Name: imaging neutrophils and monocytes in mesenteric veins by intravital microscopy on anaesthetized mice in real time
Uploaded: 2015-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time at JoVE.com

This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.

NOT: Hayvan prosedürleri İsviçre&#39;nin Cenevre şehrinde Hayvan Bakım kurumsal Etik Komitesi ve Kanton Veteriner Dairesi ile uygun olarak yapıldı. Yetkilendirme numarası GE / 63/14. Kemik iliğinden tek bir hücre süspansiyonu hazırlanması 1. <ol><li> Servikal dislokasyon ile Kurban fare (eski 8-12 hafta). % 70 etanol ile arka ayakları sterilize. Arka ayakları cildi çıkarın. </li><li> Fare uyluk ve kaval kemiklerinden inceleyin ve bir neşter ile bacaklarından doku kaldırmak. PBS ile dolu bir kültür çanak içine% 90 etanol ve yer ile bacakları durulayın. </li><li> Diz ekleminde bir neşter ve ayrı olan uyluk ve kaval kemiklerinden kültürü kaputu, temiz dokusu altında. Kemiklerin her bir ucunu kesti. </li><li> 50 ml&#39;lik bir 23G iğne ve hazırlama ortamı (fenol kırmızısız DMEM / F12,% 1 sıçan serum) ile dolu bir 1 ml şırınga kullanarak her bir kemikten kemik iliği yıkayın tüp vidalı. Ince 23G NE içinden Pasajlanması hücre agrega DisruptEdle ve 1 ml&#39;lik şırınga. Hazırlık ortamı ile, 25 ml toplam hacim getirin. </li><li> Santrifüj 250 xg 5 dak, 4 ° C. Atın süpernatant. 1 ml içinde süspanse pelet Eritrosit Lizis RBLC tamponu 15 ml tüp vidası (8.3 g NH4CI, distile su ile 1 L&#39;ye tamamlandı 1 g NaHCO 3, 1 ml EDTA (100 mM), 0,22 um filtre). Buz üzerinde 30 saniye inkübe edin. </li><li> Hazırlık orta ve santrifüj 250 x g&#39;de 10 ml, 5 dakika, 4 ° C ekleyin. 2 ml hazırlanmış sıvı supernatant ve tekrar süspansiyon atın. </li></ol> Negatif Seçim ile 2. Nötrofil Zenginleştirme <ol><li> Fare nötrofil zenginleştirme kokteyli (hücre izolasyonu platformu kiti gibi EasySep gibi) 150 ul ekleyin. Karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> Fenol kırmızısı içermeyen DMEM 10 ml ekleyin. Bir kez ters çevirin ve santrifüj 250 xg, 3 dakika, 4 ° C. </li><li> Atın süpernatant. Alt tüpler yuvarlak 5 ml polistiren 1.75 ml hazırlık ortamda süspanse pelet. 250 ul ekle BiotSeçim Kokteyl. Karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> Tanecikleri yeniden sübyeleştirmek için 30 saniye için (hücre izolasyon platformu kit) manyetik parçacıkları vorteksleyin. Hücre süspansiyonunun 500 ul manyetik parçacıkların ekleyin. Karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> Cazibe merkezi haline tüp yerleştirin. 3 dakika bekleyin. </li><li> İstenen Etiketsiz hücreleri toplamak için alt tüpler yuvarlak yeni bir 5 ml&#39;lik polistiren üzerine mıknatıs ters çevirin. Tüp içinde asılı son damlasına almayın. İstenmeyen hücre mıknatıs içine bir tüp içinde kalır. Bir biohazard atık içine bu tüp atın. </li><li> Mıknatıs yeni tüp yerleştirin. 3 dakika bekleyin. </li><li> Yeni 15 ml istenen etiketsiz hücreleri toplamak için tüp vidalı üzerine mıknatıs ters çevirin. Tüp içinde asılı son damlasına almayın. </li><li> Fenol kırmızısı serbest DMEM ile 5 ml Komple hacmi. </li></ol> Nötrofiller 3. Etiketleme <ol><li> Böyle Hücre Tracker Orange olarak turuncu bir boya 0.5 ul ekleyin (çalışma konsantrasyonu1 uM, CMRA - klorometil-RODOL-asetat, hazır DMSO içinde 10 mM). 37 ° C &#39;de 2 dakika kuluçkalayın. </li><li> Hazırlama ortamına 2.5 ml ilave edilir. Santrifüj 250 xg 5 dak, 4 ° C. </li><li> Atın süpernatant. 1.5 ml bir tüp içinde 1 ml hazırlanmış sıvı içinde süspanse pelet. </li><li> Hematositometre ile saymak için bir kısım atın. </li><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edin. Santrifüj 250 xg 5 dak, 4 ° C. </li><li> Atın süpernatant. 1 ml PBS içinde yeniden süspanse pelet. Santrifüj 250 xg, 5 dk, yıkamak için 4 ° C. </li><li> Atın süpernatant. 100 ul PBS başına 10x10 6 hücre olarak süspanse pelet. Iv enjeksiyon kadar buz üzerinde tutun. NOT: Hücreler iv mümkün olduğunca çabuk enjekte olması gerekir. 6-12x10 6 nötrofil / fare genellikle elde edilir. </li></ol> İntra vital mikroskopik 4. Fare Hazırlama NOT:.. Adım 4.1) ve 4.2) ic üzerinde etiketli nötrofil uzun bekleme süresini önlemek için denemenin başında yapılmalıdıre. <ol><li> CX 3 CR1 GFP fare (eski 8-12 hafta) tartılır. </li><li> (PBS içinde 1.75 mg / kg ketamin acepromazone 60 mg / kg, ksilazin 4,5 mg / kg), anestezik 800 ul hazırlayın. </li><li> Fare anestezisi. Fare için 200 ul / 20 g Enjeksiyon ip. Kısma ayak tarafından ve solunum hızını kontrol ederek Kontrol anestezi. </li><li> Nötrofiller (100 ul PBS içinde 10x10 6 hücre), venöz deneyci kolaylık, yanal kuyruk venleri veya retro-orbital sinüs enjekte edilir. </li><li> Isıtma yastığı fare koyun ve göz jeli ile gözleri korumak. </li><li> Bir cam lamel (35 mm çapında), bir 30 mm çapında bir delik olan bir 10 cm doku kültürü çanağı içinde konur. Kullanım yağı lamel ile temas halinde doku kültürü çanak tutmaktır. </li><li> Periton maruz makas ile karın cildi İnsizyon. Bağırsak maruz makas ile periton İnsizyon. </li><li> 200 ul PBS p haline (37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış) ilaveeritoneal boşluğu. Elinizdeki fareyi alın ve bağırsak nazik bir basınç ile periton boşluğuna dışarı çıkar böylece, yüzü aşağı çevirin. Doku kültürü çanak fare yerleştirin. </li><li> Yavaşça mezenterik damarları açığa amacıyla lamel üzerine steril pamuk tomurcukları ile bağırsak tekrar turlama. </li><li> Bantlarında kağıt mendil kesin ve 37 ° C ısıtılmış PBS ile ıslatın. Peristaltizm kaynaklanan hareketleri azaltmak için kağıt dokuların adet bağırsak hareketsiz. </li><li> Ters mikroskop ısmarlama tepsi sahneye 37 ° C termostatlı hazne içerisindeki doku kültürü çanak ve fare koyun. Arka bacak içine anestezik sc içeren bir şırınga tanıtın. NOT: Ayrıca, fare bir maske ile oksijen (0.5 L / dk) alabilirsiniz. </li><li> Ayak kısma ve solunum hızı her 30 dakikada bir kontrol ederek anestezi Kontrol fare. Gerekirse, düzgün anesteziyi idame ettirmek için anestezik bir destek (20 ul) teslim. DEĞİLE: damar kurutulması kaçınılmalıdır. Bu nedenle, nem oranının düzenli 37 ° C ısıtılmış PBS ile bağırsak immobilize etmek için kullanılan kağıt mendil ıslatıcı tarafından yapılmaktadır. </li></ol> Intravital Mikroskobu kullanılarak In Vivo iltihaplı Gemiler 5. Ölçme Nötrofil ve Monosit Davranışı <ol><li> Set lazerler ve lazer 488- kaynaklı fototoksisite önlemek için gerekli olan en düşük güçte 561- etmek. Deneylerde, 0,5% &#39;den düşüktür. Nötrofillerinde monositlerinde GFP ve portakal boya Yoğunluğu genellikle% 0.3 yeterli olduğunu çok parlak olduğunu. NOT: Bu bizim sistemimizle 0.15 mW 0.25 bir lazer gücü temsil eder. </li><li> Ters mikroskop 20X kuru objektif kullanarak açık bir iğne deliği ile 2.2 saniyede 512 x 512 piksel (yani 635 mikron) görüntülerini elde edin. Düşük lazer güçler yeterli sinyal sağlayan 20 um 10 arasında bir z-derinlik kullanın. NOT: Biz genellikle 12 ila 16 arasında bir z-derinliği ile deneyler gerçekleştirmek56 m. Sunulan rakamlar ve film durumunda, z-derinlik 20 mm. Faz kontrast endotel duvar belirlenmesini sağlar ve görüntüleme mesenterik damarlar üzerinde gerçekleştirilir. Devriye gezen hücreler ilgi alanı kayıt, 5-10 mikron / dk 6 hızında oldukça yavaş hareket beri her 20 sn tatmin edicidir. Açıklanan ayarlar ile, motorlu sahne aynı anda ilgi kadar 7 alanların kayıt sağlar. </li><li> Onları ilk film edinimi önce 30 dakika boyunca hazırlık kurtarmak için izin vardır fare ve mikroskop termostat odasında mezenterik damarlar yerleştirin. Bu süre zarfında, ilgi alanlarını çeşitli seçin. Amacına en yakın geminin lümen yüzeyi üzerinde odaklanın. Gerekirse, odağı ayarlamak için endotel hafif otomatik floresan yararlanın. NOT: Fare hazırlanması sırasında Cerrahisi hafifçe endotelyumu vurguluyor. Sonuç olarak, nötrofillerin haddeleme ve/ veya monositler, ilk 15 dakika takiben fare hazırlanmasında gözlenebilir. </li><li> Kararlı hal şartları altında, 30 dakika, tek bir görüntü her 20 saniye için bir birinci film kaydedin. NOT: Yazılım 2.2 sn ilgi her alan kazanır ve motorlu sahne otomatik olarak diğer bir alandan geçer. Bu kayıt film 30 dakika boyunca geri 20 saniye içinde ilk pozisyona gider. </li><li> Kan damarı iltihabı başlatmak için, TLR2 100 ug içeren PBS 20 ul bir damla ekleme / TLR1 agonisti Pam3CSK4 12, doğrudan görüntü verilen gemilerin üzerine. </li><li> Ilgi her alan için odağı kontrol edin. NOT: edinim sırasında, her zaman vardır z ekseni üzerindeki odak küçük değişiklikler. 10-20 mikron z-derinliğine rağmen, bu floresans yoğunluğunu bir azalmaya neden olabilir. Gerekirse nedenle, el, her filmin sonunda ilgi her alan yönlendirmesi. 30 dakika-sürelerle ve 3 saat kadar Tutanak filmlerital inflamasyon başladıktan sonra. </li><li> Deneyin sonunda, servikal dislokasyon ile anestezi uygulanmış fare kurban. </li></ol> Film Dosyaları ve lökosit ve Takip 6. Nesil NOT: Nikon kazanım yazılım dosyalarını .nd2 üretir ancak aşağıdaki prosedür diğer yazılım ve markalar ile benzer olacaktır. <ol><li> Tiff serisi olarak ihracat dosyaları. </li><li> ImageJ yazılım (Git <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/).</a> Tiff serisi içe aktarın. Farklı bir dosya olarak Her kanal. </li><li> Arka plan gürültüsünü azaltmak için yeşil ve kırmızı kanallar (Süreç&gt; Filtreler&gt; Medyan ...) için 2.0 piksel yarıçaplı bir medyan filtre uygulayın. </li><li> (İkili olun&gt; Proses&gt; Binary) ikili dosyaları dönüştürün. Her görüntü için eşiği hesaplamak için yazılım etkinleştirin. </li><li> Bir resim serisi (Görüntü&gt; Renk&gt; ... Kanallar Merge) içine kanalları Birleştirme. Lenmesi, monositler seçinn kanal, kırmızı kanal ve gri kanalda iletilen ışık nötrofiller bulunmaktadır. </li><li> RGB renk içine yığılmış görüntüleri dönüştürün (Görüntü&gt; Renk&gt; RGB Stack). </li><li> Avi olarak dosyayı kaydedin </li><li> Veriler ithal ve Imaris yazılımı (Bitplane) derlenmiştir. Monosit ve nötrofillerin hareketleri sonra Nokta İzleme Sihirbazı kullanılarak izlenir. </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaching+multiple+barriers:+leukocyte+motility+through+venular+walls+and+the+interstitium.">Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues.">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41, 694-707 (2014).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11.+Intravital+microscopic+investigation+of+leukocyte+interactions+with+the+blood+vessel+wall.">Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall.</a> Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).</li><li>Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+leukocyte+rolling+in+vivo+and+in+vitro.">Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro.</a> Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).</li><li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+blood+vessels+and+tissues+by+a+population+of+monocytes+with+patrolling+behavior.">Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior.</a> Science. 317, 666-670 (2007).</li><li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors.">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33, 375-386 (2010).</li><li>Hanna, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+NR4A1+(Nur77)+controls+bone+marrow+differentiation+and+the+survival+of+Ly6C-+monocytes.">The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes.</a> Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+junctional+adhesion+molecule+JAM-C+regulates+polarized+transendothelial+migration+of+neutrophils+in+vivo.">The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo.</a> Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).</li><li>Proebstl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+support+neutrophil+subendothelial+cell+crawling+and+breaching+of+venular+walls+in+vivo.">Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo.</a> J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).</li><li>Wantha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+cathelicidin+promotes+adhesion+of+classical+monocytes.">Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes.</a> Circ Res. 112, 792-801 (2013).</li><li>Ozinsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repertoire+for+pattern+recognition+of+pathogens+by+the+innate+immune+system+is+defined+by+cooperation+between+toll-like+receptors.">The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).</li><li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo.">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498, 371-375 (2013).</li><li>Carlin, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nr4a1-dependent+Ly6C(low)+monocytes+monitor+endothelial+cells+and+orchestrate+their+disposal.">Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal.</a> Cell. 153, 362-375 (2013).</li><li>Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+mouse+bone+marrow+monocytes+in+vivo.">Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Iqbal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD68+promoter+GFP+transgenic+mice+allow+analysis+of+monocyte+to+macrophage+differentiation+in+vivo.">Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo.</a> Blood. 124, e33-e44 (2014).</li><li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation.">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PloS One. 6, e25109 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu yazıda anlatılan metodolojiler verimli kararlı durum ve inflamatuar koşullarda mezenterik venlerde monosit ve nötrofil davranışlarını incelemek için tutarlı bir yaklaşım sağlamak. Hazırlık önemli adım PBS ıslak mendil ile bağırsak immobilizasyonu olduğunu. Düzgün gerçekleştirilen Eğer mezenterik damarlar güzel görüntü elde etmek için lamel maruz kalmaktadır. Bu mezenterik venlerde lökosit davranışını izlemek için ilgi çeşitli alanlarda seçimini sağlar. Bizim protokolü (1) doğrudan izlenen damarlarda enflamasyon ikna etmek, ve (2) stimülasyon sonra erken zaman noktaları kaydetmek ve (3) kinetiği takip etmek sağlayarak, deneylerin başlamasından önce mezenterik damarların eksteriorizasyon içerir lökositlerin işe öncesi ve inflamasyon indüksiyon sonrası aynı kap içinde davranışları. Biz transfdaha fazla hücre (0.5-2x10 6 / fare vs 6-12x10 6) hayvan başına elde edilebilir er nötrofiller aynı genetik kökenli fare kemik iliğinden saflaştınldı ve kandan. Kan nötrofillerinin kullanılması tercih edilir ise, aynı protokol hücre saflaştırılması için gerçekleştirilebilir. Intravital görüntülemede, damar görüntüleme mezenterik damarların durumunda iletilen ışık etkindir. Alternatif olarak, PECAM1 karşı floresan antikor (klon 390) ya da floresan yüksek molekül ağırlıklı dekstran (70kDa veya 2 MDa) 6,14 damarsal algılamak için enjekte iv olabilir. Örneğin, 3 ug anti-PECAM1 (klon 390) intra-skrotal enjeksiyon, düşük arka plan ile damar algılamasını etkinleştirmek ve cremaster modeli 9 lökosit aktivitesini etkilemediği bildirildi. Iletilen ışık ile karşılaştırıldığında, floresan antikorlar veya boyaların kullanımı özellikle vascu 3D rekonstrüksiyon olasılığını tanıttılature ama kanalının etiketleme öldürülür ve elde etme süresi artar. Burada tarif edildiği gibi İletilen ışık, damar şeffaflık mezenter modeli sayesinde yeterlidir. Aksine, damar floresan etiketleme kulak dermiş veya opak organlarda zorunludur. Lökosit popülasyonları tespiti belirli bir hücre tipinde endojen floresan sergileyen transjenik hayvanlar (; monositler ve nötrofiller Lys EGFP 9 ve trombositler CD41 YFP 17 monositler Cx 3 CR1 eGFP / ağ 6 veya cd115 CFP 15 veya CD68 gfp 16) kullanılarak elde edilebilir . CX3CR1, Cx 3 Tüm monositlerin ve NK ve T hücrelerinin, bazı alt gruplarında CR1 eGFP / ağırlık fare ifade edilir, ancak iltihap LY6C &lt;ayırt etmek ilginçtirsup&gt; yerleşik Ly6C düşük monositler 6 daha az GFP floresan sergileyen yüksek monositler. CD115 monositik ait özel bir olduğu için, bir fare MacBlue cd115 CFP ilginç bir modeldir. Ancak Ly6C yüksek ve alçak Ly6C monositlerini ayırt etmek mümkün değildir. Transgenik floresan farelerin bir alternatif gerçek zamanlı olarak lökositlerin popülasyonları etiket floresan antikor iv enjeksiyonu olduğunu. Örneğin, monositler, anti-CD115 (klon AFS98), anti-CD49b (klon HMα2) anti-Ly6G (klon 1A8) olan nötrofil ve trombosit ile etiketlenebilir. Genel olarak, bu antikorlar, yüksek bir dozda tükenmektedir. Bu nedenle, bazen kısa bir süre için ve düşük seviyelerde dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır. Hatta düşük dozda, hücre fonksiyonu üzerinde bir etkisi göz ardı edilemez olduğu not edilmelidir. Düşük miktarlarda (1-2 mikrogram) ile kişisel deneyim CD115 + mon etiketlenmesi sağlartükenmesi olmadan ocytes ve Ly6G + nötrofiller (veri yayınlanmadı). Kulak bakir olduğu gibi kulak dermis damarsal model non-invaziv olmasına rağmen, kulak dermis derinliği onu yapar, bir husustur 2-foton mikroskopi 13 için daha uygun bir modeli. Ayrıca, doğrudan fiziksel hazırlık bozmadan kulak modelinde kap teşvik etmek mümkün değildir. Bizim protokol herhangi bir ters konfokal mikroskop ile uygulanabilir. Tarama hızı ve lazer güç makine bağımlı, olduğu tek z-düzleminde bir kare (512 x 512 piksel, yani 635 mikron) edinimi Nikon A1R&#39;ye ve galvano tarayıcı için bizim ayarlarla yaklaşık 2.2 sn gerektirir. Ne yazık ki, bu düşük hızda kalite kaybı olmadan mezenterik damarların dört boyutlu film kaydı olasılığını sınırlamaktadır. A1R&#39;ye rezonans tarayıcı olmasına rağmen, yüksek bir edinim hızı sunuyorGörüntülerin kalitesi kuvvetle CX 3 CR1 GFP / ağırlık fare ile deneyler için (spesifik sinyal karşı background) azalır. Bu lazerler fototoksisite ve ağartma önlemek için% 0.5&#39;in altında (&lt;0.25 mW) ayarlanır akılda tutulmalıdır. Woodfin ark Leica TCS-SP5 9 kullanarak cremaster venüllerin (40 sn 60 z-yığın görüntüleri) 4D film elde başardı. Çapı 20-40 mikron yazarları görüntü değerlerine gelince, onlar muhtemelen bizim modeli (200-400 mikron mezenterik damarların izlenmesi) &#39;den odak değişikliklere daha az duyarlıdır. Canlı doku görüntüleme yaparken, odak kontrolü birkaç saat süren eşsiz bir film kaydetmek imkanı kısıtlar en önemli endişe olduğunu. Biz 30 dakika (ya da 45 dakika) süren film kaydı mezenterik modelinde en pratik olduğunu düşünüyoruz. Toll benzeri reseptör agonistlerinin ekleme kabı genişliğini ve dolayısıyla odak değiştirir. Sonuç olarak,gemiler stabilize kadar stimülasyon sonra düzgün resmin ilk 10-15 dk çok zordur. Başka bir sınırlama deney süresidir. Uzun bir süre boyunca uygun şekilde anestezi fare korumak için zorluk nedeniyle, iltihap sonrası 4 saat daha görüntü zordur. (Bizim tarafımızdan test olmasa da) bu tür sürekli izofluran inhalasyon gibi diğer anestezikler, kullanımı bir seçenek olabilir. Eski farelerde (yaş 16 hafta boyunca), damarların çevresinde yağ mevduat miktarının artması mezenterik damarların görüntülenmesi kalitesini düşürmektedir. Bu nedenle, 8-12 haftalık fareler ile deneyler çalıştırmak daha iyidir. Bu teknik ilgi moleküllerinin bloke etmek veya lökosit göçünün ya da davranış implike moleküllerin önemini tespit edilebilir, böylece, belirli bir lökosit popülasyonları tüketmek için antikorların iv enjeksiyonu ile kombine edilebilir. Buna ek olarak,Diğer lökosit alt-gruplar ilgi hücre popülasyonlarında floresan proteinleri eksprese eden transgenik fare suşları, diğer kullanılarak takip edilebilir.

<html> Nötrofiller ve monositler sürekli dolaşıma doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücreleri bulunmaktadır. Yaralanma ya da enfeksiyon üzerine, enflamatuar sinyaller burada hücresel bir bağışıklık tepkisi başlatılması 1-3, hasar görmüş enfekte dokulara lökosit ROS neden olur. Lökosit seferberlik hızlılığı bağışıklık tepkilerinin olumlu sonucunu belirler. Bu karmaşık süreçler lökosit karışmış moleküller üzerinde anlayışlar elde .To dolaşan lökositler ve endotelyum 1-3 arasındaki yapışma temasların kurulması için yardım iltihaplı endotel üzerinde bulunan belirli moleküllerin (örneğin, selektinler, endotel bağlı kemokinler) güveniyor işe alım çağlayan, hücre işe kinetiği görselleştirmek için ve her bir hücre / nüfus davranışlarını izlemek için önemlidir. Etkili bir yöntem ilgi hücrelerinde floresan proteinleri eksprese eden transgenik fareler üzerinde İntra vital mikroskopik içerir. Bugüne kadar içeriği &quot;&gt;, intravital mikroskopi kullanılarak çeşitli yaklaşımlar görüntüye geliştirilen damar 4,5. Mesela, kulak dermis damar sistemi ya da intravital konfokal mikroskobu ile mezenterik damarların görüntüleme kemirgen Ly6C düşük monosit ve insan devriye davranışını tanımlamak için kullanılan CD14 kararlı hal şartları altında 6-8 kan damarlarının lümen tarafında CD16 + monositleri dim. Fare cremaster damar modeli, genellikle transgenik farelerin enflamatuvar veya iskemik koşullar altında nötrofil veya enflamatuar Ly6C yüksek monosit davranışını izlemek için kullanılır. Bu ise durumda, Cremaster IL1β, CCL2, TNFβ ya fMLP intraskrotal enjeksiyon ile uyarılır. 2-4 saat sonra, dokular daha sonra cerrahi dışarı çıkarılmıştır ve intravital konfokal mikroskopi 9-11 ile analiz edilmiştir. Aşağıdaki protokol bir ile aynı anda monositleri ve nötrofilleri izlemek için bir yöntemi tarif etmektedirters floresan konfokal mikroskop. Ayrıca, yöntem lökosit işe kinetiği takip nasıl daha önce görüntü aynı geminin (kararlı hal durumu) ve inflamasyon sonra nasıl ayrıntıları. Bu amaç için, olan monositler eGFP ifade iv portakal renkli bir boya etiketli kemirgen nötrofillerinin, enjekte CX 3 CR1 gfp / ağ fare kullanılır. Ters konfokal mikroskop kullanılarak, (1) izler ve kararlı koşullar ve (2) lokal enflamasyon sonrasında aynı kap içinde iki monosit ve nötrofillerin ilerlemesini takip etmek altında devriye Ly6C düşük monositleri analiz etmek mümkündür. Burada TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 12 kullanarak inflamatuar koşullar yaratır. Ayrıca, bu tür görüntüleme belirli nakavt fareler üzerinde ya da engelleme antikorların 6,9,13 varlığında gerçekleştirilir ise lökosit işe çağlayan çeşitli adımlar ilgi belirli moleküllerin rolünü belirlemek için yardımcı olabilir.

<table><tbody><tr><td>5 ml polystyrene round bottom tubes&amp;nbsp;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>10x CFI Plan Apochromat 0.45&amp;nbsp;&amp;nbsp; DT:4mm&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange CMRA Dye</td><td>Life Technologies</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-042</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil Type A</td><td>Nikon</td><td></td><td>any viscous oil&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Life Box Temperature Control System</td><td>Life Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R confocal microscope</td><td>Nikon</td><td>A1R</td><td>inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>phenol red free DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>21041-025</td><td>any phenol red free medium is suitable</td></tr><tr><td>PAM3CSK4</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pms</td><td>reconstitute in PBS</td></tr><tr><td>Rat serum</td><td>Stem Cell Technologies</td><td></td><td>included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit</td></tr><tr><td>Tissue culture dish 100</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging neutrophils and monocytes in mesenteric veins by intravital microscopy on anaesthetized mice in real time

Etkin bağışıklık tepkisi enfeksiyon veya hasar bölgesinde kan lökositlerinin hızla harekete bağlıdır. In vivo lökosit göçü incelenmesi damar endotel ile lökosit endotel göç ve etkileşim moleküler temelini anlamak için çok önemlidir. Bir etkili bir yaklaşım ilgi hücrelerinde floresan proteinleri eksprese eden transgenik fareler üzerinde İntra vital mikroskopik içerir. Burada bir ters konfokal mikroskop ile turuncu boya etiketli nötrofil enjekte CX 3 CR1 GFP / ağırlık fare iv görüntüleme monosit ve nötrofillerin için bir protokol mevcut. Time-lapse film hem kararlı hal ve inflamatuar koşullarda mezenterik venlerde lökosit davranışının analizine imkan görüntüleme birkaç saat 30 dk toplandı. Yerel TLR2 / TLR1 agonisti Pam3SK4 kan damarı inflamasyonunu indüklemek ve subseque izlemek Ayrıca adımları açıklarnötrofil ve monositlerin nt işe. Sunulan teknik aynı zamanda lökositlerin diğer popülasyonları izlemek ve diğer uyaranlara veya transgenik fareler kullanılarak lökosit alımı veya insan ticareti karışmış molekülleri araştırmak için kullanılabilir.

Eser gerçek zamanlı olarak kolayca anestezi farelerin mesenterik damarlar içindeki monosit ve nötrofillerin davranışını izlemek için optimize edilmiş bir protokol açıklamaktadır. 37 ° C-termostatlı odacığın kullanımı fare sıcaklığı korumak için zorunludur ve aynı zamanda nedeniyle lökositlerin sıcaklığa bağlı hareket etmektir. Fare hazırlanması Şekil görüntülenir 1. Şekil 2 mikroskop altında görülen tüm bölgeyi gösterir. İletilen ışık mezenterik damarlar (kırmızı ok) ve arterler (mavi ok) belirlenmesini sağlar. Böyle Movie 1 ve Film 2 olarak ImageJ yazılımı oluşturulan film dosyaları ile elde edilen görüntülerin tedavisi. 3 görüntüler Film ilk zaman noktası için görüntü işleme farklı adımları Şekil 1. Film 1 kararlı hal koşullarında Ly6C düşük Monositlerin devriye gösterir daha önce de olduğu gibiTüm nötrofil kan dolaşımında oysa 6,8,14 kayıtsız kalamayız. Hiçbir nötrofil endotel duvarı devriye geziyor. Film 2 yerel iltihabı başlatmak için TLR2 / TLR1 agonisti Pam3CSK4 eklendikten sonra faiz 90 dakika aynı alanını gösterir. Bu durumda, nötrofiller ve monositler kitlesel onlar titizlikle tarama endotel duvarına işe alınırlar. Bu TLR agonistinin bu ilaveli endotel genişliği değişikliğe sebep ve sonuç olarak z ekseni odağını değiştirir dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, odak dikkatle agonist ilave edilmesinden sonra kontrol edilmelidir. Imaris yazılımı (Bitplane) veri derlenmesi Nokta İzleme Sihirbazı kullanarak bireysel lökosit takibi sağlar. Şekil 4 endotel boyunca devriye gezen monositler (yeşil) ve nötrofil (kırmızı) tam parça yollarını gösterir. Veri, yani 90 dakika inf başladıktan sonra, Film 2 analizinden elde edilirlammation. Lökosit yolları Takibi gibi hat uzunluğu, yer değiştirme, süre veya hız gibi çeşitli istatistikleri almak tiff dosyaları veya xls dosyaları olarak ihraç edilebilir. Bu teknik, önce ve iltihabı sonra, aynı zamanda monositlerin ve nötrofillerin davranışını izlemek için iyi bir yol sunar. Bu endotel duvar mesai bu hücrelerin işe izlemek mümkündür. Z ekseni ya da x / y deplasman odaklanma kaybı deneyi berbat bağırsak hareketlerinin bir sonucu olarak ortaya çıkabilir. Film 3 gibi başarısız hazırlık ve satın alma göstermektedir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53314/53314fig1.jpg" /> 1. Fare hazırlık Şekil. Siyah oklar bağırsak hareketsiz kullanılan PBS ıslatılmış doku gösterir. Beyaz ok 10cm doku kültürü çanak gösterir. T mikroskop sığar alüminyum ısmarlama tepsi sahne gösterir. Mesenter<html> kan damarları güzel lamel merkezinde maruz kalmaktadır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53314/53314fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53314/53314fig2.jpg" /> Mezenterik ven ve arterlerin 2. Şubeler Şekil. 10X amacı ile çekilen görüntüler (20 x 10) mevcuttur alanın büyük bir görüntü teşkil dikişli bulundu. Çevrede çeşitli alanlar daha sonra bir 20X objektif lökosit hareketi izlemek için seçilir. Kırmızı ok bir mezenterik ven gösterir. Mavi ok mezenterik arter gösterir. Yeşil ok damarları çevreleyen yağ dokusu gösterir. Islanan doku varlığı görüntü sonuçları tarafta karanlık alan bağırsak hareketsiz hale getirmek için kullanılır. Beyaz ölçek çubuğu 1 mm temsil eder.k &quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53314/53314fig3.jpg" /> ImageJ ile 3. Görüntü işleme Şekil. Görüntü işleme farklı aşamaları ayrı ayrı ele alınmaktadır Film 1. Yeşil (monositler) ve kırmızı (nötrofiller) ilk kanal görüntü için gösterilmiştir. Orijinal ham verilerin (A) için, medyan filtresi (B) uygulanır ve daha sonra bir ikili görüntüde (C) dönüştürülür. (D) Kanallar nihai görüntüye birleştirilir. Ham veri gözlenen yeşil veya kırmızı çizgiler mikroskop tamamen onları elde etmek mümkün olmadığı kadar hızlı hareket ediyor hücrelerdir. Beyaz ölçek çubuğu 40 mikron temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53314/53314fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53314/53314fig4.jpg" /> Şekil 4. Bireysellökosit izler. Monositler (A) ve endotel devriye nötrofillerin (B) Parçalar Imaris Yazılımı (Bitplane) ile işlenir. Beyaz ölçek çubuğu 40 mikron temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53314/53314fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/53314/53314mov1.jpg" /> Film kararlı durumdaki endotel duvarı tarayarak 1. Lökositler. Kararlı durumda, Ly6C düşük monositler endotel devriye. Nötrofiller kan akımına göre dolaşmaktadır. Nötrofiller kırmızı ve monositler yeşil bulunmaktadır. Ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder. 20X amacı ile oluşturulan. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53314/Movie1.avi" target="_blank">Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> ge = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/53314/53314mov2.jpg" /> 2:. Lökositler TLR2 aracılı iltihap sonrası endotel duvar tarama ilgi aynı alan Film 1 &#39;deki gibi film 90 dakika ile doğrudan gemiye Pam3CSK4 (TLR2 / TLR1 agonist), 100 ug içeren PBS 20 ul ilave edildikten sonra başlar. Işe monositler ve nötrofiller titizlikle endotel duvarı taradığınız. Nötrofiller kırmızı ve monositler yeşil bulunmaktadır. Ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53314/Movie2.avi" target="_blank">Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Film 3" src="/files/ftp_upload/53314/53314mov3.jpg" /> Film 3: Yanlış fare hazırlama elde edilen sonuçlar anestezi veya bağırsak immobilizasyonu yanlıştır elde edilen gemilerin hareketleri.. Ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder.f = &quot;https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53314/Movie3.avi&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time at JoVE.com

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

imaging-neutrophils-monocytes-mesenteric-veins-intravital-microscopy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.4K Görüntüleme.  University of Geneva. We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Video: Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Farelerde mesenteriumda Damarlardaki intravital Mikroskopi Lökosit-endotelyal ve Trombosit-lökosit Etkileşimleri

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

IL-1β Promoter odaklı DsRed Muhabir Fare kullanma Nötrofil Hazırlama intravital Görüntüleme

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

için Femur Pencere Odası Modeli<em&gt; İn Vivo</emFare Kemik İliği içinde&gt; Hücre Takibi

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic stenosis. Vascular surgery is a viable option in selected cases, but for patients without indications for surgery such as progression to rest pain, critical limb ischemia, or major disruptions to life or work, there are few possibilities for mitigating their disease. Cell therapy via monocyte-enhanced perfusion through the stimulation of collateral formation is one of a few non-invasive options.
Our group examines arteriogenesis after monocyte transplantation into mice using the hindlimb ischemia model. Previously, we have demonstrated improvement in hindlimb perfusion using tetanus-stimulated syngeneic monocyte transplantation. In addition to the effects on the collateral formation, tumor growth could be affected by this therapy as well. To investigate these effects, we use a basement membrane-like matrix mouse model by injecting the extracellular matrix of the Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma into the flank of the mouse, after occlusion of the femoral artery.
After the artificial tumor studies, we use intravital microscopy to study in vivo tumor-angiogenesis and monocyte homing within collateral arteries. Previous studies have described the histological examination of animal models, which presupposes subsequent analysis to post-mortem artifacts. Our approach visualizes monocyte homing to areas of collateralization in real time sequences, is easy to perform, and investigates the process of arteriogenesis and tumor angiogenesis in vivo.

Monocytes are important mediators of arteriogenesis in the context of peripheral arterial disease. Using a basement membrane-like matrix and intravital microscopy, this protocol investigates monocyte homing and tumor-related angiogenesis after monocyte injection in the femoral artery ligation murine model.

Monosit posta ve tümör ile ilgili angiogenez periferik arter hastalığı, bir fare modeli intravital mikroskobu

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Tıp

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for analyzing collateral arteries and leukocytes in arteriogenesis is ex vivo (immuno-) histological methodology. However, this technique does not allow the measurement of dynamic processes such as blood flow, shear stress, cell-cell interactions, and particle velocity. This paper presents a protocol to monitor in vivo processes in growing collateral arteries during arteriogenesis utilizing intravital imaging. The method described here is a reliable tool for dynamics measurement and offers a high-contrast analysis with minimal photo-cytotoxicity, provided by multiphoton excitation microscopy. Prior to analyzing growing collateral arteries, arteriogenesis was induced in the adductor muscle of mice by unilateral ligation of the femoral artery.
After the ligation, the preexisting collateral arteries started to grow due to increased shear stress. Twenty-four hours after surgery, the skin and subcutaneous fat above the collateral arteries were removed, constructing a pocket for further analyses. To visualize blood flow and immune cells during in vivo imaging, CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (platelets) and CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytes) antibodies were injected intravenously (i.v.) via a catheter placed in the tail vein of a mouse. This article introduces intravital multiphoton imaging as an alternative or in vivo complementation to the commonly used static ex vivo (immuno-) histological analyses to study processes relevant for arteriogenesis. In summary, this paper describes a novel and dynamic in vivo method to investigate immune cell trafficking, blood flow, and shear stress in a hindlimb model of arteriogenesis, which enhances evaluation possibilities notably.

The recruitment of leukocytes and platelets constitutes an essential component necessary for the effective growth of collateral arteries during arteriogenesis. Multiphoton microscopy is an efficient tool for tracking cell dynamics with high spatio-temporal resolution in vivo and less photo-toxicity to study leukocyte recruitment and extravasation during arteriogenesis.

Bir Murin Arka Bacak Modelinde Arteriyogenez Sırasında Lökosit Alımını İzlemek için Multifoton İntravital Görüntüleme

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

<meta charset="utf8"></head><body>I/R Hasarı Sırasında Lökosit Yapışması ve NET Oluşumunda Endotelyal PAR1 Rolü

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules After Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy

Intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury is an acute condition characterized by tissue damage resulting from restricted blood flow to the mesenteric vessels, leading to both local and systemic pathologies with a poor prognosis. Both ischemia and reperfusion trigger a series of cellular and molecular responses, with inflammatory cells serving as key regulators of the pathology. These interactions with the ischemic endothelium are mediated by multiple adhesion receptors. Several animal models have been established to mimic this pathology and investigate the involved molecular pathways. In this study, a microsurgical model of I/R injury is combined with intravital microscopy to visualize leukocyte rolling, adhesion, and neutrophil extracellular trap (NET) formation. This model is applied to transgenic mice deficient in endothelial PAR1 (F2r) to assess the impact of PAR1 on leukocyte rolling and NET formation 1 h after ischemia and immediately following reperfusion. In vivo, Acridine Orange leukocyte staining was employed, and NETs were visualized using a nucleic acid stain. Interestingly, reduced leukocyte adhesion and NET formation were observed in mice lacking the endothelial PAR1 receptor. This model enables the in vivo analysis of key regulators involved in I/R injury.

<meta charset="utf8"></head><body>Mezenterik İskemi-Reperfüzyon Yaralanması Sonrası Mezenterik Venüllerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İntravital Mikroskopi ile Görüntülenmesi

This protocol presents a method for inducing mesenteric ischemia-reperfusion injury and visualizing neutrophil extracellular traps (NETs) in mesenteric venules using intravital microscopy. Blood flow in the superior mesenteric artery was restricted for 1 h, followed by reperfusion, allowing direct quantification of leukocyte adhesion and NETosis.

Mezenterik İskemi-Reperfüzyon Yaralanması Sonrası Mezenterik Venüllerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İntravital Mikroskopi ile Görüntülenmesi

Intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury is an acute condition characterized by tissue damage resulting from restricted blood flow to the mesenteric ...

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Farelerde mesenteriumda Damarlardaki intravital Mikroskopi Lökosit-endotelyal ve Trombosit-lökosit Etkileşimleri

IL-1β Promoter odaklı DsRed Muhabir Fare kullanma Nötrofil Hazırlama intravital Görüntüleme

için Femur Pencere Odası Modeli

Monosit posta ve tümör ile ilgili angiogenez periferik arter hastalığı, bir fare modeli intravital mikroskobu

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

Bir Murin Arka Bacak Modelinde Arteriyogenez Sırasında Lökosit Alımını İzlemek için Multifoton İntravital Görüntüleme

Mezenterik İskemi-Reperfüzyon Yaralanması Sonrası Mezenterik Venüllerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İntravital Mikroskopi ile Görüntülenmesi

Mezenterik İskemi-Reperfüzyon Yaralanması Sonrası Mezenterik Venüllerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İntravital Mikroskopi ile Görüntülenmesi