protein, and then quickly characterize the behavior of these proteins in solution. With the addition of a strongly fluorescent tag (mRuby2), protein characterization is simple and straightforward. The target protein can be readily visualized under normal lighting and can be quantified with the use of an appropriate imager. The goal is to quickly identify candidates that can be removed from the crystallization pipeline because they are unlikely to succeed, affording more time for the best candidates and fewer funds expended on proteins that do not produce crystals. This process can be iterated to incorporate information gained from initial screening efforts, can be adapted for high-throughput expression and purification procedures, and is augmented by robotic screening for crystallization.

Bu sistemde kullanılan iş akışı gösteren bir diyagram Şekil 1&#39;de gösterildiği ve üç ana aşamadan içerir. dizinin Hesaplamalı analiz ilgi sarmal-bobin proteinin etki alanı sınırları konusunda hipotezler geliştirmek için kullanılmaktadır. Shrm2 SD2 alanının açıklamalı bir analizinin bir örneği, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Bu diyagramda, hedef Shroom SD2 adı sitoskeletal regülatör C-terminusunda korunmuş bir alan i...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins at JoVE.com

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

We describe a framework incorporating straightforward biochemical and computational analysis to guide the characterization and crystallization of large coiled-coil domains. This framework can be adapted for globular proteins or extended to incorporate a variety of high-throughput techniques.

Islak ve kuru Lab Teknikleri birleştiren Büyük Spiral-coil İçeren Proteinler kristalleşmesini Kılavuzu

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

combining-wet-dry-lab-techniques-to-guide-crystallization-large

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.9K Görüntüleme.  University of Pittsburgh. We describe a framework incorporating straightforward biochemical and computational analysis to guide the characterization and crystallization of large coiled-coil domains. This framework can be adapted for globular proteins or extended to incorporate a variety of high-throughput techniques.

Video: Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize proteins, DNAs, RNAs, and their complexes can however not be predicted. Employing a broad variety of conditions is a way to increase the yield of quality diffraction crystals. Two fully automated systems have been developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, England, MRC-LMB) that facilitate crystallization screening against 1,920 initial conditions by vapor diffusion in nanoliter droplets. Semi-automated protocols have also been developed to optimize conditions by changing the concentrations of reagents, the pH, or by introducing additives that potentially enhance properties of the resulting crystals. All the corresponding protocols will be described in detail and briefly discussed. Taken together, they enable convenient and highly efficient macromolecular crystallization in a multi-user facility, while giving the users control over key parameters of their experiments.

Automated systems and protocols for the routine preparation of a large number of screens and nanoliter crystallization droplets for vapor diffusion experiments are described and discussed.

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Biyokimya

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Kimya

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to precisely maneuver the nucleation and crystal growth towards desired sizes of protein crystals. The controlled crystallization is based on sample investigation with in situ Dynamic Light Scattering (DLS) while all visual changes in the droplet are monitored online with the help of a microscope coupled to a CCD camera, thus enabling a full investigation of the protein droplet during all stages of crystallization. The use of in situ DLS measurements throughout the entire experiment allows a precise identification of the highly supersaturated protein solution transitioning to a new phase &#8211; the formation of crystal nuclei. By identifying the protein nucleation stage, the crystallization can be optimized from large protein crystals to the production of protein microcrystals. The experimental protocol shows an interactive crystallization approach based on precise automated steps such as precipitant addition, water evaporation for inducing high supersaturation, and sample dilution for slowing induced homogeneous nucleation or reversing phase transitions.

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Here we present a protocol for controlled production of protein microcrystals. The process uses an automated device allowing controlled manipulation of several crystallization parameters. The protein crystallization is carried-out by controlled and automated addition of crystallization solutions while monitoring and investigating the radius distribution of particles in the crystallization droplet.

Situ dinamik ışık saçılma ile birleştiğinde kristalizasyon büyüyen Protein kristalleri kullanarak farklı boyutları ile otomatik

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of these glycoproteins possess immunoglobulin (Ig) folds and are central to immune recognition and regulation. Here, we present a platform for the design, expression and biophysical characterization of the extracellular domain of human B cell receptor CD22. We propose that these approaches are broadly applicable to the characterization of mammalian glycoprotein ectodomains containing Ig domains. Two suspension human embryonic kidney (HEK) cell lines, HEK293F and HEK293S, are used to express glycoproteins harbouring complex and high-mannose glycans, respectively. These recombinant glycoproteins with different glycoforms allow investigating the effect of glycan size and composition on ligand binding. We discuss protocols for studying the kinetics and thermodynamics of glycoprotein binding to biologically relevant ligands and therapeutic antibody candidates. Recombinant glycoproteins produced in HEK293S cells are amenable to crystallization due to glycan homogeneity, reduced flexibility and susceptibility to endoglycosidase H treatment. We present methods for soaking glycoprotein crystals with heavy atoms and small molecules for phase determination and analysis of ligand binding, respectively. The experimental protocols discussed here hold promise for the characterization of mammalian glycoproteins to give insight into their function and investigate the mechanism of action of therapeutics.

We present approaches for the biophysical and structural characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by biolayer interferometry, isothermal titration calorimetry, and X-ray crystallography.

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States alone, an average of 41,400 deaths and 1.86 million hospitalizations are caused by influenza virus infection each year 1. Point mutations in the polymerase basic protein 2 subunit (PB2) have been linked to the adaptation of the viral infection in humans 2. Findings from such studies have revealed the biological significance of PB2 as a virulence factor, thus highlighting its potential as an antiviral drug target.
The structural genomics program put forth by the National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) provides funding to Emerald Bio and three other Pacific Northwest institutions that together make up the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). The SSGCID is dedicated to providing the scientific community with three-dimensional protein structures of NIAID category A-C pathogens. Making such structural information available to the scientific community serves to accelerate structure-based drug design.
Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for new lead discovery by targeting a pathway or an entire protein family. Emerald Bio has developed a high-throughput, multi-target parallel processing pipeline (MTPP) for gene-to-structure determination to support the consortium. Here we describe the protocols used to determine the structure of the PB2 subunit from four different influenza A strains.

Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for lead discovery. The following article highlights how the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease utilizes a multi-target approach for gene-to-structure determination of the PB2 influenza A subunit.

Grip Polimeraz Gen-to-yapı belirlenmesi PB2 alt birimi için çoklu hedef Paralel İşleme Yaklaşımı

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug discovery. To date, X-ray crystallography remains the most successful method for solving three-dimensional protein structures at atomic resolution. With recent advances in serial crystallography, either using X-ray free electron lasers (XFELs) or synchrotron light sources, protein crystallography has progressed to the next frontier, where the ability to acquire time-resolved data provides important mechanistic insights into the behavior of biological molecules at room temperature. This protocol describes a straightforward high-throughput (HTP) workflow for screening crystallization conditions through the use of a 96-well dialysis plate. These plates follow the Society for Biomolecular Screening (SBS) standard and can be easily set up using any standard crystallization laboratory. Once optimal conditions are identified, large quantities of crystals (hundreds of microcrystals) can be produced using the dialyzer. To validate the robustness and versatility of this approach, four different proteins were crystallized, including two membrane proteins.

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

The presented protocol describes a straightforward approach for screening protein crystallization conditions and crystal growth using a 96-well high-throughput dialysis plate. The use of dialyzer tubes for the large-scale growth of microcrystals is also demonstrated for serial crystallography and MicroED applications.

Mikrodiyaliz ile Yüksek Verimli Protein Kristalizasyonu

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Biyoloji

Lipidik Bisellerde ABC Taşıyıcı Membran Proteinlerinin Kristalizasyonu

ABCG5/G8 Crystallization in a Lipidic Bicelle Environment for X-Ray Crystallography

ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute lipid-embedded membrane proteins. Extracting these membrane proteins from the lipid bilayer to an aqueous environment is typically achieved by employing detergents. These detergents disintegrate the lipid bilayer and solubilize the proteins. The intrinsic habitat of membrane proteins within the lipid bilayer poses a challenge in maintaining their stability and uniformity in solution for structural characterization. Bicelles, which comprise a blend of long and short-chain phospholipids and detergents, replicate the natural lipid structure. The utilization of lipid bicelles and detergents serves as a suitable model system for obtaining high-quality diffraction crystals, specifically to determine the high-resolution structure of membrane proteins. Through these synthetic microenvironments, membrane proteins preserve their native conformation and functionality, facilitating the formation of three-dimensional crystals. In this approach, the detergent-solubilized heterodimeric ABCG5/G8 was reintegrated into DMPC/CHAPSO bicelles, supplemented with cholesterol. This setup was employed in the vapor diffusion experimental procedure for protein crystallization.

Yazar Spotlight: İlaç Geliştirmeyi İlerletmek için ABC Taşıyıcı Membran Proteinleri için Bir Bicelle Kristalizasyon Kurulumu 

This protocol describes a setup for the crystallization of the sterol transporter ABCG5/G8. ABCG5/G8 is reconstituted into bicelles for hanging-drop crystallization. The protocol does not require specialized materials or substrates, making it accessible and easy to adapt in any laboratory for determining the protein structure through X-ray crystallography.

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme

ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute lipid-embedded membrane proteins. Extracting these membrane proteins from the lipid bilayer to an ...

Islak ve kuru Lab Teknikleri birleştiren Büyük Spiral-coil İçeren Proteinler kristalleşmesini Kılavuzu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Situ dinamik ışık saçılma ile birleştiğinde kristalizasyon büyüyen Protein kristalleri kullanarak farklı boyutları ile otomatik

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Grip Polimeraz Gen-to-yapı belirlenmesi PB2 alt birimi için çoklu hedef Paralel İşleme Yaklaşımı

Mikrodiyaliz ile Yüksek Verimli Protein Kristalizasyonu

X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme