Name: visualization and quantification of the cell-free layer in arterioles of the rat cremaster muscle
Uploaded: 2016-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle at JoVE.com

This work was supported by National Medical Research Council (NMRC)/Cooperative Basic Research Grant (CBRG)/0078/2014.

Bu çalışma Singapur Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (onaylanan protokole hayır. R15-0225) Ulusal Üniversitesi ile uyumludur. Hayvan Modeli 1. Cerrahi Hazırlık <ol><li> Gemi kanülasyonlar <ol><li> Erkek bir Sprague-Dawley sıçanları anestezi - ağırlığında (6 7 haftalık), (203 ± 20) intraperitonal yoluyla ketamin (37.5 mg / ml) ve ksilazin (5 mg / ml) kokteyli ile gr (ip) enjeksiyonu (2 ml / kg) . İğneyi tekrarlamak ya da enjeksiyondan sonra şırınga çıkarmayın. </li><li> hayvana anestezi yapıldıktan sonra (kıstırma ayak ile teyit), 37 ° C de vücut ısısını korumak için bir ısıtma pedi üzerine yerleştirin. Yavaşça skapula, ön serviks, alt karın, medial arka bacak ve skrotal kese saç tıraş. Yavaşça yapışkanlı kağıt bantlar kullanarak bacakları dizginlemek. </li><li> Mikrodiseksiyon makas ve açılı forseps ile izlerken kullanarak tüm cerrahi prosedürleri gerçekleştirinBir stereomikroskop. Ameliyat sırasında yaralanmayı önlemek için delinmeye karşı dayanıklı bir tepsiye tüm keskin cerrahi aletler yerleştirin. </li><li> kesi yapmadan önce tüm cerrahi siteleri alternatif iyot ve% 70 alkol ile 3 kez fırçalayın. 30 IU / ml heparin tuzlu su çözeltisi ile tüm kateterler yıkayın. </li><li> Sağ juguler ven üzerinde cerrahi makas kullanarak skapula üzerinde 1,5 cm orta hat cilt kesi - 1 yapın. juguler ven ortaya çıkarmak için künt diseksiyon ile fasya ayırın ve bir polietilen tüp (PE-50) 5-0 ipek sütür kullanılarak heparin tuzlu su ile dolu olan cannulate. Yan anestezi infüze gerektiğinde (1/3 başlangıç ​​dozunun 1/2, damar içine (IV)) cerrahi ve deney süresince. </li><li> havayolu açıklığını korumak için trakeostomi gerçekleştirin. anterior servikal bölgede 1,5 cm kesi - 1 yapın. yerine kateteri sabitlemek için 2-0 ipek dikişlerle bir polietilen tüp (PE-205) kullanılarak trakea cannulate. </li><li> Kan basıncını izlemekFemoral arter kanülasyonu yoluyla. arka bacak sol medial yüzeyi 1.5 cm&#39;lik kesi - 1 yapın. künt diseksiyon ile femoral arter ayırın. heparin tuz çözeltisi 5-0 ipek sütür kullanılarak doldurulmuş bir polietilen boru (PE-10), femoral arter kanüle. </li></ol></li><li> Cremaster kas Hazırlama ve Akış Görselleştirme <ol><li> bunu genişletmek için skrotal kese apeks yoluyla 5-0 ipek sütür yerleştirin. skrotal kese ventral yüzeyi boyunca bir kesi yapmak. maruz kas, düzenli sıcak izotonik solüsyonu (pH 7.4 37 ° C) uygulanır. </li><li> dikkatle ve iyice bağ dokuları çevreleyen pamuk uçlu aplikatör kullanarak kaldırın. </li><li> cremaster kas apeks yoluyla 5-0 ipek sütür yerleştirin. aynı uzunluktaki iki parçaya dikiş kesin ve her iki tarafta bir düğüm. İki düğüm arasındaki kas kesin ve hafifçe dikiş çekerek özelleştirilmiş şeffaf pleksiglas platformu üzerine germek. düzeltmekmavi yapışma ile platform üzerine sütür sonu. NOT: bağ dokuları çevreleyen iyice çıkarılması optimum görüntü kontrastını elde önemlidir. </li><li> 5 ila 6 tespitler yapılana kadar adımı tekrarlayın 1.2.3. Dikkatle yüksek sıcaklık koter kullanılarak Epididimden cremaster kasını çıkarın. doku kaybını önlemek için maruz kas sıcak izotonik Superfuse. <ol><li> gazlı katlanmış parçalar ile cremaster kasını Surround. polivinil film ile maruz kas örtün. Film ile gazlı bez parçaları su daldırma mikroskop objektif (Şekil 1A) için sıcak izotonik çözüm tutmak için sığ bir havza oluşturur. </li></ol></li><li> Intravital mikroskobu (Şekil 1C) hayvan sahneye hayvan aktarın. Sürekli basıncı izleme (Şekil 1E) için fizyolojik bir veri toplama sistemine arteriyel kanülasyon bağlayın. </li><li> kas temperat korumakHayvan platforma (Şekil 1B) altındaki bağlı bir ısıtma elemanı ile 35 ° C &#39;de ure. Isıtma elemanı (Şekil 1D) güç kontrolörü negatif geribildirim sağlamak için kas yanında bir sıcaklık probu yerleştirin. </li><li> 15 dk çevre ile dengelenmesi için sahnede hayvan bırakın. </li><li> 40X su daldırma objektif ve uzun çalışma kondansatör ile bir intravital mikroskop altında kan akışını gözünüzde canlandırın. </li><li> dallanmamış arteriolden RBC çekirdek arasında net bir görüntü odak ve kontrast dayalı (&lt;60 mikron) seçin, CFL ve damar duvarları, sırayla kan damarı çap düzleminde mikroskop odaklanmak. dikey damar duvarını hizalamak için mikroskop üzerine monte kamera döndürün. </li><li> 1 saniye 3000 / sn kare hızında yüksek hızlı video kamera kullanılarak kan akışını kaydedin. görüntü kalitesini korumak için sıkıştırılmamış 8-bit gri tonlama AVI biçimi olarak kaydedilen video kaydedin. NOT:<html> / Sn 3.000 kare en az kayıt hızı flüoresan ölçümü fizyolojik arteriolar akış koşulları altında en az bir defa her RBC ile gerçekleştirilebilir sağlamak için önerilir. </li><li> Eritrosit ve plazma arasındaki kontrastı arttırmak için 510 nm - 310 394 nm ve spektral bandpass dalga boyunda tepe şanzıman ile mavi filtre kullanın. NOT: mikroskobik ışık kaynağı (100 W halojen lamba) mavi filtreden geçen ışık spektrumu herhangi bir potansiyel doku hasarı önlemek için düşük ışık yoğunluğu olduğundan emin olun. </li><li> Deneyin sonunda, pentobarbital sodyum, aşırı dozda hayvan euthanize. </li></ol></li></ol> 2. Görüntü Analizi <ol><li> Flüoresan genişliği ölçümü için Ön işleme <ol><li> MATLAB açın ve &#39;CFL_pre.m&#39; dosyasını çalıştırın. (Bu ve diğer MATLAB dosyaları bulunabilirip &quot;&gt; Yan MATLAB Arşivi.) </li><li> analiz etmek, video dosyasını seçmek için &#39;Açık dosya&#39; tıklayın. </li><li> dikey damar duvarları hizalamak için &#39;rotasyon&#39; sürgüsünü ayarlayın. NOT: Kullanıcılar &#39;Izgara On&#39; radyo düğmesini seçerek damar uyum için yardımcı ızgara çizgileri görüntüler ve &#39;Zoom&#39; kaydırıcıyı kaydırarak görüntüyü yakınlaştırma düzeyini ayarlayabilirsiniz. </li><li> damar uyumu onaylamak için &#39;Onayla Düzenlenmesi&#39; butonuna tıklayın. </li><li> Faiz (ROI) bölgeyi tanımlamak için &#39;Set ROI ekine&#39; butonuna tıklayın. hizalanmış görüntü bir pop-up penceresi görüntülenir. görüntü üzerinde dikdörtgen hedefi ayarlayın ve çift ROI onaylamak için tıklayın. Görüntünün kırpma gerekli değilse bu adımı atlayın. NOT: Sadece gemiden CFL genişliği analiz etmek ROI tek bir gemi bulunmaktadır. Gerekirse, orijinal forma görüntüyü geri yüklemek için &#39;Reset Resim&#39; düğmesine tıklayın. </li><li> Tıkla9; &#39;(bmp&#39; biçiminde ardışık bit haritası görüntüleri 8-bit gri tonlama) içine tüm düzenlenmiş video kareleri ayıklamak için düğmeye &#39;Images ayıklayın. çıkarılan görüntüler seçilen video dosyası ile aynı adı taşıyan klasörde bulunabilir. </li></ol></li><li> Flüoresan genişliğinin ölçümü <ol><li> MATLAB açın ve &#39;CFL_measure.m&#39; dosyasını çalıştırın. </li><li> çıkarılan görüntüleri içeren klasörü seçmek için &#39;Klasör seç&#39; seçeneğini tıklayın. </li><li> görüntüleri içeren klasöre tıklayın ve &#39;Klasör seç&#39; seçeneğini tıklayın. klasördeki ilk görüntü karesi yüklenen ve &#39;Resim Histogram&#39; panelinde gri yoğunluk Histogram ile birlikte, &#39;Gri tonlama görüntü&#39; panelinde gösterilir. </li><li> analizi, aksi takdirde ilk görüntü karesi seçilecektir gerçekleştirmek için liste kutusundan istenen görüntü çerçevesini seçin. </li><li> yerde belirlenir görüntüde, iç damar duvarını tanımlamak için &#39;Gemi Duvarlar Bul&#39; tıklayın neredekaranlıktan ışık yoğunluğu profil tepe transit iki piksel üzerinde ışık. </li><li> &#39;Tuz ve biber&#39; gürültüyü azaltmak için görüntüye medyan filtre uygulamak için &#39;Medyan Filtre&#39; kontrol edin. </li><li> görüntü kontrastını arttırmak için dijital görüntü yoğunlukları ayarlamak için &#39;Otomatik Kontrast&#39; kontrol edin. </li><li> τ üzerinde gri düzeyleri (CFL) ve τ altında gri düzeyleri (RBC çekirdek) siyah pikseller beyaz piksel - iki sınıfa gri düzeyleri böler otomatik olarak bir eşik değeri (τ) belirleyen liste kutusunda bir eşik algoritmasını seçin. NOT: Otomatik-eşikleme algoritması hiçbiri uygun bir görüntü eşikleme sağlıyorsa alternatif bir yöntem olarak, manuel eşikleme kullanın. &#39;Elle&#39; radyo düğmesini tıklayın ve manuel eşikleme değeri tanımlamak için kaydırma çubuğunu ayarlayın. </li><li> (Çözünürlük, CFL genişlikleri mekansal değişimini ölçen &#39;piksel çözünürlük&#39; kutusuna piksel çözünürlüğünü girmek içinBu deney düzeneği ile 0.42 mm / piksel) idi. </li><li> CFL genişlikleri mekansal değişimi elde etmek için &#39;Hesapla&#39; düğmesine tıklayın. bir tablo formatında CFL genişliği veri vermek için &#39;İhracat .csv tıklayın. </li><li> kare hızı bilgilerini, geminin boyunca belirli bir analiz hattında CFL genişlikleri zamansal değişimini ölçen &#39;Temporal Varyasyonu&#39; radyo düğmesini tıklayın ve girmek için (bu deney düzeneği kullanılan kare hızını 3000 kare / sn idi). </li><li> sırasıyla, &#39;Frame başlat&#39; ve &#39;Son Frame&#39; kutulara ilk kareyi ve analiz için görüntülerin son karesini girin. </li><li> &#39;Analiz Line&#39; kaydırma çubuğunu kaydırarak geminin boyunca analiz hattının pozisyonunu seçin. &#39;Grayscale görüntü&#39; ve &#39;İkili görüntü&#39; hem gösterilmiştir analiz hattının, konumunu onaylayın. </li><li> CFL genişlikleri zamansal değişimini elde etmek için &#39;hesapla&#39; tıklayın. click &#39;İhracat .csv&#39; bir tablo formatında CFL genişliği veri vermek için. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+variations+of+cell-free+layer+width+in+arterioles.">Temporal and spatial variations of cell-free layer width in arterioles.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1526-H1535 (2007).</li><li>Ong, P. K., Namgung, B., Johnson, P. C., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+erythrocyte+aggregation+and+flow+rate+on+cell-free+layer+formation+in+arterioles.">Effect of erythrocyte aggregation and flow rate on cell-free layer formation in arterioles.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H1870-H1878 (2010).</li><li>Namgung, B., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+uneven+red+cell+influx+on+formation+of+cell-free+layer+in+small+venules.">Effect of uneven red cell influx on formation of cell-free layer in small venules.</a> Microvasc Res. 92, 19-24 (2014).</li><li>Goldsmith, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Microcirculatory+Society.">The Microcirculatory Society.</a> Eugene M. Landis Award Lecture. The Microrheology of Human-Blood. Microvasc Res. 31 (2), 121-142 (1986).</li><li>Buerk, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+We+Model+Nitric+Oxide+Biotransport?+A+Survey+of+Mathematical+Models+for+a+Simple+Diatomic+Molecule+with+Surprisingly+Complex+Biological+Activities.">Can We Model Nitric Oxide Biotransport? A Survey of Mathematical Models for a Simple Diatomic Molecule with Surprisingly Complex Biological Activities.</a> Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 109-143 (2001).</li><li>Tateishi, N., Suzuki, Y., Soutani, M., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+dynamics+of+erythrocytes+in+microvessels+of+isolated+rabbit+mesentery:+cell-free+layer+and+flow+resistance.">Flow dynamics of erythrocytes in microvessels of isolated rabbit mesentery: cell-free layer and flow resistance.</a> J Biomech. 27 (9), 1119-1125 (1994).</li><li>Ong, P. K., Cho, S., Namgung, B., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cell-free+layer+formation+on+NO/O2+bioavailability+in+small+arterioles.">Effects of cell-free layer formation on NO/O2 bioavailability in small arterioles.</a> Microvasc Res. 83 (2), 168-177 (2012).</li><li>Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+NO+bioavailability+by+temporal+variation+of+the+cell-free+layer+width+in+small+arterioles.">Modulation of NO bioavailability by temporal variation of the cell-free layer width in small arterioles.</a> Ann Biomed Eng. 39 (3), 1012-1023 (2011).</li><li>Park, S. W., Intaglietta, M., Tartakovsky, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+stochastic+fluctuations+in+the+cell+free+layer+on+nitric+oxide+bioavailability.">Impact of stochastic fluctuations in the cell free layer on nitric oxide bioavailability.</a> Front Comput Neurosci. 9, 131 (2015).</li><li>Ng, Y. C., Namgung, B., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+transient+model+for+prediction+of+arteriolar+NO/O2+modulation+by+spatiotemporal+variations+in+cell-free+layer+width.">Two-dimensional transient model for prediction of arteriolar NO/O2 modulation by spatiotemporal variations in cell-free layer width.</a> Microvasc Res. 97, 88-97 (2015).</li><li>Sriram, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+small+changes+in+hematocrit+on+nitric+oxide+transport+in+arterioles.">The effect of small changes in hematocrit on nitric oxide transport in arterioles.</a> Antioxid Redox Sign. 14 (2), 175-185 (2011).</li><li>Hightower, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+cardiovascular+regulation+by+the+blood/endothelium+cell-free+layer.">Integration of cardiovascular regulation by the blood/endothelium cell-free layer.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (4), 458-470 (2011).</li><li>Ng, Y. C., Namgung, B., Leo, H. L., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+aggregation+may+promote+uneven+spatial+distribution+of+NO/O+in+the+downstream+vessel+of+arteriolar+bifurcations.">Erythrocyte aggregation may promote uneven spatial distribution of NO/O in the downstream vessel of arteriolar bifurcations.</a> J Biomech. , (2015).</li><li>Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+variations+of+the+cell-free+layer+width+may+enhance+NO+bioavailability+in+small+arterioles:+Effects+of+erythrocyte+aggregation.">Temporal variations of the cell-free layer width may enhance NO bioavailability in small arterioles: Effects of erythrocyte aggregation.</a> Microvasc Res. 81 (3), 303-312 (2011).</li><li>Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+rheology+in+microcirculation.">Erythrocyte rheology in microcirculation.</a> Jpn J Physiol. 46 (1), 1-14 (1996).</li><li>Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Evaluation+of+Flow+Dynamics+of+Erythrocytes+in+Microvessels+-+Influence+of+Erythrocyte+Aggregation.">Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels - Influence of Erythrocyte Aggregation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), H1959-H1965 (1995).</li><li>Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-based+method+for+determination+of+the+cell-free+layer+width+in+microcirculation.">A computer-based method for determination of the cell-free layer width in microcirculation.</a> Microcirculation. 13 (3), 199-207 (2006).</li><li>Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Evaluation+of+Flow+Dynamics+of+Erythrocytes+in+Microvessels.">Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels.</a> Influence of Erythrocyte Aggregation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), H1959-H1965 (1995).</li><li>Namgung, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+histogram-based+thresholding+methods+for+the+determination+of+cell-free+layer+width+in+small+blood+vessels.">A comparative study of histogram-based thresholding methods for the determination of cell-free layer width in small blood vessels.</a> Physiol Meas. 31 (9), N61-N70 (2010).</li><li>Ong, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+for+cell-free+layer+width+determination+in+small+arterioles.">An automated method for cell-free layer width determination in small arterioles.</a> Physiol Meas. 32 (3), N1-N12 (2011).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>Prewitt, J. M., Mendelsohn, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+cell+images.">The analysis of cell images.</a> Ann N Y Acad Sci. 128 (3), 1035-1053 (1966).</li><li>Ridler, T. W., Calvard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picture+Thresholding+Using+an+Iterative+Selection+Method.">Picture Thresholding Using an Iterative Selection Method.</a> IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 8 (8), 630-632 (1978).</li><li>Shanbhag, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+Information+Measure+as+a+Means+of+Image+Thresholding.">Utilization of Information Measure as a Means of Image Thresholding.</a> Cvgip-Graph Model Im. 56 (5), 414-419 (1994).</li><li>Bishop, J. J., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+erythrocyte+aggregation+and+venous+network+geometry+on+red+blood+cell+axial+migration.">Effects of erythrocyte aggregation and venous network geometry on red blood cell axial migration.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (2), H939-H950 (2001).</li><li>Yamaguchi, S., Yamakawa, T., Niimi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+plasma+layer+in+cerebral+microvessels.">Cell-free plasma layer in cerebral microvessels.</a> Biorheology. 29 (2-3), 251-260 (1992).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

CFL genişlik ölçüm mikrosirkülasyonun hemodinamik daha iyi anlaşılması için önemlidir. Özel olarak, flüoresan genişlikleri ölçümü mezenterik 6&#39;da gerçekleştirilmiştir, 24 ve serebral 25 mikrodolaşımını spinotrapezius. In vivo flüoresan genişlikleri geleneksel ölçüm kaydedilen video çerçevelerinin elle muayene ile tahminlerine sınırlandırılmıştır. Manuel ölçümler görsel RBC çekirdek ve damar duvarlarının 15,16 sınırlarını belirleme önce birkaç ardışık video kareleri ortalamasını gerekli. Bir başka çalışmada, flöresin izotiyosiyanat (FITC) eritrositlerde etiketli ve rodamin B izotiyosinat (RITC) etiketlenmiş plazma kedi serebral mikrodamarlar 25 ortalama flüoresan genişlikleri belirlemek için kullanıldı. Bu önceki ölçüm yöntemleri çok zaman alıcı ve CFL wi mekansal ve zamansal çözünürlüğe sınırlar floresan etiketleme için ek adımlar gerektirirDTH ölçümü. Buna karşılık, etkili bir görüntü segmentasyonu ve analiz, yüksek hızlı kamera kayıtları bağlanmasıyla, burada gösterdiği teknik küçük bir eritrosit ve boyutundan daha bir düzenin bir uzamsal çözünürlük (0.42 mikron) ile CFL Spatiotemporal varyasyon miktarının izin 1 / 3.000 sn zamansal çözünürlük. cremaster kası düzgün Cerrahi hazırlık flüoresan genişliği ölçümlerin doğruluğunu belirlemede kritiktir. Özel olarak, bitişik bağ dokularının ayrıntılı çıkarma cremaster kas arteriyoller iyi bir odak sağlamak için gereklidir. Buna ek olarak, ölçüm zamansal ve uzamsal çözünürlük mikroskop ve kamera özelliklerine bağlıdır. Daha fazla büyütülmüş bir amacı, uzaysal çözünürlüğü geliştirmek de, bu da flüoresan genişliği uzaysal değişimini ölçülmesi için elde damar uzunluğu sınırlayan görüş alanını azaltır. Bu nedenle, microscopiCı konfigürasyonları tekniğin belirli bir uygulamaya göre değiştirilebilir. Görüntü bölütleme CFL genişliği ölçüm doğruluğu için bir başka önemli faktördür. geliştirilen çeşitli teknikler arasında, gri seviye histogram dayalı görüntü eşikleme görüntü segmentasyonu ve analiz için basit ve etkili bir yaklaşım sağlar. Buna göre, ön plan nesneler gri düzeylerindeki fark esas alınarak arka plan çıkarılır. İdeal durumda, görüntü histogram bimodal olacak ve vadinin dibinde bir eşik değeri önemsiz olduğunu. Ancak, in vivo deneysel görüntüler hep böyle gri tonlama düzeyini profilleri göstermezler. Bizim sonuçları görüntü kalitesi ve kontrast görüntü bölütleme işlemini nasıl etkileyebileceğini göstermiştir. Bir optik mavi filtre kullanımı önemli ölçüde (Şekil 3) eritrosit ve arteriole plazma arasındaki kontrastı geliştirilmiş ve kurmuyorum zaman gerekli gibi görünüyorg ne olursa olsun algoritmalar (Şekil 4) CFL genişliği ölçümü için histogram tabanlı eşikleme. Bu tek etkili eşik değerini belirlemenizi sağlar ayrı bir bimodal görüntü histogram, sonuçlanır. Ancak, da in vivo görüntülerden elde edilen iki modlu bir histogram ile, iki adet tepe noktasına (yerel maksimum) son derece eşit varyans histogramın bir vadi (yerel minimum) de eşik noktası (Tablo 1 etkileyebilir unutulmamalıdır ). Bu nedenle, uygun bir eşikleme algoritması seçimi incelenen görüntü kalitesine göre gereken ve kullanıcıların CFL genişlikleri miktarının en uygunluğu için her eşikleme algoritması sınırlamaları göz önünde bulundurmanız gerekir. Flüoresan genişlikleri akış şartları büyük ölçüde bağımlı olduğu için, deney süresince sürekli olarak kan basıncı ölçümü gereklidir. Yerel akış koşullarının belirlenmesi amacıyla,Kan akış hızı pseudoshear kan damarı 5 ortalama akış hızı ölçülerek hesaplanır. Özet olarak, bir fare cremaster kas ve burada tarif edilen kantitatif resim analizi cerrahi hazırlanması için protokoller, in vivo olarak flüoresan genişlikleri dinamik varyasyon sayısal bilgiler elde etmek için kullanılmıştır. CFL genişliği ölçümlerin doğruluğunu sağlamada birincil sorunlar yukarıda ele alınmıştır ikisi de kas ve görüntü segmentasyonu, uygun cerrahi hazırlanmasını içermektedir. Bu teknik hali hazırda hemoreolojik ve çeşitli fizyolojik ve patolojik durumlarda hemodinamik sapmaları araştırmak için diğer mikro dolaşım çalışmalara uyarlanabilmektedir. Sonuç olarak, bu bulgular mikrovasküler tedavi yaklaşımları ve klinik müdahale gelecekteki gelişimine katkıda.

In vivo animal studies are instrumental to basic science for understanding human physiology and pathology. In particular, in vivo microhemodynamic studies can elucidate the potential impairment of microcirculatory functions altered by abnormal rheological conditions of blood. A number of previous microhemodynamic studies1 have used the rat cremaster muscle model for visualizing microvascular blood flow. The cremaster muscle is a thin layer of striated muscle surrounding the testes. Thus, the blood flow in the muscle can be visualized with a trans-illumination microscope by means of surgical exposure. This enables us to acquire the in vivo blood flow images without the use of any fluorescence or contrast agents. In addition, the entire blood perfusion of the muscle network can be controlled by reducing the upstream blood flow with abdominal aorta occlusion2. Owing to these advantages, the cremaster muscle model has been widely used to investigate the formation of cell-free layer (CFL) in microvessels1,3. 
The CFL width is a prominent hemodynamic parameter in microcirculation, which has been of great interest for its important roles in regulating microcirculatory functions. The CFL is formed by the shear-induced transverse inward migration of red blood cells (RBCs) towards the flow center4. Consequently, this migration leads to the depletion of RBCs near the vessel walls, eventually resulting in a cell-free plasma layer. Accordingly, the parietal CFL naturally becomes a diffusion barrier to oxygen (O2) delivery from the RBC core to the tissues, and to the scavenging of nitric oxide (NO) by the RBCs5,6. In addition, the production of NO can also be modulated by the dynamic variations of the CFL width7,8. Therefore, the roles of the CFL in both gas transport and the regulation of homeostasis in microcirculation need to be fully ascertained to better understand blood flow in microcirculation. Recent studies have focused on bridging the hemodynamics and gas transport functions of the CFL in the microcirculation9-12. Furthermore, a separate set of studies has also investigated how the pathological elevation in RBC aggregation modulates CFL formation and its effect on O2 and NO bioavailability in tissues13,14. 
The roles of the CFL become more significant in microcirculation where the relative size of the CFL width to the vessel diameter is prominent. This necessitates an effective approach of quantifying the CFL in in vivo blood flow. Particularly, image acquisition and image analysis are the two key components determining the accuracy of CFL width measurement. Successful visualization of tissue blood flow should be preceded by an appropriate surgical preparation of the animal model. Additionally, a proper image analysis technique is needed to overcome the limitations of conventional manual measurements that are mostly induced by human errors15,16. With advancements in optical instrumentation and computing power for digital image processing, it is now possible to achieve a more accurate and consistent measurement of the CFL width17-19. Nonetheless, the accuracy of these measurements, being image-based, still ultimately depends on the quality of the images.
Therefore, this study explores the factors influencing the measurement of the in vivo CFL width. We focused particularly on demonstrating the surgical preparation and digital image analysis for measurements of the CFL width in arterioles of the rat cremaster muscle.

<table><tbody><tr><td>Intravital microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>High speed camera</td><td>Photron</td><td>1024PCI</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Blue filter</td><td>HOYA</td><td>B390</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Pressure sensor &amp;amp; biopac system</td><td>Biopac system</td><td>TSD104A, MP100</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Temperature controller</td><td>Shimaden</td><td>SR 1</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Plasma Lyte A</td><td>Baxter</td><td>NDC:0338-0221</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Saline 0.9%</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin (5,000 IU/ml)</td><td>LEO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE-10 polyethylene tube</td><td>Becton Dickinson</td><td>427400</td><td>.024&quot; OD x .011&quot; ID&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PE-50 polyethene tube</td><td>Becton Dickinson</td><td>427411</td><td>.038&quot; OD x .023&quot; ID</td></tr><tr><td>PE-205 polyethene tube</td><td>Becton Dickinson</td><td>427446</td><td>.082&quot; OD x .062&quot; ID</td></tr><tr><td>2-0 non-absorbable silk suture</td><td>Deknatel</td><td>113-S</td><td></td></tr><tr><td>5-0 non-absorbable silk suture</td><td>Deknatel</td><td>106-S</td><td></td></tr><tr><td>Water circulating heating pad</td><td>Gaymar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp 205</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Sterile Cotton Gauze&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-468</td><td></td></tr><tr><td>Cotton-tipped applicators</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14188</td><td>Surgical instrument</td></tr><tr><td>Micro Dissecting forceps</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15915</td><td>Surgical instrument</td></tr><tr><td>Iris forceps 1 x 2 teeth</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15917</td><td>Surgical instrument</td></tr><tr><td>Vessel cannulation forceps</td><td>Kent Scientific</td><td>INS500377</td><td>Surgical instrument</td></tr><tr><td>Micro scissor</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14177</td><td>Surgical instrument</td></tr><tr><td>Iris scissor</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14225</td><td>Surgical instrument</td></tr><tr><td>Vessel clip</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14120</td><td>Surgical instrument</td></tr><tr><td>Gemini cautery system</td><td>Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>Surgical instrument</td></tr></tbody></table>

visualization and quantification of the cell-free layer in arterioles of the rat cremaster muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

In vivo CFL görselleştirme hayvanın cerrahi hazırlıkları büyük ölçüde bağlıdır. Aşırı kan kaybı ya da genişletilmiş cerrahi süresi şok ve kan akımı sapmaları hayvan tabi olabilir. bir ısıtma yastığı yanı sıra cerrahi ve deney sırasında özelleştirilmiş bir platformu kullanarak doku sıcaklığı bakım da sıçan fizyolojik koşulları sağlamak için önemlidir. mikroskop sistemi bir 100 W halojen lamba kullanarak, hiç bir farkedilebilir doku hasarı da deneyin sonunda gözlemlenmiştir. Şekil 2A, flüoresan RBC çekirdek ve iç damar duvarı (Şekil 2C) değiştiği gözlenen sıçan cremaster kasında dallanmamış arteriol, ile tipik bir RBC akışını göstermektedir. Deney sırasında bu bileşenler arasında iyi bir kontrast CFL genişliği ölçümlerin doğruluğunu sağlamak için kritik öneme sahiptir. Görüntü analizinin ilk aşaması içerirİç damar duvarına tespiti. Geminin dik analiz hattı boyunca ışık yoğunluğu profili satın alarak, konum koyu gelen transit iki piksel (Şekil 2B) üzerinde ışık o zirvesinde yaklaşılır. Eritrositler ve CFL farklı ışık geçirgenliği sahip olarak, gri düzeyleri arasındaki fark iki sınıf (ikili görüntü) ayrılabilir. Ancak, görüntü histogram iki zirveleri arasında doğru bir eşik değerinin belirlenmesi kötü görüntü kalitesi ve kontrast (Şekil 3A) tarafından kısıtlanmış olabilir. Mavi filtre kullanılabilir RBCs ve CFL, (Şekil 3B) arasındaki kontrastı arttırmak için. Bu, RBC çekirdek sınırları daha doğru mavi bir filtre kullanımı ile tespit edilebilir, Şekil 4&#39;te de bellidir. Ayrıca, eşikleme algoritması 20-23 seçimi de CFL genişliği ölçümü etkileyebilir (Şekil4). Farklı eşikleme algoritması, tanımlanan farklı RBC çekirdek sınırında sonuçlandı Şekil 4A açıktır ki olabilir hatalı CFL ölçümlerine yöneltebilir. Daha iyi Şekil 4B&#39;de flüoresan genişliği ölçümü eşik algoritması etkisini göstermek için, farklı eşik algoritmaları kullanılarak elde flüoresan genişliklerine mekansal profilleri Şekil 5&#39;te gösterilmektedir ve Tablo 1 &#39;de özetlenmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54550/54550fig1.jpg" /> . Şekil 1:. Intravital Mikroskobik Sistemi ve Cremaster&#39;ın kas Hazırlık A:. Cerrahi batın sıçan cremaster kas B: cremaster kasını yerleştirerek ve 35 ° C C&#39;de sıcaklığını muhafaza etmek için ısıtma elemanları ile Özelleştirilmiş platformu: cus ile mikroskobik sistemiSürekli basınç kontrolü için fizyolojik veri toplama sistemi. Negatif geri besleme sıcaklık kontrolörü ve güç kaynağı E:. cremaster kas D mikrosirkulasyonu kan akışlarının görünüm için hayvan sahne ve yüksek hızlı kamera isteğe uyarlanabilen. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54550/54550fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54550/54550fig2.jpg" /> Şekil 2:.. Bir arteriole RBC akışı tipik gri tonlamalı görüntü (damar çapı = 52 mm) B: Analiz hattı boyunca Işık yoğunluğu profili (Panel A düz çizgi) Gemi Duvar Pozisyonu ve CFL Genişlik A Belirlenmesi Görüntü İşleme c.: tekne üzerinde flüoresan ölçümü Örnek sonucu.Katı ve kesikli oklar sırasıyla RBC çekirdeğinin iç damar duvarını ve dış kenarını gösterir. (LWB ve RWB: sol ve sağ damar duvarı sınır, LCB ve RCB: sol ve sağ RBC çekirdek sınırı) <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54550/54550fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54550/54550fig3.jpg" /> Şekil 3:.. Optik Mavi Filtresi ile Görüntü Kontrast (A) olmadan ve mavi filtre (B) elde edilen gri tonlu görüntüleri Görüntü histogramı <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54550/54550fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54550/54550fig4.jpg" /> Figüre 4:.. (: mavi filtresi olmadan, alt satır (B): mavi filtreli Üst sıra (A)) kullanılarak RBC Çekirdek Genişliği Beş Farklı Eşik Algoritmalar RBC çekirdek ve Şekil 3&#39;te gri tonlama görüntülerde üst üste damar duvarının Sınırları kullanılarak belirlenir Otsu yöntemi, asgari yöntemle, intermode yöntemi iteratif seçim yöntemi (Isodata) ve bulanık entropik eşikleme (Shanbhag) (soldan sağa). Katı ve kesikli çizgiler iç damar duvarı ve RBC çekirdeğinin dış kenarını işaret sırasıyla. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54550/54550fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54550/54550fig5.jpg" /> Şekil 5: flüoresan Genişlik uzaysal değişimini solunda 4B Şekil gelen flüoresan genişlikleri (A).ve sağ (B) damar duvarları, sırasıyla. (D: damar çapı mesafe) <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54550/54550fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/54550/54550table1.jpg" /> Tablo 1: Şekil 5. * p &lt;0.001 Eşik Değerler ve CFL Genişliği Veri: Otsu yönteminden anlamlı fark. † p &lt;0,001: Soldan anlamlı fark. İstatistiksel analizler, iki kuyruklu eşleştirilmemiş t-testler kullanılarak yapıldı.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle at JoVE.com

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Sıçan Cremaster&#39;ın Muscle arteriyollerde Hücre-serbest Katman Görselleştirme ve

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

visualization-quantification-cell-free-layer-arterioles-rat-cremaster

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

6.3K Görüntüleme.  National University of Singapore. This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Video: Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, intestinal ischemia as well as following transplant and cardiovascular surgery.1 Reperfusion of previously ischemic tissue, while essential for the prevention of irreversible tissue injury, elicits excessive inflammation of the affected tissue. Adjacent to the production of reactive oxygen species, activation of the complement system and increased microvascular permeability, the activation of leukocytes is one of the principle actors in the pathological cascade of inflammatory tissue damage during reperfusion.2, 3 Leukocyte activation is a multistep process consisting of rolling, firm adhesion and transmigration and is mediated by a complex interaction between adhesion molecules in response to chemoattractants such as complement factors, chemokines, or platelet-activating factor.4
While leukocyte rolling in postcapillary venules is predominantly mediated by the interaction of selectins5 with their counter ligands, firm adhesion of leukocytes to the endothelium is selectin-controlled via binding to intercellular adhesion molecules (ICAM) and vascular cellular adhesion molecules (VCAM).6, 7 
Gold standard for the in vivo observation of leukocyte-endothelial interaction is the technique of intravital microscopy, first described in 1968.8
Though various models of IRI (ischemia-reperfusion injury) have been described for various organs, 9-12 only few are suitable for direct visualization of leukocyte recruitment in the microvascular bed on a high level of image quality.8 
We here promote the digital intravital epifluorescence microscopy of the postcapillary venule in the cremasteric microcirculation of the rat 13 as a convenient method to qualitatively and quantitatively analyze leukocyte recruitment for IRI-research in striated muscle tissue and provide a detailed manual for accomplishing the technique. We further illustrate common pitfalls and provide useful tips which should enable the reader to truly appreciate, and safely perform the method.
In a step by step protocol we depict how to get started with respiration controlled anesthesia under sufficient monitoring to keep the animal firmly anesthetized for longer periods of time. We then describe the cremasteric preparation as a thin flat sheet for outstanding optical resolution and provide a protocol for leukocyte imaging in IRI that has been well established in our laboratories.

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury IRI of the Rat Cremaster Muscle

Digital intravital epifluorescence microscopy of postcapillary venules in the cremasteric microcirculation is a convenient method to gain insights into leukocyte-endothelial interaction in vivo in ischemia-reperfusion injury (IRI) of striated muscle tissue. We here provide a detailed protocol to safely perform the technique and discuss its applications and limitations.

Sıçan Cremaster&#39;ın kas iskemi-reperfüzyon Hasarı içinde Lökosit-endotelyal Etkileşim Gerçek zamanlı Dijital Görüntüleme (IRI)

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, ...

Tıp

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ventilation. Up to now, the underlying mechanisms are not fully understood. The major vascular segment contributing to HPV is the intra-acinar artery. This vessel section is responsible for the blood supply of an individual acinus, which is defined as the portion of lung distal to a terminal bronchiole. Intra-acinar arteries are mostly located in that part of the lung that cannot be selectively reached by a number of commonly used techniques such as measurement of the pulmonary artery pressure in isolated perfused lungs or force recordings from dissected proximal pulmonary artery segments1,2. The analysis of subpleural vessels by real-time confocal laser scanning luminescence microscopy is limited to vessels with up to 50 &#181;m in diameter3.
We provide a technique to study HPV of murine intra-pulmonary arteries in the range of 20-100 &#181;m inner diameters. It is based on the videomorphometric analysis of cross-sectioned arteries in precision cut lung slices (PCLS). This method allows the quantitative measurement of vasoreactivity of small intra-acinar arteries with inner diameter between 20-40 &#181;m which are located at gussets of alveolar septa next to alveolar ducts and of larger pre-acinar arteries with inner diameters between 40-100 &#181;m which run adjacent to bronchi and bronchioles. In contrast to real-time imaging of subpleural vessels in anesthetized and ventilated mice, videomorphometric analysis of PCLS occurs under conditions free of shear stress. In our experimental model both arterial segments exhibit a monophasic HPV when exposed to medium gassed with 1% O2 and the response fades after 30-40 min at hypoxia.

Hypoxic pulmonary vasoconstriction (HPV) is an important physiological phenomenon by which at alveolar hypoxia lung perfusion is matched to ventilation. The major vascular segment contributing to HPV is the intra-acinar artery. Here, we describe our protocol for the analysis of HPV of murine pulmonary vessels with diameters of 20-100 &mu;m.

Murine Hassas Kesim Akciğer Dilimleri Kullanılarak Pulmoner Arterlerin Hipoksik Pulmoner Vazokonstriksiyonunun Videomorfometrik Analizi

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

Mikrosirkülasyon intravital Görüntüleme Fare Cremaster&#39;ın kas Hazırlık

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Biyoloji

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Many of estrogen's effects on vascular reactivity are mediated through interaction with estrogen receptors 1, 2, 3. Although two sub-types exist (estrogen receptor -&alpha; and &beta;),estrogen receptor-&alpha; has been identified in both the smooth muscle and in endothelial cells of pial arterial segments using fluorescent staining combined with confocal laser scanning microscopy 4. Furthermore, ER-&alpha; is located in the nuclei and in the cytoplasm of rat basilar arteries 5. The receptors are abundant and fluoresce brightly, but clear visualization of discrete groups of receptors is difficult likely due to the numbers located in many cell layers of pial vessel segments. Additionally, many reports using immunohistochemical techniques paired with confocal microscopy poorly detail the requirements critical for reproduction of experiments 6. Our purpose for this article is to describe a simple technique to optimize the staining and visualization of ER-&alpha; using cross-sectional slices of pial arterioles obtain from female rat brains. We first perfuse rats with Evans blue dye to easily identify surface pial arteries which we isolate under a dissecting microscope. Use of a cryostat to slice 8 &mu;m cross sections of the arteries allows us to obtain thin vessel sections so that different vessel planes are more clearly visualized. Cutting across the vessel rather than use of a small vessel segment has the advantage of easier viewing of the endothelial and smooth muscle layers. In addition, use of a digital immunofluorescent microscope with extended depth software produces clear images of ten to twelve different vessel planes and is less costly than use of a confocal laser scanning microscope.

Imaging of Estrogen Receptor-&#945; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

The goal of this article is to demonstrate a method to optimize immunofluorescent detection of estrogen receptor-&#945; (ER&#945;) in rat pial arterial slices using a digital immunofluorescent microscope.

Rat pial arteriollerde Östrojen Reseptör-α Dijital Immunofluorescent Mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

Many of estrogen's effects on vascular reactivity are mediated through interaction with estrogen receptors 1, 2, 3. Although two sub-types exist (estrogen ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

Sıçan izole direnç arter Video mikroskobu kullanan vasküler kontrol mekanizmalarının değerlendirilmesi

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The current protocol represents a practical and reproducible method to visualize the leukocyte endothelium interaction leading to leukocyte recruitment in skeletal muscle derived tissue within the intact organism of the mouse. The model is applicable to all fields of research that focus on granulocyte activation and their role in disease.
We provide a step by step protocol to guide through the method and to highlight potential pitfalls and technical difficulties. The protocol covers the following aspects: experimental settings and required material, anesthesia of the mouse, dissection of the cremaster muscle as well as tracheal and carotid cannulation, IVM recordings and offline analysis. Data formats like adherent leukocytes, rolling flux (RF) and rolling flux fraction (RFF) are explained in detail and appropriate applications are discussed. Representative results from dystrophin deficient mdx mice are provided in the results section.
IVM is a powerful tool to assess leukocyte recruitment in an in vivo setting; however, delineating for example endothelial and leukocyte function may require a combination with ex vivo setups like flow chamber experiments. Furthermore, the genetic background of animals of interest may greatly influence baseline recruitment, requiring individual fine tuning of the protocol provided. Despite its limitations, IVM may serve as a platform to readily translate in vitro findings into a living vertebrate organism.

Here, we show how to perform intravital microscopy on post-capillary venules of the mouse cremaster muscle. Commonly applied to different models of inflammation and sepsis, particularly those induced by chemokines and cytokines, we highlight its relevance in the study of muscolopathies involving exaggerated muscular leukocyte infiltration.

İntravital Mikroskopi Ile Değerlendirilen Farelerde Cremaster Kasın Lökosit İnfiltrasyonu

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Periferik Kök Hücre Göç Analizi Fare Cremaster Muscle Mikrosirkülasyon Intravital Mikroskopi

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion pressure. However, it is difficult to monitor the dynamic changes of the coronary arterioles and the capillaries in the whole heart, primarily due to its motion and non-stop beating. Here we describe a method that enables monitoring of arterial perfusion rate, pressure and the diameter changes of the arterioles and capillaries in mouse right ventricular papillary muscles. The mouse septal artery is cannulated and perfused at a constant flow or pressure with the other dynamically measured. After perfusion with a fluorescently labeled lectin (e.g., Alexa Fluor-488 or -633 labeled Wheat-Germ Agglutinin, WGA), the arterioles and capillaries (and other vessels) in right ventricle papillary muscle and septum could be readily imaged. The vessel-diameter changes could then be measured in the presence or absence of heart contractions. When genetically encoded fluorescent proteins were expressed, specific features could be monitored. For examples, pericytes were visualized in mouse hearts that expressed NG2-DsRed. This method has provided a useful platform to study the physiological functions of capillary pericytes in heart. It is also suitable for studying the effect of reagents on the blood flow in heart by measuring the vascular/capillary diameter and the arterial luminal pressure simultaneously. This preparation, combined with a state-of-the-art optic imaging system, allows one to study the blood flow and its control at cellular and molecular level in the heart under near-physiological conditions.

Presented here is a protocol to study the coronary microcirculation in living murine heart tissue by ex vivo monitoring of the arterial perfusion pressure and flow that maintains the pressure, as well as vascular tree components including the capillary beds and pericytes, as the septal artery is cannulated and pressurized.

Fare Kalbinde Kılcal Damarlar, Arterioles ve Perisitlerin Dinamik Ölçümü ve Görüntülenmesi

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the choroidal vessels supply the photoreceptors. Alterations in retinal perfusion contribute to numerous sight-threatening disorders, including diabetic retinopathy, glaucoma and retinal branch vein occlusions. Understanding the molecular mechanisms involved in the control of blood flow through the retina and how these are altered during ocular disease could lead to the identification of new targets for the treatment of these conditions. Retinal arterioles are the main resistance vessels of the retina, and consequently, play a key role in regulating retinal hemodynamics through changes in luminal diameter. In recent years, we have developed methods for isolating arterioles from the rat retina which are suitable for a wide range of applications including cell physiology studies. This preparation has already begun to yield new insights into how blood flow is controlled in the retina and has allowed us to identify some of the key changes that occur during ocular disease. In this article, we describe methods for the isolation of rat retinal arterioles and include protocols for their use in patch-clamp electrophysiology, calcium imaging and pressure myography studies. These vessels are also amenable for use in PCR-, western blotting- and immunohistochemistry-based studies.

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

This manuscript describes a straightforward protocol for the isolation of arterioles from the rat retina that can be used in electrophysiological, calcium imaging and pressure myography studies.

Retina arteriyoller yalıtım Ex Vivo Hücre fizyolojisi çalışmaları için

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Sıçan Cremaster'ın Muscle arteriyollerde Hücre-serbest Katman Görselleştirme ve

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Sıçan Cremaster'ın kas iskemi-reperfüzyon Hasarı içinde Lökosit-endotelyal Etkileşim Gerçek zamanlı Dijital Görüntüleme (IRI)