Name: a cell-free assay using xenopus laevis embryo extracts to study mechanisms of nuclear size regulation
Uploaded: 2016-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation at JoVE.com

Members of the Levy and Gatlin labs as well as colleagues in the Department of Molecular Biology offered helpful advice and discussions. Rebecca Heald provided support in the early stages of developing this protocol. This work was supported by the NIH/NIGMS (R15GM106318) and the American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).

Tüm Xenopus prosedürleri ve çalışmalar Laboratuvar Hayvanları 8 baskısının Bakımı ve Kullanımı için NRC Kılavuzu ile uyumlu olarak yürütülmüştür. Protokoller Wyoming Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Güvence # A-3216-01) Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. X&#39;in 1. Hazırlık (27,28 uyarlanmıştır) laevis Yumurta Özü <ol><li> Başbakan kadın X. laevis üç gün en az ve hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG) tek bir 100 IU enjeksiyonu ile yumurta toplamadan önce iki hafta en fazla kurbağa. </li><li> Bir gün önce deney, 1 / 3x Marc&#39;ın modifiye zilleri (MMR) bir kurbağa başına 1 L 16 ° C&#39;de insan koryonik gonadotropin (HCG) ve yer 800 IU prime kurbağalar enjekte edilir. Tüm tampon bileşimleri için Tablo 1 &#39;e bakınız. Not: Bazı kurbağa yumurtalarını olmaz ya da kalitesiz yumurtalarını olacaktır. Genellikle 2-3 kurbağa sufficien koyacak en az bir kurbağa sağlamak için enjekte edilirkaliteli yumurta t numaraları. Ortalama kurbağa yeterince yumurta yumurta ekstraktı en az 1 ml üretmek koyacak. </li><li> 1 / 3x MMR soğuk damıtılmış iyonu giderilmiş su ile L1 hazırlama (GKD 2 O), 500 mi tampon B, 1 L tamponu Cı 500 ml tampon D ve 100 ml tampon E </li><li> Transfer cam kristalize çanak (150 x 75 mm) yumurta koydu. ucu ile bir plastik Pasteur pipeti kesti kullanarak, beyaz kabarık aktif yumurta veya parçalanmış yumurta dışarı çiftlik. Sadece farklı ve eşit karanlık hayvan direkleri ve beyaz bitkisel direkleri ile yumurta korur. </li><li> D sitokalasin 355 uM ile takviye edilmiş tampon E 1 ml 13 x 51 mm santrifüj tüpleri Adım Bu 1.7 içinde kullanılmadan hemen önce ilave edildi. </li><li> Dejelly yumurta yıkayın. <ol><li> 4 kez - Tampon 3 değişiyor, uygun büyüklükte bir beher soğuk 1 / 3x MMR ile kısaca yumurta yıkayın. </li><li> 10 dakika - 3 yerden alacak Tampon B. This ile inkübasyon tarafından yumurta jöle kat çıkarın. bulutlu jöle mont yumurtadan serbest olaraks, tampon değiştirin. Not: eğik ve bitkisel kutuplar aşağıya dönük zaman yumurta sıkıca çanak köşesinde dolu görünür olduğunda Dejellying tamamlandı. Yumurta çok daha kırılgan dejellying sonra, yani gerekli ve sonraki yıkar daha uzun Tampon B ile kuluçkaya yok çok dikkatli yapılması gerekir. </li><li> Tampon C 4 değişikliklerle - 3 ile yıkayın yumurta kısaca </li><li> Tampon D. 2 değişikliklerle yıkayın yumurta kısaca </li><li> Tampon E. 2 değişikliklerle yıkayın yumurta kısaca </li></ol></li><li> Geniş delik cam pipet veya plastik damlalık kullanarak yumurta santrifüj tüpleri doldurun. Fazla tampon kapalı aspire. yumurta paketi ve 30 saniye için 478 x g hızında daha sonra 60 saniye boyunca 212 xg&#39;de sallanan kepçeli rotor içinde mümkün santrifüj kadar tampon kaldırmak ve. Fazla tampon kapalı aspire. Not: Yumurta özü minimal seyreltilir emin olmak için bu aşamada mümkün olduğu kadar fazla tampon kaldırmak için önemlidir. </li><li> Bir sallanan içinde<html> kepçeli rotor, 15, 12.000 x g&#39;de dakika ve 4 ° C&#39;de vakum altında ultrasantrifüjdeki açık yumurta ezmek ve sitoplazma ortasında sarı renkli tabaka olmak üzere, farklı tabakalara ayrılması için. buz üzerinde hemen santrifüj tüplerine ve yer çıkarın. </li><li> özü toplamak. <ol><li> 18 gauge iğne ve şırınga kullanılarak, sadece tüpün alt kısmında koyu pigmentli katmanın üzerinde santrifüj tüpü delinme ve orta amber renkli sitoplazmik tabakayı kaldırmak. Üst lipit tabakasının herhangi toplamak yok. uygun boyutta tüp içinde sitoplazma toplayın. Not: Genellikle, 1 kurbağa özü en az 1 ml üretir. </li><li> 1 / 1.000 D cytochalasin 19.7 mM hacmi, 1 / 1.000 LPC stokunun hacmi ve 1/50 50x enerji karışımı hacmi ile Ek sitoplazma. Yavaşça karıştırın tüp ters. aşırı özü pipetlemeyin etmeyin. </li><li> buz üzerinde özü tutmak ve en iyi sonuçlar için hazırlık 3 saat içinde kullanın. </li></ol></li></ol>(29 uyarlanmıştır) Demembranated X. laevis Sperm _title &quot;&gt; 2. Hazırlık Not: Burada sunulan prosedür hacimleri en fazla 8 testislerin içindir. <ol><li> % 0.05 benzokain (% 10 benzokain stok etanol içinde hazırlanır ve kurbağa tankı su içinde% 0.05 kadar sulandırılmıştır), 4 ° C ila oda sıcaklığına kadar ılıması çıkarın. Uyutmak ve erkek X kurban 30 dakika - 20 Oda sıcaklığında benzokain çözeltisi kurbağa laevis. ve / veya başları kesilerek, incelenmesi ve mekanik uyarıya yanıt eksikliği ile, göğüs bölgesini hissederek kalp atışı yokluğunda ölümünü sağlamak. </li><li> karın boyunca U-şekilli kesi yapmak. Sarı yağ organlarının tubulated kitle çıkarın. Böbreklerin üst kısmında, oval şekilli uzunluğu 29 1 cm&#39;lik soluk pembe kitleleri olan testisler, bulun. testis tüketim ve kan ve diğer doku kaldırmak için kurutma kağıdı üzerine onları yuvarlayın. </li><li> Tampon T. Kullanımında Tampon 1 ml testis kıymaya sıkı takılmış havaneli testisler yıkayınhomojen olana kadar 1.5 ml bir tüp içinde T (10 vuruş ya da daha fazla). Santrifüj 5-10 mini santrifüj sn ve doku büyük parça çıkarmadan, süpernatant toplamak. bir kez daha tekrar santrifüj ve süpernatantı toplamak. </li><li> 15 ml plastik tüpe sperm içeren çözelti aktarın. sperm pelet, 16 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1,411 x g hızında Tampon T Santrifüj 2 ml&#39;lik bir toplam hacim artırma. </li><li> Süpernatantı ve 16 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1,411 x g hızında Tampon T Santrifüj 500 ul pelletini. Somatik ve kırmızı kan hücrelerinin pelet temizlemek için gereken şekilde bir veya iki kez yineleyin. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 100 ul Tampon T ve 300 ul Tampon S. kuluçkaya pelletini. Not: Tampon S demembranation sorumludur lizolesitin içerir. </li><li> Tampon R üç cilt ekleyin (Kullanmadan önce taze hazırlanmış). tam olarak bir kez tüp ters çevirin. 16 ve 15 dakika boyunca 1,411 x g hızında santrifüj# 176; C. </li><li> 400 ul Tampon R pelet yeniden süspanse edin ve daha sonra 16 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 1,411 x g hızında Tampon R. Santrifüj ilave 2 ml ekleyin. </li><li> 50 ul Tampon T pelletini </li><li> Bir hemasitometre bu seyreltme uygula 9 ul Tampon T. ile 1 ul demembranated sperm çekirdekleri sulandırmak. büyük bir 4 x 4 ızgara ince S şeklinde sperm çekirdeklerinin sayısını ve ul başına sperm çekirdekleri stoklar konsantrasyonunu elde etmek için bu sayıyı 100 ile çarpın. </li><li> Bir 200x stok sonuçlanan Tampon T ul 100.000 sperm çekirdekleri, için stokunu. 5 ul alikotları - 3 hazırlayın. -80 ° C&#39;de, sıvı azot ve mağaza flaş dondurma. </li></ol> 3. Nükleer Meclisi <ol><li> 1.5 ul 35.5 mM sikloheksimid (nihai konsantrasyon ~ 0.5 mM) ile, 6 ul 20x kalsiyum stok çözelti (son konsantrasyon ~ 0.6 mM) ve 0.7 ul 200x sperm (yumurta özü 100 ul Supplement nihai konsantrasyon ~ 700Sperm çekirdek / ml). Reaksiyon hacmi yukarı veya aşağı ölçeği gerektiği gibi. Çevirin ya da hafifçe karıştırın dokunun. Not: interfaz içine metafaz sağlanıncaya Özü nükleer montaj için daha sağlam ve güvenilir bir platform sağlar. </li><li> 90 dakika boyunca 20 ° C - 16 ° C&#39;deki bir su banyosu içinde inkübe edin. yavaşça çekirdekler özü içinde asılı kalmasını sağlamak için her 15 dakikada dokunarak karıştırın. </li><li> aşağıdaki gibi bir kabak hazırlayarak 45 dakika nükleer montaj ilerlemeyi izlemek. <ol><li> Pipet 2, bir cam slayt üzerine ekstresi il, 2 ul çekirdeği düzeltme ekleyin. </li><li> 22 mm 2 lamel ile Yerleşimi. 100X amaçlarını ve bir DAPI filtre - su, yağ veya hava 20 kullanarak bir Epifloresans mikroskop görüntüsü. Not: Çekirdekler parlak alan görüntüleme ile görüntülenmiştir ancak floresan görselleştirmek için çok daha kolay bir şekilde karşılanabilmektedir. </li><li> -80 ° C&#39;de, sıvı azot ve mağaza hemen çekirdekleri veya flaş dondurma alikotları kullanın. Not: çekirdek pr% 4 gliserol eklemekendi bütünlüğünü korumak için yardımcı olabilir donma IOR. Dondurulmuş çekirdekler ancak donma süreci kesintiye ya da daha fazla yapısal kırılgan çekirdekler yol açabilir, yine genel olarak uygulanabilir ve nükleer ithalat yeteneğine sahiptirler. Çekirdekler donma sonra bir yıla kadar kullanılabilir. </li></ol></li></ol> X&#39;in 4. hazırlanması leavis Embriyo Özü <ol><li> Kadın X&#39;i indükleyin 1.1 ve 1.2 açıklandığı gibi yumurtalarını bırakmak için kurbağaları laevis. </li><li> Erkek, X testisler Yalıtmak 2.2&#39;de açıklandığı gibi kurbağa laevis. Cam 35 x 10 mm Petri kabı, penisilin ve streptomisin, 50 IU / ml ile takviye edilmiş L15 ortamı testislerin daldırın. en fazla iki hafta süreyle 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Toplamak ve yumurta döllemek. <ol><li> Bir bardak yeniden kullanılabilir Petri kabı üzerinde kurbağa tutarak taze koydu yumurta toplamak ve alt sırt kloakanın yakın hafif bir basınç uygulayarak yumurtlama teşvik. Şişirilmiş bir karın ve req yol yaralanmaya neden olabilir çok sert kurbağa sıkarakötenazi 29 uiring. </li><li> Yaklaşık 45 ° &#39;lik açıyla çanak Prop, yumurta, yemeğin kenarından toplamak tüm aşırı tampon kaldırmak ve zorlukla yumurta karşılamak için yeterli 1 / 3x MMR eklemenize olanak sağlar. toplama 15 dakika içinde yumurta döller. </li><li> ıslatarak yumuşatmak ve Barth&#39;ın Salin (Yüksek Tuz MBS) Modifiye yüksek tuz 500 ul ile 1.5 ml tüp içinde bir testisin 1/4 homojenize etmek sıkıca monte havaneli kullanın. daha sonra 1 / 3x MMR yumurta sel, 20 dakika - yumurta yumuşatılır testisler ekleyin ve 15, oda sıcaklığında meydana getirmek üzere, döllenme için izin verir. Not: Testislerin Etkinliği fazla bir hafta boyunca saklanan testis kullanırken bu nedenle daha fazla testis dokusu başarılı döllenme için gerekli olabilir, saklama süresi azalır. </li><li> ezilmiş teste ilave edildikten sonra 30 dakika - genellikle yaklaşık 20 yukarı bakacak koyu pigmentli hayvan kutup kasılması kontrol ederek ve onların hayvan direkleri embriyoların dönmesi ile döllenme onaylayıns. ilk hücre bölünmesi 90 dakika içinde meydana bekliyoruz. </li><li> Hızla komşu embriyolarda ölümü neden olacak gibi, parçalanmış, özenle ölü (beyaz ve kabarık veya sarısı ve pigmentin düzensiz dağılımı) kaldırmak geniş bir delik cam pipet kullanarak, ya da döllenmemiş yumurta (yani, bölünmüş değil). </li><li> Her 1 -% 3 sistein 1/3 x MMR içinde eritildi ve 10 N KOH ile pH 7.9 ayarlanır - dejelly 2 embriyolar 2.5 saat sonra gübreleme. 4 dk - Her 3 iki tampon değişiklikleri gerçekleştirmek. sistein tüm izlerini silmek için 1 / 3x MMR 10 kısa değişiklikler - iyice 6 ile embriyolar yıkayın. Not: Dejellied embriyolar bir vitellin membran ve dejellied yumurta gibi kırılgan değildir. </li></ol></li><li> Geniş delik cam pipet kullanarak, 16 ° C taze 1 / 3x MMR içeren Petri sağlıklı döllenmiş (yani bölünmüş) embriyo transferine ve yavaş gelişme tercih edilir onları, oda sıcaklığında istenilen aşamaya geliştirmek ya da izin verir. Ölü ya da ly kaldırmak için devam ediyorsed embriyolar ilk bölümü ya da beyaz kabarık bir görünüm eksikliği ile gösterilir. </li><li> Blastopore neredeyse tam kapanması için kontrol ederek ve referans materyalleri 24 mevcut sahnelenen embriyolar çizimlere karşılaştırarak embriyoların sahne doğrulayın. Not: Embriyolar evre 11.5 ulaşacak 16 ° C&#39;de kültüre - Yaklaşık 12 saat 12. </li><li> Geç interfaz embriyolar tutuklama, oda sıcaklığında 1 saat süre ile 0.5 mM sikloheksimid ile desteklenmiş taze 1 / 3x MMR 12 embriyo - evre 11.5 inkübe edin. </li><li> Geniş delik cam veya plastik pipet 15 (tercihen 30 veya daha fazla) en az bir mikrosantrifüj tüp interfaz-tutuklanan embriyolar ile transfer. Not: 15 embriyo özü yaklaşık 20 ul üretmek için yeterlidir. Gerektiği gibi büyütmek. </li><li> LPC stokunun 1 ul ile desteklenmiş 1 ml yumurta lizis tamponu (ELB) ekleyin. Yavaşça, embriyoların yıkayın embriyolar tüp altına düşmesine izin ve tampon kaldırmak için ters çevirin. Bu yıkama adımı iki kez daha tekrarlayın. &lt;/ Li&gt; <li> Elb 500 ul artı LPC stokunun 0.5 ul, 19.7 mM sikloheksimid 5 ul, ve D sitokalasin 35.5 mM 5 ul içinde süspanse embriyolar (aktin polimerizasyonunu inhibe etmek için). Bir masa mikrosantrifüj 1 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Fazla tamponu çıkarın ve iyice embriyolar ezmek için bir havaneli kullanın. 10,000 x g&#39;de 10 dakika ve 16 ° C&#39;de bir sallanma kepçeli rotor içinde santrifüjleyin. </li><li> 200 ul bir pipet ucu ile üst lipid tabakası ile delikler. Temiz bir 200 ul pipet ucu ile, uygun bir büyüklükte tüp orta sitoplazmik kehribar renkli katmanı kaldırmak. </li><li> 50x enerji karışımını hacmi (ATP rejenerasyon sistemi sağlamak için) 1/50 ile Ek embriyo özü, 1/100 35.5 mM cyclohexamide, D cytochalasin 19.7 mM 1/500 hacim ve 1 / 1.000 hacmi hacmi LPC stok. </li><li> özü endojen embriyonik çekirdekleri görselleştirmek için 3.3&#39;de açıklandığı gibi bir kabak hazırlayın. Not: Embriyo ekstresi ile donmuş olabilir<html> Bu noktada, endojen çekirdekler. Kısım -80 ° C&#39;de dondurma / çözülme döngüleri ve mağaza azaltmak için. </li><li> 1/50 50x enerji karışımı hacmi, 1/100 ihtiva Elb bir eşit hacmi ile özü seyreltin, embriyo ekstreden, çekirdeklerini uzaklaştırmak üzere 35.5 mM cyclohexamide hacmi, 1/500 D sitokalasin 19.7 mM hacmi ve 1 / 1.000 LPC stok hacmi. 16 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 17,000 x g&#39;de bir sallanan kepçeli rotor içinde santrifüjleyin. </li><li> üstündeki kalan lipid önlemek için dikkatli olmak süpernatant toplayın. tüpün alt kısmında topak haline çekirdekleri rahatsız etmeyin. En çekirdekleri çıkarılmış olmasını sağlamak için 3.3&#39;de açıklandığı gibi bir kabak hazırlayın. -80 ° C de taze özü veya kısım ve mağaza kullanın. </li><li> termal devir cihazı aracılığıyla 30 dakika boyunca 56 ° C&#39;de ekstrenin 100 ul tam bölünen miktarları, - Kontrol deneylerinde, ısı 30 embriyo özü inaktive ısı. ısı ile inaktive özü kullanmadan önce oda sıcaklığına dönmesi için izin verin. </li></ol>Deneyi ve immünfloresan Daralan _title &quot;&gt; 5. Nükleer <ol><li> 1.5 ml bir tüp içinde 1 mi Elb bölgesindeki prefabrik çekirdeklerin 150 ul - 25 seyreltilerek yumurta özü monte çekirdekleri izole edin. Bir masa mikrosantrifüj 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 1600 x g&#39;de santrifüjleyin. tüpün alt kısmında çekirdeklerinin kırılgan pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, tamponu çıkarın. </li><li> 5.1 kullanılan yumurta özü orijinal hacmine eşit embriyo özü bir hacimde çekirdekleri yeniden süspanse edin. uygun şekilde kullanın ELB veya kontrol reaksiyonları için ısı inaktive özü. </li><li> Yavaşça pelet kırmak ve çekirdekleri tekrar süspansiyon tüp dokunun. 30 dakika - hafifçe her 15 karıştırmak için tüp dokunarak, 90 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Not: Nükleer daralma çoğu ilk 30 dakika içinde gerçekleşir. </li><li> Bir kabak hazırlayarak nükleer daralma ilerlemesini izlemek. <ol><li> Pipet 2, bir cam slayt üzerine ekstresi il, 2 ul çekirdeği düzeltme ekleyin. </li><li> 22 mm 2 ile Yerleşimi </slamel&gt; kadar. Epifloresans mikroskop görüntüsü. </li></ol></li><li> hemen öncesinde ELB oluşan fiksatif 500 ul,% 15 gliserol ve% 2.6 paraformaldehid ekleyerek çekirdekleri tekrar süspansiyon tüp dokunun. Hemen Invert ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca, bir döndürücü üzerinde tüp yerleştirin. </li><li> yuvarlak alt plastik uçlar (tasarım ve istek üzerine şema) ile 15 ml&#39;lik yuvarlak dipli cam tüpler donatım ile tüpler aşağı spin hazırlayın. Nükleer yastık tampon 5 ml ekleyin. plastik ucun üstündeki düz durduğundan emin olduktan sonra tüpe 12 mm dairesel lamel bırakın. </li><li> Yavaşça geniş çaplı bir pipet ucu kullanılarak nükleer yastık üstünde sabit çekirdek içeren solüsyon katman. 1000 xg&#39;de 15 dakika ve 16 ° C için sallanan bir kova rotor Santrifüj. </li><li> tampon kaldırmak ve tüpün üstüne plastik parçayı çekmek için bir aspiratör kullanın. kapağın kenarını dikkat dikkatli olmak, ince forseps bir çift ile lamel çıkarınçekirdekler döndürülmüştür, bunun üzerine kayma. Soğuk metanol sonrası düzeltme oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (-20 ° C&#39;de saklanan). </li><li> Büyük bir plastik petri astar plastik parafin film kağıda kadar lamel çekirdek tarafı aktarın. su kaybını önlemek için çanak kenarı boyunca ıslak tek kullanımlık mendil yerleştirin. </li><li> 10 sn - 5 sonra PBS-NP40 500 ul (1x PBS artı% 0.1 NP40) ve aspirat ile lamel çekirdekleri rehidrate. </li><li> Dikkatle lamel üzerine PBS-% 3 sığır serum albümini (BSA) 75 ul tabaka. Oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 ° C engelleyebilir izin verin. </li><li> Bloke etme çözeltisi çıkarın ve primer antikor ile inkübe (örneğin, çekirdek gözenek kompleks, 1 karşı mAb414: 1000) oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca PBS% 3 BSA içinde seyreltilmiştir. PBS-NP40 beş acil değişiklikler ile yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat için PBS% 3 BSA içinde seyreltilmiş sekonder antikor ile inkübe edin. PBS-NP40 beş acil değişiklikler ile yıkayın. </li><li> tasarlamak10 ug / ml Hoechst oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS% 3 BSA içinde seyreltilmiştir. PBS-NP40 ile beş kez yıkayın. tüm aşırı tamponu çıkarın. </li><li> 5 ul antifade montaj ortamı ile bir slayt üzerine lamel monte edin. şeffaf tırnak cilası ile mühür. Daha sonra görüntüleme için 4 ° C&#39;de 100x hedefleri ya da mağaza - Görüntü hemen Epifloresans 20 ile mikroskop kullanılarak. Not: Daha önce 23 açıklandığı gibi kantifikasyonunu gerçekleştirin. </li></ol>

<ol>
	<li>Conklin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+size+and+nuclear+size.">Cell size and nuclear size.</a> J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).</li><li>Wilson, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Cell in Development and Heredity. , 727-733 (1925).</li><li>Levy, D. L., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+size+is+regulated+by+importin+alpha+and+Ntf2+in+Xenopus.">Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus.</a> Cell. 143 (2), 288-298 (2010).</li><li>Chan, Y. H., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+properties+of+cell+and+organelle+size.">Scaling properties of cell and organelle size.</a> Organogenesis. 6 (2), 88-96 (2010).</li><li>Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+nucleus:+Factors+and+forces.">Shaping the nucleus: Factors and forces.</a> J Cell Biochem. 113 (9), 2813-2821 (2012).</li><li>Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+up+the+nucleus:+nuclear+shape,+size+and+nuclear-envelope+assembly.">Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly.</a> J Cell Sci. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).</li><li>Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+size+regulation:+from+single+cells+to+development+and+disease.">Nuclear size regulation: from single cells to development and disease.</a> Trends Cell Biol. 23 (4), 151-159 (2013).</li><li>Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+shaping+the+nucleus:+mechanisms+and+significance.">Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance.</a> Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).</li><li>Levy, D. L., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+intracellular+scaling.">Mechanisms of intracellular scaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).</li><li>Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+mechanisms+and+functions+of+nuclear+size+regulation.">New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).</li><li>Jevtic, P., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+size+scaling+during+Xenopus+early+development+contributes+to+midblastula+transition+timing.">Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing.</a> Curr Biol. 25 (1), 45-52 (2015).</li><li>Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranuclear+DNA+density+affects+chromosome+condensation+in+metazoans.">Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans.</a> Mol Biol Cell. 24 (15), 2442-2453 (2013).</li><li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+structure+in+cancer+cells.">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nat Rev Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li><li>Jevtic, P., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+nuclear+size+regulation+in+model+systems+and+cancer.">Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer.</a> Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).</li><li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections.">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li><li>Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometrically+estimated+variation+in+nuclear+size.+A+useful+tool+in+grading+prostatic+cancer.">Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer.</a> Urol Res. 18 (2), 93-99 (1990).</li><li>Dey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+nucleus:+morphology+and+beyond.">Cancer nucleus: morphology and beyond.</a> Diagn Cytopathol. 38 (5), 382-390 (2010).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+about+cancer+from+frogs:+analysis+of+mitotic+spindles+in+Xenopus+egg+extracts.">Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts.</a> Dis Model Mech. 2 (11-12), 541-547 (2009).</li><li>Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts.">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li><li>Edens, L. J., Levy, D. L., Kloc, M., Kubiak, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Xenopus Development. , 325-345 (2014).</li><li>Levy, D. L., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Scaling+Problems+and+Solutions+in+Amphibians.">Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (1), a019166 (2016).</li><li>Edens, L. J., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cPKC+regulates+interphase+nuclear+size+during+Xenopus+development.">cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development.</a> J Cell Biol. 206 (4), 473-483 (2014).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1967).</li><li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos:+II.+Control+of+the+onset+of+transcription.">A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription.</a> Cell. 30 (3), 687-696 (1982).</li><li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos:+I.+characterization+and+timing+of+cellular+changes+at+the+midblastula+stage.">A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage.</a> Cell. 30 (3), 675-686 (1982).</li><li>Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+spindle+assembly+and+chromosome+condensation+in+Xenopus+egg+extracts.">Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).</li><li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2305-2314 (2006).</li><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).</li><li>Khan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+alterations+in+nuclear+structure+predict+prostate+carcinoma+distant+metastasis+and+death+in+men+with+biochemical+recurrence+after+radical+prostatectomy.">Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy.</a> Cancer. 98 (12), 2583-2591 (2003).</li><li>Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+nuclear+morphometry+with+pathologic+parameters+in+ductal+carcinoma+in+situ+of+the+breast.">Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast.</a> Mod Pathol. 14 (10), 937-941 (2001).</li><li>Zeimet, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+ploidy,+nuclear+size,+proliferation+index+and+DNA-hypomethylation+in+ovarian+cancer.">DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 121 (1), 24-31 (2011).</li><li>Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleoporin+Nup188+controls+passage+of+membrane+proteins+across+the+nuclear+pore+complex.">The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex.</a> J Cell Biol. 189 (7), 1129-1142 (2010).</li><li>Wuhr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+upper+limit+to+mitotic+spindle+length.">Evidence for an upper limit to mitotic spindle length.</a> Curr Biol. 18 (16), 1256-1261 (2008).</li><li>Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Katanin+contributes+to+interspecies+spindle+length+scaling+in+Xenopus.">Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus.</a> Cell. 147 (6), 1397-1407 (2011).</li><li>Wilbur, J. D., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+scaling+during+Xenopus+development+by+kif2a+and+importin.">Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin.</a> eLife. 2, e00290 (2013).</li><li>Kieserman, E. K., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+chromosome+size+scaling+in+Xenopus.">Mitotic chromosome size scaling in Xenopus.</a> Cell Cycle. 10 (22), 3863-3870 (2011).</li><li>Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H1+is+essential+for+mitotic+chromosome+architecture+and+segregation+in+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts.</a> J Cell Biol. 169 (6), 859-869 (2005).</li><li>MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISWI+remodeling+complexes+in+Xenopus+egg+extracts:+identification+as+major+chromosomal+components+that+are+regulated+by+INCENP-aurora+B.">ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 25-39 (2002).</li><li>Goehring, N. W., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+growth+control+through+limiting+pools+of+cytoplasmic+components.">Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components.</a> Curr Biol. 22 (9), R330-R339 (2012).</li><li>Du Toit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development:+Honey,+I+shrunk+the+nucleus.">Development: Honey, I shrunk the nucleus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 633 (2014).</li><li>Buchner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+protein+kinase+C+in+the+regulation+of+cell+growth+and+in+signalling+to+the+cell+nucleus.">The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 126 (1), 1-11 (2000).</li><li>Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C,+an+elusive+therapeutic+target.">Protein kinase C, an elusive therapeutic target.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (12), 937-957 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Here is presented a novel method to study mechanisms of nuclear size regulation during X. laevis development. Developmental progression is associated with dramatic changes in cell physiology, metabolism, division rates, and migration, as well as alterations in the sizes of cells and intracellular structures. These varied processes are complex and essential, so it is difficult to study just one of these aspects of development in an in vivo setting. The X. laevis embryo extract and nuclear shrinking assay described here allow for the study of size regulatory mechanisms in an in vitro context, circumventing the complex signals and physical constraints of the in vivo system. Furthermore, the open nature of the extract allows for its facile biochemical manipulation.
Troubleshooting some steps of the protocol may be necessary. Problems with nuclear assembly and growth can result from poor quality eggs, incomplete demembranation of sperm nuclei, use of sperm nuclei at too high of a concentration, or incubating nuclear assembly reactions at too low of a temperature. Removal of endogenous embryonic nuclei from late embryo extract can be difficult due to the small size of these nuclei. This step in the protocol may require more than one round of centrifugation or the use of alternate rotors to completely remove all nuclei. Failure of nuclei to become smaller in the shrinking assay may be due to poor quality embryos, starting with nuclei that are too small, or too low of an incubation temperature. Poor quality eggs and embryos are indicated by a large proportion of white puffy activated eggs, unequal distribution of yolk and pigment granules, and eggs laid in strings. Spinning down fixed nuclei onto coverslips occasionally causes fragmentation of the nuclei, which can be avoided by decreasing the centrifugation speed or increasing the glycerol and sucrose concentrations in the nucleus cushion buffer. Troubleshooting antibody selection and dilution for immunofluorescence of nuclei is also often necessary. Critical steps within these protocols include: using high quality eggs and embryos, removing activated and lysed eggs and embryos, ensuring sperm nuclei are fully demembranated and appropriately diluted, monitoring nuclear assembly and growth, correctly staging embryos, completely removing endogenous embryonic nuclei from late stage embryo extracts, centrifuging fixed nuclei onto glass coverslips, and immunofluorescent staining of nuclei for visualization and quantification.
Nuclear size differences have long been noted between different species, cell types, disease states, and stages of embryonic development, indicating that nuclear size is tightly regulated1-10. Cancer of the prostate, breast, and ovary, to name a few, are all diagnosed and staged based on graded increases in nuclear size14,30-32. It is unclear to what extent changes in nuclear size are a cause or consequence of disease, and whether normal scaling of nuclear size contributes to proper development. Answering these functional questions necessitates an understanding of the mechanisms that control nuclear size. The assay presented here provides one approach to identifying novel pathways and proteins that regulate nuclear size, with potential relevance to cancer and development.
The Xenopus egg and embryo extract systems provide particularly powerful approaches to investigate mechanisms of organelle size regulation. While Xenopus extracts have been used for decades to study various aspects of cell cycle regulation and organelle assembly and dynamics, these extracts have more recently provided insights into size regulation of the nucleus3,23,33, mitotic spindle34-36, and chromosomes37-39. One of the major advantages of working with X. laevis embryo extracts is that they can be isolated from different stages of development, representing cytoplasm from differently sized cells containing nuclei of differing sizes. The method for investigating nuclear re-sizing presented here is physiologically relevant and offers a simplified system with which to identify mechanisms of nuclear size regulation. One complication of studying size regulation in vivo is that it is difficult to distinguish effects of spatial constraints and volume-limited components on size versus developmentally regulated changes in the expression or activities of size-controlling factors40. The approach described here focuses on developmentally controlled nuclear size regulators, using a robust nuclear re-sizing assay that is amenable to biochemical dissection.
Using the methods presented here, we identified protein kinase C (PKC) as a novel regulator of nuclear size. Furthermore, we showed that PKC activity and nuclear localization increase during X. laevis development23,41. A key limitation to the nuclear shrinking assay is that it is performed entirely in vitro. While Xenopus extract systems provide a simplified platform to discover new factors that regulate size, it is important that these results are validated in vivo. There are a variety of different approaches to corroborate physiological significance. X. laevis embryos can be microinjected with mRNA or morpholinos to alter the levels of nuclear scaling factors identified in extract, and then the effects on nuclear size can be quantified. Treatment of embryos with cell-permeable small molecule inhibitors or activators is also possible. For instance, we observed nuclear shrinking in live embryos treated with a phorbol ester, and this shrinking occurred within interphase without a requirement for nuclear envelope breakdown and passage through mitosis23. Another approach is to alter the levels of nuclear scaling factors in tissue culture cells to assess conservation of nuclear size control mechanisms outside of Xenopus.
What are the functional implications of altered nuclear size? One possibility is that nuclear size influences chromosome and chromatin organization, thereby altering gene expression. This idea can be directly tested as mechanisms of nuclear size regulation are further elucidated. Interestingly, PKC signaling and nuclear size are both routinely deregulated in cancer cells, often representing more aggressive metastatic disease13,14,42,43. Whether there is a direct relationship between deregulated PKC signaling and altered nuclear size in cancer remains to be shown. There is still much to be learned about nuclear size regulation, and the assay presented here, or variants of it, may still yield new information about mechanisms of nuclear size control. Furthermore, this assay could easily be adapted for the study of scaling mechanisms of other organelles and intracellular structures such as the mitotic spindle, endoplasmic reticulum, chromosomes, and Golgi, to name a few.

Hücre organellerinin boyutları genellikle hücrenin boyutuna ölçeklendirme ve bu belki de en iyi cep boyutu 1-10 nükleer boyutta ölçekleme için dokümante edilmiştir. Bu durum hücre çekirdek büyüklüğü hem de azaltılması için genellikle 11,12 görülmektedir embriyojenez ve hücre farklılaşması sırasında geçerlidir. Ayrıca, değişmiş nükleer boyut kanseri tanı ve prognoz 13-17 anahtar bir parametredir. Nükleer boyut düzenlemeye katkıda Mekanizmalar nedeniyle karmaşıklığı ve nükleer yapı ve fonksiyonunun temel doğası kısmen, büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada anlatılan yöntemi biyokimyasal manipülasyon ve nükleer boyut düzenleme mekanizmalarının aydınlatılmasında mükellef nükleer boyut ölçekleme için bir in vitro deneyi olarak geliştirilmiştir. Xenopus laevis yumurta özü bir in vitro karmaşık hücresel süreçleri recapitulate ve incelemek için iyi kurulmuş bir sistemdir </em&gt; Bağlam. Bu özler montaj ve mitotik iğ, endoplazmik retikulum fonksiyonu ve çekirdeğinde 18-22 dahil olmak üzere birçok hücresel süreçleri hakkında yeni temel bilgiler ortaya koymuştur. Özü sistemine temel avantajlarından biri, o X. laevis yumurta özler, terkibi kolaylıkla yeniden birleştirici protein veya bağışıklık sistemindeki eklenmesiyle, örneğin, değiştirilebilen bir yaklaşık seyreltilmemiş sitoplazma temsil etmektedir. Ayrıca, bir başka şekilde in vivo bir bağlamda ölümcül olabilir tedaviler kullanılarak esas işlemleri manipüle edebilir. Yumurta özü prosedürünün Değişiklikler X elde edilen ekstrelerin izolasyonu için izin laevis embriyoların yerine yumurta ve bu embriyo ekstreleri biyokimyasal manipülasyon 23 eşit müsait. X sırasında gelişimini laevis, tek hücreli döllenmiş embriyo (~ 1 mm çapında) (1 aşamaları - 8) oniki hızlı hücre bölünmeleri bir dizi uğrar oluşturmak için birkaç bin 50 μm çapında ve gelişimsel aşamaya ulaşan küçük hücreler, midblastula geçiş (MBT) ya da sahne 24-26 Ağustos olarak nitelendirdi. MBT zigotik transkripsiyon, hücre göçü, asenkron hücre bölünmeleri, boşluk fazlarının edinimi ve nükleer kararlı durum boyutları ziyade öncesi MBT embriyo gibi sürekli nükleer genişleme kurulması başlaması ile karakterizedir. Bireysel çekirdeklerin hacmi fazla 10 kat 11 azalır - gastrulasyon sahne 4 den (12 10.5 aşamaları). Burada amaç gelişimsel ilerlemesi sırasında nükleer boyutu bu azalmaların sorumlu mekanizmaları tespit etmektir. Yaklaşım ilk X&#39;te çekirdekleri bir araya getirilmesidir Yumurta özü laevis ve yumurta sitoplazma / ekstresinden elde edilen bu çekirdekleri izole etmek. Bu çekirdek daha sonra son gastrula sahne embriyolardan sitoplazma içinde tekrar süspanse edilir. bir kuluçka döneminden sonra, yumurta ekstreden çekirdekler geç aşama embriyo özü küçük hale gelir. Biz bu woul gerekçeligelişimsel nükleer boyut ölçekleme katkıda geç evre embriyo mevcut sitoplazmik bileşenleri tanımlamak için yararlı bir deney olurdu. In vivo doğrulama ile birleştiğinde, bu tahlil, kullanarak, protein kinaz C (PKC), X nükleer boyutta gelişim azalmalara katkı gösterdi 23 laevis.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG</td><td>Molecular Probes</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>ATP disodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1501</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>J2-21M</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge rotor</td><td>Beckman</td><td>JS 13.1</td><td></td></tr><tr><td>chymostatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>creatine phosphate disodium</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>cycloheximide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6255</td><td></td></tr><tr><td>cytochalasin D</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>disposable wipes (kimwipes)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W326306</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glass crystallizing dish (150 x 75 mm)</td><td>VWR</td><td>89090-662</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Macron</td><td>5094-16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>HCG - Human Chorionic Gonadotropin&amp;nbsp;</td><td>Prospec</td><td>hor-250-c</td><td></td></tr><tr><td>L15 Media</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Lysolecithin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1381</td><td></td></tr><tr><td>mAb414</td><td>Abcam</td><td>ab24609</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>EMD</td><td>MX0045-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5885</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>BDH</td><td>56009</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin + Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Pp0781</td><td></td></tr><tr><td>pepstatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Plastic paraffin film (parafilm)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt</td><td>70100</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Baker</td><td>5 3140</td><td></td></tr><tr><td>PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin</td><td>Prospec</td><td>hor-272-a</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP328</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0590</td><td></td></tr><tr><td>Pestle</td><td>Thomas Scientific</td><td>3411D56</td><td></td></tr><tr><td>Round bottom glass tubes, 15 ml</td><td>Corex</td><td>8441</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG)</td><td>ThermoFisher</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Calbiochem</td><td>8550</td><td></td></tr><tr><td>thermal cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge rotor</td><td>Beckman</td><td>SW 50.1</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (anti-fade mounting medium)</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

a cell-free assay using xenopus laevis embryo extracts to study mechanisms of nuclear size regulation

Hücre biyolojisinde temel bir soru hücre ve organel boyutları düzenlenir nasıl. Uzun zamandan beri hem hücre azaltılması için ve nükleer boyutlar ortaya çıktığında çekirdeğin boyutu genellikle özellikle embriyojenez sırasında, hücre boyutu ile terazi olduğu kabul edilmiştir. Nükleer boyut düzenleme mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir ve değişmiş nükleer boyutu önemli bir tanısal ve prognostik parametre olduğu kanser ile ilgili olabilir. In vivo nükleer fonksiyonun temel ve karmaşık doğası gereği karmaşık olan nükleer boyut regülatörleri belirlenmesi amacıyla yaklaşır. Nükleer boyut kontrolünü incelemek için burada açıklanan in vitro yaklaşım Xenopus laevis gelişimi sırasında meydana gelen nükleer boyutu normal indirimlerin yararlanır. İlk olarak, çekirdek X monte edilmektedir Yumurta özü laevis. Daha sonra, bu çekirdekler izole edilmiş ve geç aşama embriyolar sitoplazma içinde tekrar süspanse edilir. 90 dakika kuluçka dönemi, nükleer yüzey alanı - 30 sonragelişimsel nükleer boyut ölçekleme katkıda geç evre embriyo mevcut sitoplazmik bileşenleri tanımlamak için yararlı bir tahlil sağlayan% 60 - 20 azalır. Bu yaklaşımın en büyük avantajı yumurta ve embriyo ekstreleri biyokimyasal nükleer boyutunu düzenleyen yeni proteinler ve faaliyetlerinin tanımlanması için izin manipüle edilebildiği göreli bir tesistir. Nitro yaklaşımda herhangi biri gibi, bir in vivo sistem sonuçların doğrulanması önemlidir ve X&#39;in mikroenjeksiyon laevis embriyolar bu çalışmalar için özellikle uygundur.

Yumurta Özü içinde Çekirdek Meclisi Bu protokolün ilk adımlar X hazırlamak için vardır laevis yumurta özü (Protokol 1) ve demembranated sperm çekirdekleri (Protokol 2). Bu reaktifler, sonra çekirdekleri de novo (Protokol 3) monte etmek için kullanılır. 1, bazı temsili verileri göstermektedir. kalsiyum ilavesi interfaz içine meiotically tutuklandı yumurta özü sürücüler ve sikloheksimid interfaz tutuklandı özü tutar. 30 haberi - reaksiyon başlangıcından sonra 45 dakika, başlangıçta ince S şeklinde sperm çekirdekleri sülük şeklinde kromatin kitlelere içine kalınlaştırmak başlamalıdır. bozulmamış bir çekirdeksel zar başarıyla oluşumu, GST-GFP-NLS (veriler gösterilmemiştir) ya da FG-tekrar kabul mAb414 kullanılarak çekirdek gözenek kompleks için ağız boyama ile bir floresan etiketli içe yük alma ve tutma ile değerlendirilebilir contaiNing nucleoporins (Şekil 1A). Nükleer montaj oluşur, sonra nükleer şekil daha yuvarlak olması gerektiğini ve nükleer zarf genişletir ve nükleer proteinler (Şekil 1B-C) ithal edilmektedir nükleer hacim artmalıdır. bozulmamış bir nükleer zarf veya nükleer büyümenin oluşumunu uyulmaması kalitesiz yumurta özü gösterir. Bu durumda, bu yumurta yeni bir parti ile yeniden başlatmak en iyisidir. Embriyo Özü Endojen Çekirdeklerin çıkarılması Bir sonraki adım, bir geç evre embriyo ekstresi (Protokol 4) hazırlamaktır. özü ve önceki çekirdeklerin giderilmesi için ilk hazırlanmasından sonra, bu ekstrenin küçük bir kısım bir Hoechst-lekeli kabak hazırlamak için uygundur. Birçok küçük embriyonik çekirdeklerin görselleştirme özü (Şekil 2A) hazırlanmasında başarı iyi bir göstergesidir. endojen embriyonik çekirdekler aşağı analysi müdahale gibis, seyreltme ve santrifüj ile çıkarılmasından sonra çekirdekleri ekstraktının bir tümbölenini kontrol etmek de önemlidir. İlk kabak ile karşılaştırıldığında, çok az çekirdek özü (Şekil 2B) bırakılmalıdır. Birçok çekirdekler hala mevcut varsa, santrifüj ikinci tur gereklidir. Nükleer Daralan Deneyi Şekil 3 nükleer küçülen tahlil için temsili sonuçlar (Protokol 5) gösterir. Ileri evre embriyo özü içinde yeniden süspanse yumurta özü çekirdekleri zaman (Şekil 3B) üzerinde küçülür. Deney için iyi bir negatif kontrol ısıyla inaktive (Şekil 3A) olmuştur embriyo özü ile çekirdekleri inkübe etmektir. çekirdekler ısı ile inaktive özü de küçültmek için başarısız olarak, bu işlenmemiş embriyo ekstresi ile küçülen nükleer gözlenen bazı güven ozmotik etkileri sonucu değil sağlar. Nükleer boyutu ölçüdegözlenen azalma yumurta özü çekirdeklerinin özellikle toplu yanı sıra embriyo özü kalitesine bağlı olarak değişir. Bizim tecrübelerimize göre, nükleer daralma her zaman, ancak farklı çekirdekleri ile bu deneyler birden çok kez tekrarlamak önemlidir ve testin doğasında değişkenlik ele özleri, (örneğin, 40&#39;dan fazla farklı embriyo ekstrelerinde) görülmektedir. Şekil 4 şematik gösterir tüm protokol. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54173/54173fig1.jpg" /> Şekil X 1. Nükleer Meclisi gün Dersin laevis Yumurta Özü. Çekirdekler X de novo monte edildi çekirdek gözenek kompleks (NPC) (mAb414) de karşı bir antikor kullanılarak immünofloresans aynı reaksiyondan 3. alikotlan sabit ve görselleştirilmiştir Protokolü de tarif edildiği gibi, yumurta özü laevis: <strong<html> &gt; A), 30 dk, b) 60 dakika, ve C) çekirdek tertibatının başlatılmasından 90 dakika sonra. Immünfloresans protokol ölçek çubuğu 25 mm. Protokolde 5. açıklanan <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54173/54173fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54173/54173fig2.jpg" /> X. Çekirdeklerin Şekil 2. Kaldırma Embriyo Özü laevis. X. A) önceden santrifüj çekirdeklerin çıkarılmasından sonra çekirdeklerin giderilmesi ve B): Protokol 4&#39;te tarif edildiği gibi ekstrenin küçük bir kısım sabit ve Hoechst ile lekeli 12 embriyo - laevis embriyo özü aşamasından 11.5 elde edilmiştir. Ölçek çubuğu 25 mm.om / files / ftp_upload / 54173 / 54173fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54173/54173fig3.jpg" /> Şekil 3. Temsilcisi Veri Nükleer Küçülen Testi gelen. Çekirdekler X de novo monte edildi rekombinant GFP-LB3 ile desteklenmiş laevis yumurta özü (nükleer lamina görselleştirmek için). Protokol 5&#39;te tarif edildiği gibi, yumurta özü çekirdekler izole edilmiş ve aşama 11.5 yeniden süspansiyon haline getirildi - endojen embriyonik çekirdekleri kaldırılmış olan 12 embriyo özü. Canlı time-lapse görüntüleme 90 dakika boyunca 30 sn aralıklarla yapıldı. A) geç dönem embriyo ekstresi (LEE), ve B) ısı ile inaktive (HI) embriyo ekstresi: Şekil panelleri inkübe çekirdekleri için 6 dakika aralıklarla elde edilen görüntüleri göstermek. Zaman derslerden Görüntüler devamsoldan sağa. Ölçek çubuğu 46 farklı yumurta ve embriyo özlerinden 25 mikron. C) Nükleer daralma veridir. Barlar&gt; 240 çekirdekleri için araçları göstermektedir. Hata çubukları standart sapma vardır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54173/54173fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54173/54173fig4.jpg" /> Testi Küçülen Nükleer Şekil 4. şematik. Her renkli kutu bir protokol temsil eder. Kırmızı X hazırlanmasını gösterir laevis yumurta özü (Protokol 1). Mavi demembranated X hazırlanmasını gösterir laevis sperm (Protokol 2). Pembe yumurta özü de novo nükleer tertibatını (Protokol 3) gösterir. Yeşil X hazırlanmasını gösterir leavis embriyo özü (Protokol 4). Menekşe nükleer s gösterirhrinking tahlil protokolü ve immünfloresans (Protokol 5). Bu rakamın bölümleri 23&#39;ten yeniden edilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54173/54173fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> tampon adı </td><td> tampon kompozisyon </td></tr><tr><td> Marc&#39;ın Modifiye Ringer (MMR), 1 / 3x </td><td> 33 mM NaCI, 0.7 mM KCI, 0.3 mM MgSO 4, 0.7 mM CaCl2, 1.7 mM HEPES, pH 7.4 </td></tr><tr><td> Ekstre tampon maddesi (XB) &#39;, 10x </td><td> 1 M KCI, 1 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, 500 mM sükroz, 100 mM HEPES, pH 7.8 (pH 4 ° C&#39;de saklanır, 10 N KOH ile ayarlanmış) </td></tr><tr><td> tampon B </td><td> Sistein 0.8x XB içinde çözülmüş% 4 (soğuk GKD 2 O, Ph, bir ile hazırlanan10 N NaOH ile 7.8&#39;e konuma getirilmiş olması gerekir) </td></tr><tr><td> Tampon Cı </td><td> Soğuk GKD 2 O 900 ml ile 10x XB arasında 100 m Mix </td></tr><tr><td> tampon D </td><td> Tampon C artı 5 mM EGTA, 800 uM MgCl2 </td></tr><tr><td> LPC stok, 1,000x </td><td> 10 mg / ml löpeptin, pepstatin, ve DMSO içinde çözülmüş kimostatin her biri (-20 ° C&#39;de parçalar halinde saklanır) </td></tr><tr><td> tampon E </td><td> 100 ml Tampon D artı 100 ul LPC stok </td></tr><tr><td> Enerji karışımı, 50x </td><td> 190 mM kreatin fosfat disodyum, 25 mM ATP disodyum tuzu, 25 mM magnezyum klorür </td></tr><tr><td> Tampon T </td><td> 15 mM PIPES, 15 mM NaCI, 5 mM EDTA, 7 mM MgCI2, 80 mM KCI, 0.2 M sükroz, pH 7.4 (filtre ile sterilize edildi ve 4 ° C&#39;de saklanır) </td></tr><tr><td> tampon S </td><td> Maltoz, 20 mM ve Tampon T hazırlanan lisolesitin% 0.05 </td></tr><tr><td> Tampon R </td><td> Tampon T artı% 3 sığırserum albümin </td></tr><tr><td> Kalsiyum stok solüsyonu, 20x </td><td> 10 mM CaCl2, 0.1 M KCI, 1 mM MgCl2 (20 ° C&#39;de saklanan) </td></tr><tr><td> Çekirdek düzeltme </td><td> 125 p, l 2 M sukroz, pH 7.9 12.5 ul, 1 M HEPES, 250 ul% 37 formaldehit, 112 ul GKD 2 O, 0.5 ul 10 mg / ml Hoechst (iki hafta boyunca oda sıcaklığında depolandı) </td></tr><tr><td> Modifiye Barth&#39;ın Salin (MBS), 10x </td><td> 880 mM NaCI, 10 mM KCI, 50 mM HEPES, 25 mM NaHCO 3, pH 7.8 </td></tr><tr><td> Yüksek tuz MBS </td><td> 1x MBS artı 0.7 mM CaCl2 ve 20 mM NaCI </td></tr><tr><td> Yumurta liziz tamponu, elb </td><td> 250 mM sakaroz, 50 mM KCI, 2.5 mM MgCI2, 10 mM HEPES, pH 7.8 </td></tr><tr><td> Nükleer yastık tampon </td><td> 1x XB, 0.2 M sukroz,% 25 gliserol (filtre ile sterilize edildi ve 4 ° C&#39;de saklandı) </td></tr></tbody></table>Tablo 1. tamponlar. Bu protokolde belirtilen tüm tampon bileşimleri, bu tabloda açıklanmıştır.

Watch this Scientific Journal Video about A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation at JoVE.com

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Kullanılarak hücresiz Deneyi<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyo Nükleer Boyut Yönetmeliğin Mekanizmaları Eğitim için ayıklar

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

a-cell-free-assay-using-xenopus-laevis-embryo-extracts-to-study

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

8.3K Görüntüleme.  University of Wyoming. Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Video: A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Gelişim Biyolojisi

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Konfokal Analizi Kullanımı<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt ve Shh morfogen Gradyanların modülyatorlar Soruşturma

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts prepared from Xenopus laevis eggs have been powerful in dissecting biochemical networks underlying the cell-cycle progression, their ensemble average measurement typically leads to a damped oscillation, despite each individual oscillator being sustained. This is due to the difficulty of perfect synchronization among individual oscillators in noisy biological systems. To retrieve the single-cell dynamics of the oscillator, we developed a droplet-based artificial cell system that can reconstitute mitotic cycles in cell-like compartments encapsulating cycling cytoplasmic extracts of Xenopus laevis eggs. These simple cytoplasmic-only cells exhibit sustained oscillations for over 30 cycles. To build more complicated cells with nuclei, we added demembranated sperm chromatin to trigger nuclei self-assembly in the system. We observed a periodic progression of chromosome condensation/decondensation and nuclei envelop breakdown/reformation, like in real cells. This indicates that the mitotic oscillator functions faithfully to drive multiple downstream mitotic events. We simultaneously tracked the dynamics of the mitotic oscillator and downstream processes in individual droplets using multi-channel time-lapse fluorescence microscopy. The artificial cell-cycle system provides a high-throughput framework for quantitative manipulation and analysis of mitotic oscillations with single-cell resolution, which likely provides important insights into the regulatory machinery and functions of the clock.

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

We present a method for the generation of in vitro self-sustained mitotic oscillations at the single-cell level by encapsulating egg extracts of Xenopus laevis in water-in-oil microemulsions.

Microemulsions boş hücre Xenopus yumurtanın hücre döngüsü salınımlarını sulandırma ayıklar

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Biyokimya

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Xenopus laevis Yumurta hazırlanması ve Fraksiyonu ayıklar.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Biyoloji

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Vitro Nükleer Meclisi fraksiyonlara Xenopus Yumurta ayıklar kullanma

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Transgenik, üretimi Xenopus laevis Kısıtlama Enzim aracılığı ile Entegrasyon ve Nükleer Nakli

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Üretimi<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Yumurta Mikrotubul ilişkili RNA&#39;lar tanımak ayıklar

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Β-katenin Bozulması Of Sulandırma<em&gt; Xenopus</em&gt; Yumurta Özü

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Hücre Testi Mitoz Sonu Kromatin dekondenzasyon Eğitim için

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Kullanılarak hücresiz Deneyi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Manipülasyon ve

Konfokal Analizi Kullanımı

Microemulsions boş hücre Xenopus yumurtanın hücre döngüsü salınımlarını sulandırma ayıklar

Xenopus laevis Yumurta hazırlanması ve Fraksiyonu ayıklar.

Vitro Nükleer Meclisi fraksiyonlara Xenopus Yumurta ayıklar kullanma

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis

Transgenik, üretimi Xenopus laevis Kısıtlama Enzim aracılığı ile Entegrasyon ve Nükleer Nakli

Üretimi

Β-katenin Bozulması Of Sulandırma

Hücre Testi Mitoz Sonu Kromatin dekondenzasyon Eğitim için