This work was supported by an Alfred P. Sloan Research Fellowship (to C.-F.C.) and an NIH R01 grant (5R01GM098026-05 to C.-F.C.). We thank David Crowe for access to the advanced infrared imaging system.

Not: fosforla etiketlenmiş DNA sondaları veya işaretlenmiş DNA diğer formları kullanarak EMSA protein ya da hücre özü hazırlanması, protein-DNA bağlanma reaksiyonu ve PAGE jel hazırlanmasında ve yürütülmesinde (Şekil 1A) için aynı protokol paylaşır. önemli farklılıklar DNA etiketleme prosedürleri, post-run jel işleme aşamaları ve algılama yöntemleridir. 1. Jel Hazırlanması <ol><li> mini protein jel sistemi (8.3 cm genişlik x 7.3 cm uzunluk x 0.75 mm kalınlık) kullanılarak, 0.5x TBE (45 mM Tris-Borate, 1mM EDTA) ve% 2.5 gliserol içeren% 5 yerli poliakrilamid jel hazırlayın. <ol><li> Akrilamid / Bis 4 jeller için jel çözeltisi, 30 mL hazırlanması% 30 5 mL karıştırın (37.5: 1), 3 5x TBE (0.45 M Tris-borat, 10 mM EDTA),% 50, 1.5 mL gliserol mL, % 10 amonyum persülfat 300 uL, TEMED 15 uL ve iyice GKD 2 O 20.2 mi. NOT: Akrilamid zararlı ve toksik uygun kişisel koruyucu ekipman ile anlaştım. </li&gt; </ol></li><li> hemen jel çözümü Cast. Polimerizasyon sonra, şeffaf plastik wrap 0.5x TBE önceden ıslatılmış jeller sarın ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> Kızılötesi floresan boya işaretli problar 2. hazırlanması Not: hazırlama, depolama, ve deneyler sırasında uzak mümkün olduğu kadar hafif kızılötesi fluoresan boya etiketli oligonükleotidler tutun. <ol><li> Tasarım ve sipariş oligonükleotidler. <ol><li> ~ 51-mers uzun oligonükleotidi tasarlayın. Not: LIM-4 / SOX-2 sonda uzun oligonükleotid dizisi TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC olup. Uzun oligonükleotidler SAYFA veya HPLC saflaştırma gerekmez. </li><li> 5 &#39;ucunda (5&#39;Dye) ve 37 ° C&#39;nin üzerinde bir erime sıcaklığı, kızılötesi floresan boya modifikasyonuna ~ 14-mer tamamlayıcı kısa oligonükleotidlerin tasarımlanması. NOT: Kısa oligonükleotid dizisi LIM-4 / SOX-2 prob 5&#39;Dye-GGGAGAAGATTTTG olduğunu. 5&#39;Dye etiketli Kısa oligonükleotitlerin asgari sentezi ölçeği 100 nM&#39;dir. Bu nedenle, oligonükleotidler, HPLC saflaştırma gerektirir. </li></ol></li><li> 100 uM nihai konsantrasyona kadar; (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCI, pH 8.0 TE) 1x Tris-EDTA tampon maddesi içinde yeniden süspanse oligonükleotitler. </li><li> Tavlama Kısa (5&#39;Dye) ve Uzun oligonükleotidler. <ol><li> 0.6 5&#39;Dye-Kısa bir oligo (100 uM) uL, uzun oligo (100 uM), 1.2 ul, sodyum 28.2 uL klorür-tris-EDTA tampon maddesi (karıştırın STE: 100 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI, pH 8.0; 1 mM EDTA), bir 1.5 ml bir tüp içinde. </li><li> 5 dakika boyunca kaynayan suda tüp yerleştirin. ısı kaynağı kapatın ve tavlı oligos karanlıkta O / N serin suyu sağlar. </li></ol></li><li> iki şeritli DNA probları yapmak için Klenow DNA polimeraz ile tavlanmış 5&#39;Dye-kısa / uzun oligo 5 &#39;çıkıntısını doldurmak. <ol><li> karıştırılarak reaksiyon hazırlanması5&#39;Dye etiketiyle tavlanmış uzun / kısa oligo 30 uL, 8.5 uL 10x Klenow tamponu, 10 mM dNTP 1.7 ul, 1.7 Klenow uL (3 &#39;-&gt; 5&#39; ekso-) (5 u / uL) ve 0.2 ml PCR tüpünde GKD 2 O 43.1 ul. </li><li> PCR makinesi içerisinde 37 ° C&#39;de 60 dakika kuluçkalayın. </li><li> PCR makinesi içinde 20 dakika süreyle 75 ° C&#39;de reaksiyona ısı devre dışı bırak durdurmak için 3.4 mcL 0.5 M EDTA ekleyin. </li></ol></li><li> 0.1 uM nihai konsantrasyon için STE doldurulmuş sondalar (0.7 uM) ile seyreltilir. </li><li> hazır olana kadar karanlıkta -20 ° C&#39;de saklayın oligos kullanmak için. Oligo Bu durumda, bir yıla kadar depolanabilir. NOT: Mutant bağlayıcı siteleri ile DNA probları oluşturmak için, uzun oligonükleotitlerin mutant sürümleri Klenow ile 5 &#39;çıkıntılar dolgu-in ardından 5&#39;Dye etiketli kısa oligonükleotid ile tavlanır. Bir iplikçik prob kızılötesi floresan ile etiketlenmiş olduğu gösterilmiştirboya boya ile işaretlenmiş, her iki şerit prob sadece% 30 yoğunluğa sahiptir. Sinyal yoğunluğu güçlendirilmelidir, her iki şerit uzun oligo 5 &#39;termini, kızılötesi floresan boyalar ile etiketlenmiş ve kızıl ötesi floresan boya etiketli problar yapmak için tavlanır. </li></ol> Etiketsiz / Soğuk Sondalar 3. Hazırlama (Yarışmacı) Not: tamamlayıcı diziler (Uzun ve Longr) Uzun oligonükleotidler kızılötesi floresan boya etiketli problar ile rekabet analizi için etiketsiz probları yapmak tavlanmıştır. <ol><li> 1.5 ml bir tüp içinde, 100 mikron uzunluğunda 20 uL, 100 uM Longr oligonükleotid 20 uL ve STE 60 uL karıştırın. </li><li> 5 dakika kaynar suda tüp yerleştirin ısı kaynağını kapatın ve tavlanmış oligos gece boyunca soğumaya suyu sağlar. </li></ol> 4. Bağlanma reaksiyonu ve elektroforez <ol><li> 50 uL karıştırılarak 5x bağlama tamponu, 1 mL hazırlanması60 ° C; 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 5 M NaCI, 10 uL; 1 M KCl, MgCl2 1 M 5 uL 200 uL, 0.5 M EDTA, 10 uL, pH 8.0; 1 M DTT 5 uL; GKD 2 O 25, 10 mg / ml BSA uL ve 695 uL Not: 5x bağlama tamponu bölünüp -20 ° C&#39;de saklanabilir. Dikkate alınması gereken diğer bir nokta, farklı transkripsiyon faktörleri bağlama tamponu farklı modifikasyonlara sahip olmasıdır. </li><li> Sağ bağlama reaksiyonları kurmadan önce, 30 80 V amonyum persülfat tüm izlerini silmek için +% 2.5 gliserol 0.5x TBE% 5 yerli poliakrilamid jel önceden işletilen - 60 dk veya geçerli artık zamanla değişir kadar. </li><li> 20 uL nihai hacimde bağlanma reaksiyonuna ayarlayın. <ol><li> 4 5x bağlama tamponu uL, 80 karıştırın - saflaştırılmış protein A 200 ng (örneğin,% 50 gliserol, SOX-2), 0.1 uM Boya ile konjüge edilmiş prob 1 pL (son konsentration: 5 nM) ve GKD 2 O </li><li> İsteğe bağlı: Soğuk sonda rakipler gerektiğinde, çeşitli konsantrasyonlarda soğuk prob (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, vs.) ekleyin. </li><li> İsteğe bağlı: proteinler, A ve B arasındaki etkileşimi (örneğin, SOX-2 ve LIM-4) test edildiğinde, 80 ekleyin - saflaştırılmış protein B 200 ng (yani,% 50 gliserol içinde, LIM-4). </li><li> İsteğe bağlı: nükleer ekstre hazırlanması kullanılan doğrulanması için protein A spesifik bağlanma ise, protein A (örneğin, bir anti-6xHis, anti-FLAG, vs.) özel antikor ekleyin. </li><li> 15 dakika süreyle karanlıkta R / T&#39;de bir gece inkübe edin. </li></ol></li><li> jel üzerine bağlanma reaksiyonunun tüm yük ve istenen mesafeye 10 V / cm jel üzerinde çalıştırıldı. </li></ol> 5. Görüntüleme NOT: Jel gelişmiş kızılötesi görüntüleme sistemi ile cam plakalar doğrudan tarandı. Bu nedenle, jel daha çözülebilir ve tekrar tekrar taranan (Şekil 1C ve <stRong&gt; 2). öncelikle Western lekeleme için yakın kızılötesi floresan görüntüleme sistemi de jel taramak için test edilmiştir, ancak gelişmiş kızılötesi görüntüleme sistemi iyi çözünürlüğe sahip jel tarama başardı. diğer yazılım paketleri kullanılabilir, ancak tarif edilen yöntem, belirli bir kızılötesi görüntüleme yazılımı özgüdür. <ol><li> GKD 2 O ile tarayıcı yatağı temizleyin ve taramadan önce iyice kurutun. jel cam plakalar silerek kurutun ve tarayıcı yatağı üzerinde jel içeren plakalar yerleştirin. </li><li> kızılötesi görüntüleme yazılımını açın ve &#39;Edinme&#39; sekmesine gidin. ince plaka (1 mm) tarayıcı yatağına yerleştirildiğinde, Kanal ayarları kullanmak: 700, Yoğunluk: Otomatik, Çözünürlük: 169 um, Kalite: Orta ve Odak Ofset: 1.5 mm. kalın levha (3 mm) tarayıcı yatağına yerleştirildiğinde, Kanal ayarları kullanmak: 700, Yoğunluk: Otomatik, Çözünürlük: 84 um, Kalite: Orta ve Odak Ofset: 3,5 mm. ofset odak bağlıdırcam levha kalınlığı. </li><li> Jel tarayıcıya kapladığı alanı seçin. Taramayı başlatmak için &#39;Başlat&#39; düğmesine tıklayın. </li><li> elektroforez tekrarlayın ve ayrıca gerektiğinde tarayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylated+probes+in+the+electrophoretic+mobility+shift+assay+to+examine+specific+dsDNA,+ssDNA+or+RNA-protein+interactions.">Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).</li><li>Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+background+problems+in+nonradioactive+northern+and+Southern+blot+analyses+enables+higher+sensitivity+than+32P-based+hybridizations.">Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations.</a> Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).</li><li>Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+two-color+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+detecting+both+nucleic+acids+and+protein+in+gels.">A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels.</a> Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).</li><li>Alqadah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmitotic+diversification+of+olfactory+neuron+types+is+mediated+by+differential+activities+of+the+HMG-box+transcription+factor+SOX-2.">Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2.</a> EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).</li><li>Jullien, N., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LUEGO:+a+cost+and+time+saving+gel+shift+procedure.">LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure.</a> Biotechniques. 51, 267-269 (2011).</li><li>Poulin-Laprade, D., Burrus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+Using+Radiolabeled+DNA+Probes.">Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes.</a> Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).</li><li>Ruscher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+based+non-radioactive+electrophoretic+mobility+shift+assay.">A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay.</a> J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).</li><li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes.">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li><li>Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+goes+beyond+stem+cell+biology.">Sox2 goes beyond stem cell biology.</a> Cell cycle. , (2016).</li><li>Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+competitor+poly(dI-dC).poly(dI-dC)+levels+is+advised+in+DNA-protein+interaction+studies+involving+enriched+nuclear+proteins.">Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins.</a> Biotechniques. 20, 439-444 (1996).</li><li>Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+detection+of+biotin-protein+conjugates+with+a+green+fluorescent+streptavidin+probe.">In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe.</a> Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).</li><li>Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+fluorescent+electrophoretic+mobility+shift+assay+improved+for+the+quantitative+and+multiple+analysis+of+protein-DNA+complexes.">Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).</li><li>Steiner, S., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+electrophoretic+mobility+shift+assay+in+the+analysis+of+DNA-binding+proteins.">Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins.</a> Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

fEMSAs protein-DNA etkileşimlerini araştırmak için etkili bir araçtır ve DNA radyoaktif etiketleme bir alternatiftir. kızıl ötesi boyalar gibi floresan boyalar ticari olarak temin edilebilir, ve radyoaktif bir DNA etiketleme kıyasla çevre dostu daha güvenli ve daha yöntem sağlar. Kızılötesi floresan boya etiketli oligonükleotidler kullanılarak EMSA postrun jel işleme adımlar gerektirir ve bu nedenle diğer DNA etiketleme teknikleri ile karşılaştırıldığında zaman ve maliyet tasarrufu yoktur. ...

EMSA ilgi konusu bir protein ve protein 1 potansiyel hedef sitesi ihtiva eden bir işaretli DNA sondası bir karışımını çözmek için yerel poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) kullanılarak DNA ve protein arasındaki etkileşimi analiz etmek için kullanılır. protein ile bağlı bir DNA probu yavaş serbest DNA probu ile karşılaştırılır ve bir poliakrilamit matris boyunca, geçiş nedenle geciktirilir değiştirecektir. 32 P DNA Radyo-etiketlenmesi EMSA tespiti için baskın bir yöntem olmuştur. biyokimyasal araştırmalarda radyo sınıflandırılmasıyla uygulama yararlı olmasına rağmen, benzer hassasiyetle alternatif DNA etiketleme yöntemleri nedeniyle radyoaktivite taşıma ile ilgili sağlık ve güvenlik risklerine istihdam edilmektedir. Bu alternatif yöntemler, biyotin 2 veya digoksijenin (DIG) 3 (her ikisi de daha sonra kimyasal olarak ışık veren sistemler tarafından tespit edilir) olan DNA konjügasyon PAGE jelleri 4 SYBR yeşil boyama dahilya da jel 5,6 tarayarak DNA floresan boya konjügatlarının doğrudan tespiti. Radyoaktif olarak etiketlenmiş DNA sondaları kullanılarak EMSA çözülmesi jeller postrun otoradyografi filmler içinden işleme veya radyoaktif sinyaller 1,7 tespit etmek için, bir Phosphorimager sistemi gerektirmektedir. Biotin-2 veya DIG-konjuge 3 DNA sondaları kullanılarak EMSA ve jeller de işlenebilir ve uygun bir membran üzerine aktarıldı ve kemiluminesans 6 tarafından tespit edilmelidir. Jelin SYBR yeşil boyama postrun jel boyama ve floresan tarayıcı 4 gerektirir. postrun jel işlem adımları, bu DNA etiketleme teknikleri kullanılarak EMSA için gerekli olması nedeniyle, giderilmiş jel bir kez analiz edilebilir. Bunun aksine, floroforlar ile etiketlenmiş DNA probları Bir tarayıcıdan cam plakalar içindeki jelde tespit edilebilir. Böylece, DNA-protein etkileşimleri izlenebilir ve çalışma sırasında farklı zaman noktalarında birkaç kez deneye tabi olanönemli ölçüde zaman ve maliyeti azaltır. EMSA kullanılmaktadır DNA fluoresan boya konjügatları Cy3 6,8, Cy5 6,8, fluoresein 9 ve kızıl ötesi floresan boyalar 4-6 içerir. Transkripsiyonal düzenleme transkripsiyon faktörleri ve hedef genlerin protein-DNA etkileşim gerektirir. Bu etkileşimlerin Koordinasyon hayvan gelişimi sırasında ortak bir progenitör gelen farklı hücre tipleri oluşturur. Tarafsız bir ileri genetik ekranı Caenorhabditis elegans transkripsiyon faktörü SOX-2 yüksek derecede korunmuş HMG DNA-bağlama etki, yanlış anlamlı bir mutasyon, G73E tespit edilmiştir. , Moleküler morfolojik ve fonksiyonel düzeyde 5,10 at AWC koku nöronlar içine AWB koku nöronların hücre kimliği dönüşümünde mutasyon sonuçları. SOX-2 farklı şekilde bağlam-bağımlı ortak transkripsiyon faktörlerinin ve ilgili etkileşerek AWB ve AWC nöronların terminal farklılaşmasını düzenleyenDNA hedef site 5,10. SOX-2 terminali AWB nöronal farklılaşma LIM-4 (LHX) işbirliği, SOX-2 terminali AWC nöron farklılaşma CEH-36 (OTX / OTD) ile işbirliği yapmaktadır. Lusiferaz raportör testleri gösterirken bu SOX-2 ve mutant SOX-2 G73E proteinleri AWB ve AWC nöronlarda ifade edilen bir promotör etkinleştirmek için transkripsiyonel kofaktörler LIM-4 ve CEH-36 ile işbirliği etkileşimleri vardır. Bununla birlikte, SOX-2 ve mutant SOX-2 G73E promoteri ayırıcı etkinleştirme özelliklerine gösterilir. SOX-2 ve SOX-2 G73E ayırıcı bir DNA bağlama aktivitesi moleküler temelini araştırmak için, fEMSAs bu proteinlerin ve olası hedef alanlan ile yapıldı. İlk olarak, biyoenformatik yaklaşımı lusiferaz tahlilde kullanılan 1 kb promoter bölgesi içinde bağlama dizileri biyolojik ilgili DNA tespit alındı. Birden fazla potansiyel SOX-2 bağlayıcı siteler promotör boyunca mevcut olduğundan, biz odaklıfarazi CEH-36 ya da LIM-4 bağlanma yerleri bitişik ve evrimsel çeşitli nematod türlerinin arasında korunan tahmin SOX-2 bağlayıcı sitelerde. Bu diziler, silinmiş ya da mutasyona uğramış, ve daha sonra AWB veya AWC nöronlarda GFP raportör transgenleri ifade etme aktivitesi için in vivo olarak test edilmiştir. Bu yaklaşım sayesinde, özellikle AWB ve AWC nöronlar, sırasıyla, 5 GFP ekspresyonu için gerekli olan LIM-4 / SOX-2 potansiyeli ve CEH-36 / SOX-2 bitişik hedef sitesi belirlenmiştir. Biz SOX-2 ve SOX-2 LIM-4 / SOX-2 tespit ve CEH-36 / SOX-2 bitişik hedef siteleri ile FEMSA kullanarak G73E bağlayıcı DNA potansiyel farklılıkları araştırıldı. Bizim EMSA analizi SOX-2 G73E kadar etkin WT SOX-2 gibi (AWB gen ifadesi için gerekli olan) LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef sitesi ihtiva eden DNA probu bağlamak olmadığını gösterdi. Bununla birlikte, SOX-2 ve SOX-2 G73E içeren DNA probu bağlama fark vardı CEH-36 / SOX-25,10 (AWC gen ifadesi için gerekli olan) djacent hedef bölge. Bizim FEMSA AWB-to-AWC hücre kimlik dönüşümü fenotip için spesifik DNA bağlama aktivitesini etkileyen SOX-2 G73E mutasyonunun doğaya mekanik bilgiler sağlayabilir analiz eder. Burada, saflaştırılmış 6xHis-SOX-2 veya 6xHis-SOX-2 çözmek için bir vaka çalışması olarak LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef siteleri içeren kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte G73E kullanarak FEMSA optimize edilmiş bir protokol tarif önemli bir biyolojik bir soru.

<table><tbody><tr><td>30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>Acrylamide is harmful and toxic.</td></tr><tr><td>6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)</td><td>ThermoFisher</td><td>MA1-21315</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag M2 antibody&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>5&#039;IRDye700-labeled DNA Oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom DNA oligo</td><td>These are referred to as &quot;5&#039;Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos&quot; in the manuscript. The company will custom synthesize 5&#039; IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100&amp;nbsp;&amp;mu;M scale synthesis and HPLC purification.</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3&#039;--&gt;5&#039; exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LightShif Poly (dI-dC)</td><td>ThermoFisher</td><td>20148E</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&amp;nbsp;Vertical Electrophoresis Cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC&amp;nbsp;</td><td>This is referred to as a &#039;mini protein gel system&#039; in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size.</td></tr><tr><td>Odyssey CLx Infrared Imaging System</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Odyssey CLx Infrared Imagng System</td><td>This is referred to as an &#039;advanced infrared imaging system&#039; in the manuscript.</td></tr><tr><td>Odyssey Fc Imaging System&amp;nbsp;</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System</td><td>This is referred as a &#039;near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots&#039; in the manuscript.</td></tr><tr><td>Image Studio software (version 4.0)</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Image Studio software&amp;nbsp;</td><td>This is referred to as a &#039;particular imaging software&#039; in the manuscript.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3756-25G</td><td></td></tr><tr><td>6x Orange loading dye</td><td></td><td></td><td>0.25% Orange G; 30% Glycerol</td></tr><tr><td>0.5x TBE</td><td></td><td></td><td>45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x TE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x STE</td><td></td><td></td><td>100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>5x Binding Buffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 &amp;#956;g/mL BSA</td></tr></tbody></table>

an optimized protocol for electrophoretic mobility shift assay using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides

Elektroforetik hareket kayma deneyleri (EMSA) proteinler ve hedef DNA dizileri arasındaki etkileşimi karakterize eden bir aracı bir araçtır. Radyoaktivite EMSA DNA etiketleme baskın yöntem olmuştur. Ancak, floresan boyalar ve tarama yöntemleri son gelişmeler, zaman tasarrufu maliyetini azaltarak ve güvenliğini geliştirmek, kolay kullanım avantajları için radyoaktivite alternatif olarak DNA floresan etiketleme kullanımı teşvik etmiştir. Biz son zamanlarda başarıyla önemli bir biyolojik soruyu ele almak için floresan EMSA (FEMSA) kullandık. Bizim FEMSA analizi yüksek derecede korunmuş HMG transkripsiyon faktörü SOX-2 koku nöron tipi çeşitlendirilmesi üzerinde, bir missense mutasyon, G73E yürürlüğe mekanik görmemizi sağlar. Mutantını SOX-2 G73E proteini ve böylece koku nöron kimlik dönüşümü neden spesifik DNA bağlanma aktivitesi değiştirir bulundu. Burada, mevcut olan bir iyileştirilmiş ve adım adım protokolü maliyetliFEMSA biyolojik örnek olarak LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef sitesi ve saflaştırılmış SOX-2 proteinleri (WT ve mutant SOX-2 G73E proteinler) içeren kızıl ötesi floresan boya etiketli oligonükleotidler kullanılarak.

Portakal Rengi G yükleme boyası (6x 100 mL% 30 gliserol içinde 0.12 g turuncu G) Electrophoresis ilerlemesini görselleştirmek için yükleme öncesi bağlanma reaksiyona ilave edilebilir. Bromofenol mavisi gibi diğer yükleme boyalar tarama sırasında tespit edilir ve bu nedenle görüntü analizi (Şekil 1B) müdahale edilir. EMSA Bazı durumlarda, nükleer ekstre hazırlanması kullanılan, özellikle...

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides at JoVE.com

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar.

Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

an-optimized-protocol-for-electrophoretic-mobility-shift-assay-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15.5K Görüntüleme.  University of Illinois at Chicago.  Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar. 

Video: An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of RNA-protein interactions. These interactions have been traditionally analyzed with polyacrylamide gels generated between two glass plates and samples electrophoresed vertically. However, polyacrylamide gels cast in trays and electrophoresed horizontally offers several advantages. For example, horizontal gels used to analyze complexes between fluorescent RNA substrates and specific proteins can be imaged multiple times as electrophoresis progresses. This provides the unique opportunity to monitor RNA-protein complexes at several points during the experiment. In addition, horizontal gel electrophoresis makes it possible to analyze many samples in parallel. This can greatly facilitate time course experiments as well as analyzing multiple reactions simultaneously to compare different components and conditions. Here we provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis for analyzing RNA-Protein interactions.

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool for analyzing RNA-protein interactions. Traditionally most experiments have used vertical gels. However, horizontal gels provide several advantages, such as the opportunity to monitor complexes during electrophoresis. We provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis.

Protein-RNA Komplekslerinin Geliştirilmiş Algılaması için Yatay Jel Elektroforezi

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Biyokimya

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

DNA Elektroforez tiyazol turuncu etidyum bromür veya alternatif boya yerine kullanma

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Sentetik Oligonükleotidler Kullanılarak DNA Enzimleri için Deneyler

Using Modified Synthetic Oligonucleotides to Assay Nucleic Acid-Metabolizing Enzymes

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to characterize diverse properties of nucleic acid metabolizing enzymes that can be run in any standard molecular biology lab. The use of fluorescent labels has made these methods accessible to researchers with standard PAGE electrophoresis equipment and a fluorescent-enabled imager, without using radioactive materials or requiring a lab designed for the storage and preparation of radioactive materials, i.e., a Hot Lab. The optional addition of standard modifications such as phosphorylation can simplify assay setup, while the specific incorporation of modified nucleotides that mimic DNA damages or intermediates can be used to probe specific aspects of enzyme behavior. Here, the design and execution of assays to interrogate several aspects of DNA processing by enzymes using commercially available synthetic oligonucleotides are demonstrated. These include the ability of ligases to join or nucleases to degrade different DNA and RNA hybrid structures, differential cofactor usage by the DNA ligase, and evaluation of the DNA-binding capacity of enzymes. Factors to consider when designing synthetic nucleotide substrates are discussed, and a basic set of oligonucleotides that can be used for a range of nucleic acid ligase, polymerase, and nuclease enzyme assays are provided.

Yazar Spotlight: DNA Onarımını ve Replikasyonunu Anlamak için Ekstremofillerden ve Yaygın Patojenlerden Yeni Enzimlerin Karakterize Edilmesi

Here, a protocol for assaying nucleic acid metabolizing enzymes is presented, using examples of ligase, nuclease, and polymerase enzymes. The assay utilizes fluorescently labeled and unlabeled oligonucleotides that can be combined to form duplexes mimicking RNA and/or DNA damages or pathway intermediates, allowing for the characterization of enzyme behavior.

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to ...

<meta charset="utf8"></head><body>OPTIR-FISH Kullanarak Hücre Tanımlama ve Metabolik Analiz için Kapsamlı Protokol

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we present a comprehensive protocol for simultaneous cell identification and metabolic analysis with the OPTIR-FISH platform by combining rRNA-tagged FISH probes and isotope-labeled substrates. Fluorescence imaging provides cell identification by the specific binding of rRNA-tagged FISH probes, while OPTIR imaging provides metabolic activities within single cells by isotope-induced red shift on OPTIR spectra. Using bacteria cultured with 13C-glucose as a test bed, the protocol outlines microbial culture with isotopic labeling, fluorescence in situ hybridization (FISH), sample preparation, optimization of the OPTIR-FISH imaging setup, and data acquisition. We also demonstrate how to perform image analysis and interpret spectral data at the single-cell level with high throughput. This protocol&#39;s standardized and detailed nature will greatly facilitate its adoption by researchers from diverse backgrounds and disciplines within the broad single-cell metabolism research community.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Karmaşık Ortamlarda Tek Hücreli Metabolik ve Kimlik Analizi için Entegre OPTIR-FISH

Here, we present a protocol using optical photothermal infrared-fluorescence in situ hybridization (OPTIR-FISH), also known as mid-infrared photothermal-FISH (MIP-FISH), to identify individual cells and understand their metabolism. This methodology can be applied broadly for diverse applications, including mapping cellular metabolism with single-cell resolution.

Optik Fototermal Kızılötesi-Floresan Yerinde Hibridizasyon (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

Biyomühendislik

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron regulatory proteins, IRP1 and IRP2. They bind to iron responsive elements (IREs) within the untranslated regions (UTRs) of several target mRNAs, thereby controlling the mRNAs translation or stability. IRE/IRP interactions have been widely studied by EMSA. Here, we describe the EMSA protocol for analyzing the IRE-binding activity of IRP1 and IRP2, which can be generalized to assess the activity of other RNA-binding proteins as well. A crude protein lysate containing an RNA-binding protein, or a purified preparation of this protein, is incubated with an excess of32 P-labeled RNA probe, allowing for complex formation. Heparin is added to preclude non-specific protein to probe binding. Subsequently, the mixture is analyzed by non-denaturing electrophoresis on a polyacrylamide gel. The free probe migrates fast, while the RNA/protein complex exhibits retarded mobility; hence, the procedure is also called &#8220;gel retardation&#8221; or &#8220;bandshift&#8221; assay. After completion of the electrophoresis, the gel is dried and RNA/protein complexes, as well as free probe, are detected by autoradiography. The overall goal of the protocol is to detect and quantify IRE/IRP and other RNA/protein interactions. Moreover, EMSA can also be used to determine specificity, binding affinity, and stoichiometry of the RNA/protein interaction under investigation.

Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Here we present a protocol to analyze RNA/protein interactions. The electrophoretic mobility shift assay (EMSA) is based on the differential migration of RNA/protein complexes and free RNA during native gel electrophoresis. By using a radiolabeled RNA probe, RNA/protein complexes can be visualized by autoradiography.

IRE / IRP Örnek: RNA-protein Etkileşimleri Çalışmaları elektroforetik hareketlilik Shift Testi (EMSA)

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Protein-RNA Komplekslerinin Geliştirilmiş Algılaması için Yatay Jel Elektroforezi

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

DNA Elektroforez tiyazol turuncu etidyum bromür veya alternatif boya yerine kullanma

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Optik Fototermal Kızılötesi-Floresan Yerinde Hibridizasyon (OPTIR-FISH)

Optik Fototermal Kızılötesi-Floresan Yerinde Hibridizasyon (OPTIR-FISH)

Optik Fototermal Kızılötesi-Floresan Yerinde Hibridizasyon (OPTIR-FISH)

IRE / IRP Örnek: RNA-protein Etkileşimleri Çalışmaları elektroforetik hareketlilik Shift Testi (EMSA)