Name: methods for precisely localized transfer of cells or dna into early postimplantation mouse embryos
Uploaded: 2015-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos at JoVE.com

We thank Filip Wymeersch and Anestis Tsakiridis for comments on the manuscript, staff in the SCRM animal unit for help with animal maintenance and Prof. Stuart Forbes for immunohistochemistry reagents. This work was supported by MRC grant Mr/K011200/1 and the China Scholarship Council

Hayvanlar (Bilimsel Usul) &#39;de belirtilen tüm hayvan deneyleri Proje Lisans numarası 60/4435 altında İngiltere Home Office Yönetmeliği uyarınca (1986) Yasası gerçekleştirilmiştir. Belirli gelişim aşamalarında embriyolar toplamak için, zaman aşımına çiftleşmelerin O / N kuruldu. Vajinal fişi bulma günü Noon embriyonik gün (E) 0.5 belirlenmiştir. 1. Ex Vivo Kültür E7.5 veya E8.5 Postimplantation Embriyolar Kesme <ol><li> Servikal dislokasyon ile hamile kadın fareler kurban. </li><li> Forseps ile tutarak, makas kullanarak rahim yalıtmak ve M2 ortamı ile dolu bir 30 mm çanak yerleştirin. </li><li> Dikkatle ince forseps iki çift kullanarak myometriumu parçalıyorlar. </li><li> Extraembryonic boşlukları delinme için dikkatli olmak, desidua uzakta soyun. </li><li> Forseps ile sıkıştırdıktan ve yavaş yavaş embriyo ayrılarak Reichert membran kaldırmak. </li><li> Diseksiyon altında embriyolar Kontrolstereomikroskopta yolk kesesi, amniyon ve ectoplacental koni bozulmamış olduğundan emin olmak için. </li><li> Buz üzerinde 30 mm plastik Petri kabı kapağı üzerine (&#39;buz platformu&#39;) kısmen soğuk embriyolar bir pipet ve yer kullanarak M2 temiz bir çanak embriyolar aktarın. </li><li> Eğer gerekirse, fazla 1,5 saat boyunca bir buz platformu, örneğin., Ortam hazırlanması veya küçük gruplar halinde manipülasyonu sırasında M2 mağaza embriyolar ~ oda sıcaklığında 3-4 embriyolar. Not: kurtarma ve kemirgen embriyoların diseksiyon önce 7,8,16 detaylı bir şekilde tarif edilmiştir. </li></ol> 2. Embriyo Kültürü Orta hazırlayın <ol><li> Taze ticari olarak temin edilebilen sıçan serumu, ya çözülme (özellikleri için Glanville Jones ve ark., 13 bakınız) ya da sıçan serum ısı 56 ° C&#39;de 30 dakika süre ile inaktive edilmiş ve 1 ml donmuş Copp ve Cockroft 16 uyarınca in-house hazırlanmıştır -80 ° C&#39;de tümbölenler Not: Piyasada satılan sıçan serum kabul edilebilir<html> Serum in-house hazırlanan rağmen 24-36 saat kültür dönemleri için, 48 saat kadar kültür dönemleri için üstün tecrübemizle, içinde. </li><li> Taze bir fazlalığı hazırlamak (ör., 10 mi) Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM),% 1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 2mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat içeren tanımlanmış takviyeleri. </li><li> Kültüre olacak her aşamasının embriyo sayısına göre gerekli kültür ortamına hacmini hesaplayın (Bölüm 3). % 50 kültür ortamının telafi etmek için tanımlanmış takviyeleri ile sıçan serumu karıştırın (1: 1 (h / h) sıçan serum: tanımlanan katkı) ve / veya% 75 kültür ortamı (3: 1 (hacim / hacim) sıçan serum Tanımlanmamış takviyeleri). </li><li> 0.45 um&#39;lik bir filtreden embriyo kültür ortamı geçmek ve 10.000 IU / ml penisilin ve 10 ug / ml streptomisin ekleyin. Not: Taze çözülmüş L-glutamin ve sodyum piruvat solüsyonu ex vivo kültür sırasında embriyonun gelişimi için çok önemlidir. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Farklı Embriyonik Aşamaları için Ex Vivo Kültür Koşulları <ol><li> 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de hava içinde% 5 CO2 ile birlikte, bir kuluçka makinesi içinde 4 oyuklu plakalar kullanılarak statik kültürü: E7.5 embriyolar için. 1 ml% 50 kültür ortamında oyuk başına iki embriyolar kültürü. </li><li> E8.5 embriyo için: 24 saat (embriyo başına 1 mi,% 50 kültür ortamı) 37 ° C&#39;da hava içinde% 5 ile CO2 sürekli gazlama içeren 35 devir / dakika ile dönen bir silindir, kültür cihazı 8 kullanın. </li><li> E9.5 embriyolar için: 24 saat (1 ml 75% &#39;si kültür ortamı için 35 devirde 37 ° C&#39;de,% 5 CO2,% 40 O 2% 55 N2 ile birlikte / dakika içeren gazlar döner bir silindir kültür cihazı kullanın embriyo). Not: 3 saat içinde Kültür embriyoların olumsuz gelişimini etkileyen M2 uzun süreli olarak fareler euthanizing sonra. Ex vivo embriyo kültürü yöntemi COPP&#39;un ve Cockroft 16 Bkz. </li></ol> 4. GraftinE7.5 veya E8.5 Fare embriyolara g Kültürlenmiş hücreler <ol><li> Fiziksel bir 20-200 ul pipet kullanarak 6-kuyu kültür plaka yayg GFP ifade EpiSCs, kazıma ve embriyoları içeren bir 30 mm çanak koyun Not: embriyolarda hücre kümeleri eklemek için, hücreler fiziksel hurdaya yerine tripsinize edilmelidir. </li><li> Ağız pipet yapmak için aspiratör borusuna bir el çekti aşılama kılcal takın. </li><li> Yavaşça aşılama kılcal içine boyutta bir veya daha fazla hücre kümeleri&gt; 20 hücreleri çizmek için ağız pipet emmek. </li><li> Yavaşça kısmen büyük öbekler dağıtmak için, hücrelerin dışarı üflemek. </li><li> Kılcal açılması yakın tutarak, ~ 10-20 hücre içeren bir hücre yığın seçin ve tekrar aşılama kılcal içine emmek. Ve defalarca kılcal dışına hücre yığın taşımak için dikkatli olun, küçük parçalar halinde break-up önlemek için. </li><li> Forseps bir çift ile yerine gevşek embriyo tutun ve aşılama eklemekilgi bölgeye kılcal bir açıklık oluşturmak için. </li><li> Yavaşça embriyo ettiler 10-20 hücrelerinin kısa bir dize bırakarak, aşılama kılcal dışarı tutam sınırdışı. </li><li> Embriyo istenilen sayıda aşılama işlemi tekrarlayın. Kolaylık için 3-4 embriyo parti büyüklüklerini kullanın. </li><li> Aşırı ışık ve ısı embriyoların maruz kalmasını önlemek için minimumda görüntüleme süresi tutarak, M2 ortamı, görüntünün kamera ile mikroskop diseksiyon bir floresan bileşik kullanılarak aşılı embriyolar aynı çanak embriyolar bırakmak. Not: Bu kamera ve bir mikroskop gibi florofor doğası ve floresan yoğunluğuna özelliklerine bağlıdır gibi deneysel görüntüleme kez saptayın. </li><li> M2 orta minimal hacimde bir pastette embriyo transfer kültür ortamı (Bölüm 3) hemen görüntüleme sonrası dengeye önceden etmek. Not: dikkatlice aşılama sonrası embriyoların morfolojisini incelemek. Intac Sadece kültürt embriyolar. </li></ol> 5. El yapımı Elektroporasyon Malzemeler ve Cihazlar Kurulum (Elektroporasyon Deneylerin Advance ardından hazırlayın): <ol><li> DNA enjeksiyonu pipetler için: Yatay mikropipet çektirmenin kullanılarak DNA enjeksiyon pipetler çekin. Enjeksiyon pipetler embriyonik boşlukların içine DNA enjekte, doku hasarı önlemek için bir açıklık 10 um&#39;den daha ile iyi bir uca sahip olmalıdır. </li><li> Cam kılcal elektroporasyon için: 20 ya da 30 um ya da bir iç çapa DNA enjeksiyonu pipetler açılmasını kesmek için microforge kullanın. Kılcal elektroporasyon için embriyo ile temas halinde olduğu zaman hücresel hasar görmesini önlemek için, cam kapiller ucu temiz değil keskin, kırık kenarlar ihtiva kesmek gerekir. </li><li> Yapımı kılcal elektrot (anot) (Şekil 1) için: seçecek odaklanmak için 20 ya da 30 um çaplı bir sabit bir açıklık ile bir elektroporasyon cam boru içine 0.2 mm çapında platin tel takmakGeçerli ric ve embriyo ilgi küçük bir bölgeye plazmid DNA teslim. </li><li> Yapımı L-şeklinde elektrot (katot) (Şekil 1) için: &quot;L&quot; uzunluğu yaklaşık 1 mm yatay kısmı, bir &quot;L&quot; şekli oluşturan bir 0,2 mm çapında platin teli katlayın. </li><li> İnce yalıtımlı tel her platin elektrot takın ve yalıtım bandı ile kaplı bir mikroenjeksiyon iğne tutucu takın. </li><li> Standart mikromanipulasyon enstrüman sahipleri iğne tutucular monte edin. </li><li> Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, devre bağlayın: güç kaynağı anoduna kapiler elektrot bağlamak; multimetre anoda L biçimli elektrot bağlamak; Güç kaynağının katot mulimeter katot bağlayın. </li></ol> 6. Elektroporasyon E7.5 veya E8.5 Fare Embriyolar <ol><li> Üst 1-2 mm içinde PBS ile elektroporasyon cam kapiller doldurun ve STRAI eklemekcam boru içine GHT platin elektrot (anot) bu kılcal dibine ulaşana kadar. </li><li> PBS ile doldurulmuş bir 30 mm Petri kabı yüzeyine L-şekilli bir elektrodunu (katot) çapa. </li><li> PBS dolu elektroporasyon çanak içine M2 ortamdan embriyo transfer. </li><li> Embriyonun amniyon boşluğuna yanal epiblast iğne yerleştirin. Tamamen dolana kadar boşluğuna: Pnömatik piko pompası kullanılarak, DNA solüsyonu (GFP veya pCAG-GFP% 0,01, yeşil gıda boyası boya ile 1-1.5 mg / ml pCAG-Cre) enjekte edilir. E7.5-E8.5 embriyolar için, en az 5 ul DNA çözeltisi, bir embriyo için gereklidir. Bir göstergesi olarak, yeşil boya kullanarak, embriyo patlamaya dikkat edin. </li><li> Dikkatle elektrotlar arasındaki embriyo konumlandırmak ve DNA teslim edilecek olan kesin yerlerine kılcal elektrodu taşımak. Not: embriyo yönlenmesi DNA elektropore edilecek bölgeye bağlıdır. </li><li> ElectropoHer pals arasındaki 1 saniyelik bir aralık ile, 6 darbeleri 50 ms süre, her 200 volt (V) ile embriyo oranı. </li><li> Embriyo transferi, elektroporasyon hemen sonra kültür ortamı önceden dengelenmiş. İsterseniz, bir sonraki embriyo için işlemi tekrarlayın. Not: Steril bir kap içine kültür ortamı ekleyin ve orta ön dengelenmeye kültürü inkübatör koyun. </li><li> , Kültürden sonra electroporated hücreleri 2 saat tespit bir pastette kullanarak M2 ortamı temiz 30 mm Petri kabı embriyolar transfer etmek. Görüntü diseksiyon mikroskobu bir floresan bileşik kullanarak adım 5.9 olarak embriyolar. </li><li> Görüntüleme hemen sonra pastette kullanarak kültürüne geri embriyolar transfer. </li><li> Bir uzak-kırmızı hücre zan-geçirgen bir nükleer boya ile embriyolar leke, elektroporasyon ile neden olduğu ölü hücreleri saptamak için: elektroporasyon ile 10 dakika sonra 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de (1 embriyo kültür ortamı içinde 200) (isteğe bağlı) </li><li> Embry düzeltmek, electroporated hücreleri saymak için4 ° C&#39;de 2-4 saat süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) os, bir ultraviyole ya da uzak-kırmızı floresan nükleer counterstain ve görüntünün bir konfokal mikroskop (İsteğe bağlı) kullanarak embriyolar ile çekirdeği leke. Not: PBS içinde çok uzun süre bırakıldığında Embriyonik gelişme olumsuz yönde etkilenmektedir. Bu nedenle, her embriyo electroporate için harcanan zaman en aza indirecek (embriyo başına &lt;5 dakika) emin olun. </li></ol>

<ol>
	<li>O'Hagan, A. R., Morton, R., Eid, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+asthma+control+in+pediatric+patients+after+discontinuation+of+long-acting+Beta-agonists.">Loss of asthma control in pediatric patients after discontinuation of long-acting Beta-agonists.</a> Pulmonary med. , 894063 (2012).</li><li>Brons, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos.">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448, 191-195 (2007).</li><li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells.">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448, 196-199 (2007).</li><li>Huang, Y., Osorno, R., Tsakiridis, A., Wilson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+differentiation+potential+of+epiblast+stem+cells+revealed+by+chimeric+embryo+formation.">In Vivo differentiation potential of epiblast stem cells revealed by chimeric embryo formation.</a> Cell rep. 2, 1571-1578 (2012).</li><li>Sadik, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+relationship+and+optimization+of+double-pulse+electroporation.">Scaling relationship and optimization of double-pulse electroporation.</a> Biophys. J. 106, 801-812 (2014).</li><li>Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conceptual+and+technical+aspects+of+transfection+and+gene+delivery.">Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. , (2015).</li><li>Soares, M. L., Torres-Padilla, M. E., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein+4+signaling+regulates+development+of+the+anterior+visceral+endoderm+in+the+mouse+embryo.">Bone morphogenetic protein 4 signaling regulates development of the anterior visceral endoderm in the mouse embryo.</a> Dev. Growth Differ. 50, 615-621 (2008).</li><li>Pierreux, C. E., Poll, A. V., Jacquemin, P., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+prepancreatic+endoderm+by+whole+embryo+electroporation.">Gene transfer into mouse prepancreatic endoderm by whole embryo electroporation.</a> JOP. 6, 128-135 (2005).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev. Biol. 7, 107 (2007).</li><li>Davidson, B. P., Tsang, T. E., Khoo, P. L., Gad, J. M., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+cell+markers+into+germ+layer+tissues+of+the+mouse+gastrula+by+whole+embryo+electroporation.">Introduction of cell markers into germ layer tissues of the mouse gastrula by whole embryo electroporation.</a> Genesis. 35, 57-62 (2003).</li><li>Khoo, P. L., Franklin, V. J., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-Mapping+Technique:+Targeted+Whole-Embryo+Electroporation+of+DNA+Constructs+into+the+Germ+Layers+of+Mouse+Embryos+7-7.5+Days+Post-coitum.">Fate-Mapping Technique: Targeted Whole-Embryo Electroporation of DNA Constructs into the Germ Layers of Mouse Embryos 7-7.5 Days Post-coitum.</a> CSH protocols. 2007. , pdb.prot4893 (2007).</li><li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li><li>Nolkrantz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+single+cells+and+tissues+with+an+electrolyte-filled+capillary.">Electroporation of single cells and tissues with an electrolyte-filled capillary.</a> Anal. Chem. 73, 4469-4477 (2001).</li><li>Mazari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microdevice+to+locally+electroporate+embryos+with+high+efficiency+and+reduced+cell+damage.">A microdevice to locally electroporate embryos with high efficiency and reduced cell damage.</a> Development. 141, 2349-2359 (2014).</li><li>Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Postimplantation mammalian embryos : a practical approach. , (1990).</li><li>Tam, P. P., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+gastrulation:+the+formation+of+a+mammalian+body+plan.">Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan.</a> Mech. Dev. 68, 3-25 (1997).</li><li>Wilson, V., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+and+morphogenetic+movement+in+the+late+mouse+primitive+streak.">Cell fate and morphogenetic movement in the late mouse primitive streak.</a> Mech. Dev. 55, 79-89 (1996).</li><li>Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+progression+of+lineage+segregations+during+mammalian+embryogenesis+by+clonal+analysis.">Redefining the progression of lineage segregations during mammalian embryogenesis by clonal analysis.</a> Dev Cell. 17, 365-376 (2009).</li><li>Bellomo, D., Lander, A., Harragan, I., Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+in+mammalian+gastrulation:+the+ventral+node+and+notochord+are+relatively+quiescent.">Cell proliferation in mammalian gastrulation: the ventral node and notochord are relatively quiescent.</a> Dev. Dynam. 205, 471-485 (1996).</li><li>Tsakiridis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Wnt-driven+primitive+streak-like+populations+reflect+in+vivo+lineage+precursors.">Distinct Wnt-driven primitive streak-like populations reflect in vivo lineage precursors.</a> Development. 141, 1209-1221 (2014).</li><li>Gouti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+neuromesodermal+progenitors+reveals+distinct+roles+for+wnt+signalling+in+the+specification+of+spinal+cord+and+paraxial+mesoderm+identity.">In vitro generation of neuromesodermal progenitors reveals distinct roles for wnt signalling in the specification of spinal cord and paraxial mesoderm identity.</a> PLoS biology. 12, e1001937 (2014).</li><li>Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+second+neural+axis+by+the+mouse+node.">Induction of a second neural axis by the mouse node.</a> Development. 120, 613-620 (1994).</li></ol>

The authors have no conflicts of financial or other interest to declare.

Aşılama Hücre aşılama deneyleri için kritik bir adım küme parçalanmasına önlemek için, ideal olarak tek bir eylem hücrelerin tutarlı bir dize ekleme olduğunu. Bu teknik ağız pipet kontrol bazı pratik gerektirir. Donör hücreleri konak içinde de dahil ise, bunların türevleri, embriyodaki dağılacaktır. Daha dağılmış donör türetilen hücreleri konak içinde uygun bir şekilde ayırt olup olmadığını belirlemek için, imüno embriyo bölümleri üzerinde gerçekleştirilebilir. Donör hücreleri konak ortamı ile uyumlu değilse, onlar da tespit (onlar embriyo kovulan gibi) ya da kültürden sonra embriyolar adi öbekler şeklinde olamaz. Dağınık hücreler ve hücre kümeleri hem gözlendi, bu o çok hücre aşılandı gösterebilir ve çevresindeki konak hücreleri ile etkileşime olamaz aşırı donör hücreleri yığın oluşumuna neden olmuştur. Bu durumda, ek greft içerenhücrelerin daha küçük bir sayıda tekrar yapılabilir. Hücre aşılama tekniğinin en önemli sınırlaması uzun 48 saat elde edilmemiştir dönemler üzerinde fare ex vivo kültür beri hücrelerin tam in vivo potansiyelini belirlemek mümkün olmadığıdır. Ultrason eşliğinde hücre enjeksiyonu ile birlikte, ancak, bu uterus embriyo kültürlenmiş hücreleri transferi mümkün olabilir. Hücre aşılama deneyleri yaygın grubumuza kullanılmıştır ve bize çeşitli hücre tipleri 4,21,22 in vivo potansiyeli hakkında değerli ipuçları verdik, Özetlemek gerekirse. Erken İmplantasyon embriyoların in vitro kültürlenmiş hücrelerin in vivo potansiyelinin değerlendirilmesi için genel yarar için bir tekniktir. Elektroporasyon Bu çalışmada biz sadece göstermiştir rağmen ben, epiblast hedef kılcal elektroporasyon tekniği kullanmak etkili olduğunut kasıtlı örneğin endoderm hücreleri gibi diğer germ hedeflemek de mümkündür. Kılcal elektroporasyon tekniği için kritik bir adım PBS erken fare embriyoları için çok yetersiz kaldığı bu yana her embriyo (embriyo başına &lt;5 dakika) electroporate için harcanan zaman en aza indirmektir. Bizim verilerimiz Yukarıdaki embriyolar çoğu alanlarda, elektroporasyon embriyo gelişimini etkilemez göstermiştir. Ancak, düğüm elektroporasyon anormal gelişimi sebep ve embriyonun erken ölümüne yol açtı. Bu, önemli bir sinyal merkezleri 23 oluşturan hücrelerin hasarının ya da ölümünün muhtemeldir. Bu nedenle, bu bölge, bu teknik ile kaçınılması gerekir. Bir başka uyarı sonuçları bölümünde belirtildiği gibi epiblast veya ilkel çizgi hücreleri hedeflenen iken, bazı endoderm hücreleri de electroporated olmasıdır. DNA epiblast epitelin altında boşluklardan endoderm ulaşır, çünkü bu olabilir. Endoderm epitel hücrelerden oluşan ve inci bizim deneyim olduğunuese hücreler DNA&#39;yı almak için daha yüksek bir eğilime sahip. Kader haritalama için bu tekniği uygularken, bu nedenle, başlangıçta DNA&#39;yı aldığı hücrelerin değerlendirilmesi önemlidir. GFP plazmidler verimli çalışmaya gösterilen elektroporasyon parametreleri kullanılarak teslim edilebilir, diğer DNA konstruktları etkinliği değişebilir ve tek tek optimizasyon gerekebilir: Ayrıca pCAG-GFP ve pCAG-Cre, ancak not edilmelidir. Plazmidler transfekte etmek zor olduğu tespit edilmesi halinde, DNA konsantrasyonu, elektroporasyon gerilim veya vurum sayısı değişiklikler yapılabilir. Sınırlı hücre ölümü ile embriyo çok az hücre içine GFP plazmidler: Özetlemek gerekirse, bizim optimize kılcal elektroporasyon sistemi verimli ve tekrarlanabilir GFP veya Cre sunabilirsiniz. Bu yöntem pahalı ya da çok özel ekipman gerektirmez yana, hücre izleme çalışmaları için veya ektopik ifade veya koşullu silme o etkisini test büyük kullanım olabilirerken embriyolar f genler durumunda elektroporasyon floxed koşullu mutant alelleri taşıyan embriyolarda gerçekleştirilir. Bu nedenle, bu elektroporasyon tekniği lokalize yabani tip oluşum safhasındaki ortamları, bir hücre tarafından hücre bazında hücre iç faktörlerin rol anlamak için yararlı bir fonksiyonel bir araç sağlar.

Hücre kültürü yaygın gelişimsel biyoloji çalışmalarında kullanılmıştır. Fare Embriyonik kök hücreler (ESCs) ve epiblast kök hücreleri (EpiSCs), in vitro olarak her üç germ içine ayırt ve erken memeli embriyojenez hücre farklılaşması için faydalı bir model olarak olabilir. Bu hücre hatları türetilmesi in vitro manipülasyon ve erken embriyonik desenlendirme sırasında çalışan lokalize sinyal olaylar ve transkripsiyonel ağların ayrıntılı inceleme için bir fırsat açtı. Bununla birlikte, bu kültürde gerçekleştirilen herhangi bir manipülasyon in vivo belirlemek üzere önemli olmaya devam etmektedir. Preimplantasyon embriyo kaynaklı fare EKH in vivo potansiyel preimplantasyon embriyoları (morulları veya blastosist) 1 geri tanıtarak değerlendirilmiştir. Ancak, İmplantasyon embriyolar epiblast hücreleri temsil EpiSCs preimplantasyon embriyoları 2,3 verimli entegre olamaz. Bizim oncekiBize bulgular İmplantasyon embriyolar 4 içine aşılı zaman EpiSCs verimli kimeralar oluşturmak ve tüm germ katkıda bulunabileceğini göstermiştir. Bu nedenle, in vitro kültürlenmiş hücrelerin değerlendirilmesi için en iyi yol, in vivo olarak karşılık gelen temel alanlarına tanıtmaktır. Elektroporasyon, in vivo ve in vitro deneylerde, hem hedef hücrelere ekzojen molekülleri salıvermek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Elektrik enerjisi dışsal deoksiribonükleik asit (DNA) ya da hücrelere girmek için ribonükleik asit (RNA) sağlar hücre zarı, gözeneklerin sayıda oluşturabilir. Bu tekniğin en büyük zorluklardan biri yüksek electrotransfection verimlilik 5,6 ile optimum hücre canlılığını birleştirmektir. Embriyonik dokularda nükleik asitlerin elektroporasyon için, altın, geniş bir aralıkta mekansal 7-9 hücre hedefleme sağlayan, elektrotlar en sık kullanılmış olan kaplama. Daha loca elde etmek içinlized gen transferi, iğne şeklindeki elektrod fokal elektrik alanı 10,11 elde etmek için kullanılmıştır. Bu yöntemi kullanarak, yazarlar elektroporasyon sonra yaklaşık 30-60 hücre 11 DNA yapısının içine alınır gösterdi. Bununla birlikte, doğru elektroporate edilmiş hücrelerde sayısını ayarlayarak sabit genişlikli elektrot ile zor kalır gibi görünmektedir. Kılcal elektroporasyon tekniği tek hücre 12-14 kadar plazmidler teslim etmek için kullanılır olmuştur. Ancak, bu teknik ex vivo embriyolar için plasmidlerin electroporating uygulanan edilmemiştir. Daha yakın bir zamanda, erken mikrovasıta İmplantasyon Fare embriyolarında 15 lokal olarak electroporate birkaç uzak organ endoderm hücreleri (en az 4 hücreleri) olarak bildirilmiştir. Ancak bu cihaz verimli ektoderm hedef ve ex vivo mesodermi edip hala bilinmemektedir. Bu çalışmada, erken sonrası hücresel ve gen fonksiyonunu değerlendirmek için iki yeni yöntemleri tarif-implantation embriyolar. Biz ilk in vivo potansiyelini değerlendirmek için erken fare embriyoları tanımlanan sitelerine in vitro kültür hücreleri greft nasıl gösterilmektedir. Aşılı hücreleri ve onların soyundan entegrasyonu, tüm genetik etiketi (örneğin, yeşil floresan protein (GFP) etiketli, ayrıca doku spesifik proteinlerin immün tarafından muayene edilebilir 4. İkincisi, biz tam DNA teslim geliştirilmiş bir yöntem tarif Bunun yerine, bir iğne şekilli elektrot kullanarak daha elektroporasyon ile embriyo lokalize sitelere., bir ince uçlu bir cam boru içinde ince bir tel yerleştirilir ve bu değişiklik, yüksek verimlilik ve sınırlı sayıda hücre az sayıda DNA teslim edebilir göstermek hücre ölümü. Ayrıca, biz farklı açılış boyutları ile cam kapilerleri kullanarak, biz Electroporated hücrelerinin sayısını kontrol olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, o bu yöntem küçük sayılar içeren erken embriyonik desenlendirme incelemek için büyük bir kullanım olabilir inanıyorumf hücreler.

<table><tbody><tr><td>Forceps</td><td>Dumostar</td><td>T5390</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope system with fluorescence&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>AZ100</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope with a digital camera</td><td>Olympus</td><td>Olympus BX61</td><td></td></tr><tr><td>Inverted confocal microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica TCS SP8</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11397863</td><td></td></tr><tr><td>30mm Petri dishes&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>121V</td><td></td></tr><tr><td>4-well plates</td><td>Thermo scientific</td><td>179820&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>M2 medium&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010015&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes&amp;nbsp;</td><td>NICHIRYO</td><td>Nichipet</td><td></td></tr><tr><td>tips&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio One</td><td>685280</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator&amp;nbsp;</td><td>SANYO</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>Roller culture apparatus&amp;nbsp;</td><td>BTC Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters 0.45&amp;micro;m, sterile&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>non-essential amino acids (NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30549.01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Gas Cartridge for Portable Meker Burner</td><td>COLEMAN&amp;nbsp;</td><td>COLEMAN 250</td><td></td></tr><tr><td>Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>640798</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown micropipette puller&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microforge&amp;nbsp;</td><td>De Fonbrune</td><td>BS030301</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatic pico pump&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV830</td><td></td></tr><tr><td>Microloader tips&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 square wave pulse generator&amp;nbsp;</td><td>BTX</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Green food coloring dye</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C.I. 42053</td><td></td></tr><tr><td>A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye</td><td>Biotium</td><td>40060-T</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-Cre:GFP&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#13776&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#16664</td><td></td></tr><tr><td>Multimeter</td><td>Excel</td><td>XL830L</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulators&amp;nbsp;</td><td>Leitz&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2mm diameter platinum wire&amp;nbsp;</td><td>Agar Scientific</td><td>E404-2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Chicken IgY, HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2428</td><td></td></tr><tr><td>Liquid DAB+ Substrate Chromogen System&amp;nbsp;</td><td>Dako</td><td>K3467</td><td></td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>A far-red fluorescence nuclear counterstain</td><td>Life Technologies</td><td>T3605</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for precisely localized transfer of cells or dna into early postimplantation mouse embryos

Erken fare embriyo manipülasyonu ve kültür güçlü henüz büyük ölçüde altında kullanılan bu model sistemin değerini artıran teknoloji bir olduğunu. Bunun aksine, hücre kültürü yaygın gelişim biyolojisi çalışmalarında kullanılmıştır. Bununla birlikte, in vitro kültürlenmiş hücrelerin gerçekten in vivo hücre tiplerinde temsil olup olmadığını belirlemek için çok önemlidir. Gelişimi sırasında katkıları değerlendirilmesi ardından embriyolar içine hücreleri, aşılama in vitro kültür hücreleri potansiyelini belirlemek için yararlı bir yöntemdir. Bu çalışmada, ex vivo kültür ardından erken implantasyon sonrası fare embriyosu, tanımlanmış bir siteye hücreleri aşılama için bir yöntem tarif eder. Ayrıca, yüksek transfeksiyon verimlerine ve düşük hücre ölümü hem eksojen DNA&#39;nın alınması hücrelerin sayısının hassas bir lokalizasyonu ve ayarlama sağlar bilinen bir çapa cam kılcal kullanan optimize edilmiş bir elektroporasyon yöntemi sunuyoruz. Herhangi bir sp gerekmez Bu teknikler,ecialized ekipman, gastrulasyon ve erken organogenezisin aşamalı fare embriyo mümkün deneysel manipülasyonlar, kültürlü hücre alt bağlılık ve hücre farklılaşmasında yerinde genetik manipülasyonlar etkisi sağlayan analizini vermekteyiz.

Aşılama Her yerde bulunan bir EGFP (mESCs in vitro türetilebilir E6.5 epiblast türetilen R04-GFP, ve C2), 4 ifade EpiSCs elle kültür kabı kazınır ve E7.5 embriyolar, farklı bölgelerde (Şekil 2A) aşılanmıştır. Embriyolar ex vivo kültive ve 24 saat sonra analiz edilmiştir. Donör hücrelerin dağılımı floresan mikroskobu ile değerlendirildi. Donör hücreleri dahil, bunlar çoğalmıştır ve bunların türevleri ana embriyoların (Şekil 2B) içinde dağıtılmış. Bu ana embriyoların (Şekil 2A, 2B ve) &#39;de etkili bir şekilde dahil 10-16 hücreleri ihtiva eden greftler, ancak, daha fazla hücre aşılama daha chimaerism neden olmadığı gözlenmiştir. Bunun yerine, aşılanmış hücreler adi kümeleri (Şekil 2C ve 2D) üretildi. Elektroporasyon Bir içinembriyo belirli sitelere: ssess bizim elektroporasyon sisteminin verimliliği, biz GFP ifade plazmidler (GFP pCAG-GFP ve pCAG-Cre) teslim etti. Bir önceki çalışmada 11 ile uyumlu olarak, GFP + hücreler embriyolar elektroporasyon (Şekil 2E ve 2G) sonra 1-2 saat tespit edildi. Geç ilkel çizgi sahne embriyo distal epiblast hücrelerinin elektropore edildiğinde, etiketli hücreler kültürde 24 saat (Şekil 2E ve 2F) sonra nöral ektoderm katkıda bulunmuştur. Bu sonuç gastrulasyon sahne embriyoların 17 epiblast hücrelerinin bilinen kaderi haritalarına iyi gelir. GFP ekspresyon plazmidi E8.5 (2-5 Somitlerin) ilkel çizgi elektroporasyona Benzer bir şekilde, GFP + hücreler geç Başlangıç ​​çizgisinin 18 bilinen kaderi haritaları ile tutarlıdır paraksiyel mezoderm (Şekil 2G ve 2H), katkıda . Ayrıca, biz, Electroporated hücrelerden her üç germ (Şekil 2I-K) katkı gözlendielektroporasyon prosedürü, in vivo olarak, hücre davranışını ödün vermeyen düşündürmektedir. Ancak, biz de epiblast (E7.5) ya da ilkel çizgi hücreler (E8.5) hedeflenmiş iken, bazı endoderm hücreleri aynı zamanda (Şekil 3C ve Tablo 1) elektroporate fark ettim. Bir kılcal elektrodu kullanılmasının önemli avantajlarından biri, elektroporate edilmiş hücrelerde sayısı sadece kendi açıklığın çapı değiştirilerek kontrol edilebilir olmasıdır. Elektroporasyona hücrelerin sayısını belirlemek için, embriyolar elektroporasyon sonra 2 saat sabit ve konfokal mikroskop wholemount olarak görüntülenmiştir. GFP + hücrelerinin sayısı el konfokal Z yığınlarının sayılmıştır. Tablo 1, bu daha fazla hücre DNA alımında 20 mikron ile 30 sonuçlardan cam kapiller açılış boyutunu artırarak belirli bir aşamaya, için. Tek bir açıklık boyutu (E8.5 karşı E7.5) aşamaları arasında karşılaştırıldığında, daha fazla hücre ikinci aşamada elektropore olduğu bulundu. Bu etki, E8.5 amniyotik boşluğunda bulunan DNA, daha yüksek bir konsantrasyona kadar bağlı olabilir. DNA solüsyonu yeşil gıda boyası ile karıştırılmış Çünkü, biz amniyotik boşluk DNA konsantrasyonu değerlendirmek için yeşil renk kullanabilirsiniz. Mikroskop, bu E8.5 embriyolar ile karşılaştırıldığında DNA enjeksiyonundan sonra yeşil renk E7.5 embriyoların boşluğu içinde daha hafif olduğunu, olduğu açıktır. DNA çözeltisi içinde aynı konsantrasyondaki E7.5 ve E8.5 embriyoların içine enjekte edildi, ancak daha fazla DNA çözüm, daha büyük boyutta olduğundan tamamen doldurmak için E8.5 embriyoların amniyotik boşluk içinde oldu. Enjeksiyon iğnesi geri çekilmesi sonrasında, her zaman amniyotik boşluk DNA çözeltisinin kaçak bir derece vardır ve delinme deliği önceki embriyolarda amniyotik kavite büyüklüğüne oranla daha büyük olduğundan, oransal olarak daha sızıntı olduğunu muhtemeldir daha düşük bir DNA konsantrasyonunun neden E8.5 embriyolar daha E7.5 gelen. Transfekte farklı sayıdaHücreler, farklı aşamalarda farklı hücre çap veya indüklenen transmembran voltajı (ITV) eşik nedeniyle olabilir. Elektroporasyon bir dezavantajı, ilişkili hücre ölümüdür. Geleneksel altın benzer kaplama ya da iğne şekilli elektrotlar, bir kılcal elektrodu kullanılarak elektroporasyon hücre ölümüne neden olur. Elektroporasyondan sonra, hedeflenen bölgenin hücre ölümünün bir miktar, bu alanda oluşmuştur gerektiğini belirten, komşu bölgelerde (Şekil 3A ve 3B) ile karşılaştırıldığında daha koyu renkte ortaya çıktı. Daha da elektroporasyon prosedürü neden ölü hücrelerin sayısını belirlemek için, embriyolar bir flüoresan hücre zan-geçirgen bir nükleer boya ile boyanmıştır. Ölü hücrelerin çekirdekleri, bir zara-geçirmeyen uzak-kırmızı bir floresan boya ile etiketlenmiştir. Boyama Bu kılcal elektroporasyon tekniği sadece elektroporasyon alanının yakınında ölü hücreleri (Şekil 3D ve Ta az sayıda sonuçlanır doğruladıble 1). Biz ölü hücreler elektroporasyon yerinde görünmesine rağmen, GFP + hücreler ve ölü hücreler de birbirlerine (Şekil 3E ve 3F&#39;de) en seçkin olduğunu fark ettim. E8.5 kaudal yanal epiblast pCAG-GFP ve 20 um&#39;den bir cam kılcal açıklık, GFP + hücreleri çok sayıda elektroporasyona Dahası, kültür içinde 48 saat (Şekil 3G ve 3H) sonra tespit edildi. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar en GFP + hücreler daha kültür sırasında hala canlı olan elektroporasyon sonra 2 saat tespit öneririz. Biz 24 saat ex vivo kültürden sonra GFP + hücre sayısını attı. Altı embriyolar 20 um çaplı bir kapiler açıklığı kullanılarak, E7.5 de pCAG-GFP ile elektropore edildi. GFP + hücreler / embriyo tespit edildi 107 ± 31 (sd ortalama ±). Kültür (2 saat) başlangıcında bu yana, 9 hücreleri başına ortalama embriyo üzerinde elktroporatlandı ( <s<html> trong&gt; Tablo 1), bu hücreler, 2 saat elektroporasyona olan 3-4 bölümleri geçirmediğini ortaya koymaktadır. E8.5 embriyoların E7.5 saati iki katına ortalama hücre dışında ventral düğümde 19,20 olanlardan tüm hücrelerde 6-7 saattir. Bu elektroporasyon prosedürü normal hücre büyümesini engel olmadığını göstermektedir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig1.jpg" /> Elektroporasyon kurulumu gösteren Şekil 1. Devre şeması. Onun amniyotik boşluk içinde embriyo içeren DNA solüsyonu iki elektrot arasına yerleştirildi. Seçilen parametreler Cari bir kare dalga darbe jeneratörü (güç kaynağı) tarafından sağlandı. Bir multimetre embriyo geçen elektrik akımı algılamak için seri olarak bağlanmıştır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53295/53295fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Her zaman &quot;&gt;:&quot; keep-together.within-sayfa = fo &quot;jove_content <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53295/53295fig2.jpg" /> Şekil 2. konak embriyolar aşılı veya Electroporated hücrelerin dağılımı. Wholemount embriyoların (gri tonlama) (A) aydınlık görüntüleri (AH) GFP floresan bindirmeleri (yeşil) 10-16 GFP + EpiSCs geç distal bölgeye aşılanmış -streak aşamasındaki embriyo. (C), GFP + EpiSCs daha büyük bir tutam bir orta çizgi evresindeki embriyonun uzak bölgesi içine aşılanmıştır. (B ve D) &#39;de gösterilen bir ev sahibi embriyolar EpiSCs türetilmiş hücreler (yeşil) dağılımını ( A ve kültür 24 saat sonra C). donör hücrelerinin doğru entegrasyon öne konak embriyo içinde dağılmış (B) GFP + hücreleri. (D) Aşılama daha büyük hücre kümeleri ev sahibi embriyo adi topak oluşumu ile sonuçlandı. (EK) pCAG-Cre: GFP plazmid ele<html> Yabanitip embriyoların belirli alanlara ctroporated. Bir erken tomurcuk aşamalı bir embriyoya (E) ya da hücre gruplarının 2-5 aşamalı bir embriyoya (G) Başlangıç ​​çizgisinin uzak bölge electroporating 2 saat işlemden sonra, bu bölgelerde GFP + hücreleri sonuçlandı. (F ve H) kültür içinde 24 saat sonra ana embriyoların GFP + hücrelerinin dağılımı, Elektroporasyona tabi tutulan hücreler nöroektoderm (siyah ok) katkıda bulunduğunu gösteren (F) ve paraksiyel mezoderm (beyaz ok) (lH). (TK) Elektroporasyona tabi tutulan hücreler nöroektoderm (I) ortaya çıkmasına neden olabilir gösteren GFP + hücreleri için DAB imüno mezoderm (J) ve kültür 24 saat sonra endoderm (J ve K). Ölçek çubuğu (AH) = 250 mikron; Ölçek çubuğu (IK), 100 mikron =. Not: Şekil 1A ve 1B önceki yayının 4 yeniden basıldı edilir.= &quot;https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53295/53295fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot; href&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53295/53295fig3.jpg" /> GFP + hücreleri ve elektroporasyon sonra embriyolar ölü hücrelerin Şekil 3. Dağılımı (AC) pCAG-Cre. GFP plazmidi, bir E8.5 kaudal yan epiblast hücrelerine elektroporasyon (2-5 hücre gruplarının aşama) embriyo (kapiler açıklık büyüklüğü :. 20 mikron) (A) 2 saat işleminden sonra, hedeflenen bölge embriyonun diğer bölgelerine kıyasla koyu renk (beyaz ok) gösterdi. Ankastre Elektroporasyona bölgenin büyütülmüş bir halini göstermektedir. (B) aydınlık görüntü (gri tonlama) içinde elektroporasyona tabi hücreler (yeşil) gösteren yeşil flüoresan kanalı ile kaplanmış. (C) konfokal z dilimli gösterenKuyruk yanal epiblast hücreleri hedef alındı, iki endoderm hücreleri (yeşil) da plazmid aldı. . Hücre çekirdekleri (DF) pCAG-Cre kırmızı ile gösterilmiştir: GFP plazmidi, bir E8.5 embriyo düğümün kaudal elektroporasyona (kapiler açıklık büyüklüğü: 30 um). Embriyo 2 saat kültürlendi. Elektroporasyona tabi tutulan hücreler, kırmızı ve yeşil ölü hücreleri gösterilmektedir. (D) içinde elektroporasyona tabi alanı GFP + hücrelerin yanı sıra ölü hücreleri hem de içerir. Beyaz kutu bölge ayrıca bir konfokal mikroskop analiz edilmiştir. Z-yığınının Manuel sayma 33 GFP + hücreler ve bu alanda 23 ölü hücreler olduğunu göstermiştir. Sadece iki hücre her iki fluorophores için olumlu hem de vardı. (E ve F) GFP + hücreler ölü hücreleri ayrıdır gösteren D beyaz kutulu bölgeden bir konfokal z-dilim XYZ görünümü. Çekirdekleri mavi gösterilmiştir (G ve H) pCAG-Cre. GFP plazmidi, bir kaç hücre içine elektropore edildiBir E8.5 embriyo kaudal yanal epiblast LS (kapiler açıklık büyüklüğü: 20 um) ve iki (G) ve 48 (H) saat ex vivo kültür Not sonra görüntülü: (H) embriyo kültürü sonra, iki kesildi. Baş ve kalp bölgeleri çıkarıldı. Ölçü bar (A, B, D, G ve H) = 250 um; Ölçek çubuğu (C, E ve F) = 100 mikron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53295/53295fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Kılcal tüpün açıklığının çapı </td><td> Embriyo evresi </td><td> Elektroporasyon verimliliği: hayır. 2h / toplam sonra GFP + hücreleri içeren embriyolar. ve electroporated embriyolar (no. 24 veya 48 saat kültürden sonra normal gelişti + embriyolar GFP) </td><td> Sd ± embriyo başına GFP ortalama sayısı + hücreler (n = no. Incelenen embriyoların) </td><td> No.Sd ± her embriyo başına GFP + endodermal hücreleri (n = no. Incelenen embriyoların) </td></tr><tr><td> 20 um </td><td> E7.5 (LS-LB) </td><td> 7/9 (7) </td><td> 9 ± 3 (n = 4) </td><td> 4 ± 2 (n = 4) </td></tr><tr><td> 30 um </td><td> E7.5 (LS-LB) </td><td> / 15 (12) 13 </td><td> 17 ± 2 (n = 4) </td><td> 6 ± 1 (n = 4) </td></tr><tr><td> 20 um </td><td> E8.5 (2-5 Somitlerin) </td><td> / 13 (10) 12 </td><td> 21 ± 4 (n = 4) </td><td> 11 ± 4 (n = 4) </td></tr><tr><td> 30 um </td><td> E8.5 (2-5 Somitlerin) </td><td> 02/02 (2) </td><td> 33 ve 26 (n = 2) </td><td> 14 ve 16 (n = 2) </td></tr></tbody></table> PCAG-Cre Tablo 1. Elektroporasyon verimliliği: fare embriyoları GFP plazmid. Kısaltma: LS geç ilkel çizgi sahne; LB: Geç tomurcuk sahne. Embriyolar göre sahnelenirÇıkışlar ve Davies 12

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos at JoVE.com

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Erken Postimplantation Fare Embriyolar içine Hücreleri veya DNA Kesinlikle lokalize Transferi Yöntemleri

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

methods-for-precisely-localized-transfer-cells-or-dna-into-early

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.4K Görüntüleme.  School of Biological Sciences, University of Edinburgh. We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Video: Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Fare Oosit içine Nükleer Transfer

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Biyoloji

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Gelişim Biyolojisi

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Nörobilim

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporasyon

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Yüksek Verimli Üretimi için Dondurulmuş Çözülmüş Embriyoların Kullanımı

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Genetik

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.

Fotostatinler Kullanılarak Canlı Preimplantasyon Fare Embriyosundaki Mikrotübül Sitoiskeletinin Spatiotemporal Subcellular Manipülasyonu

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the host chromosome and is passed on to progeny. Thus, they are ideal vectors for creation of stable cell lines, in vivo delivery of indicators, and transduction of single cell fertilized eggs to create transgenic animals. However, mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against lentiviral gene delivery. Lentiviruses are too large to penetrate the zona and are typically delivered by microinjection of viral particles into the perivitelline cavity, the space between the zona and the embryonic cells. The requirement for highly skilled technologists and specialized equipment has minimized the use of lentiviruses for gene delivery to mouse embryos. This article describes a protocol for permeabilizing the mouse fertilized eggs by perforating the zona with a laser. Laser-perforation does not result in any damage to embryos and allows lentiviruses to gain access to embryonic cells for gene delivery. Transduced embryos can develop into blastocyst in vitro, and if implanted in pseudopregnant mice, develop into transgenic pups. The laser used in this protocol is effective and easy to use. Genes delivered by lentiviruses stably incorporate into mouse embryonic cells and are germline transmittable. This is an alternative method for creation of transgenic mice that requires no micromanipulation and microinjection of fertilized eggs.

Mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against gene delivery. This article describes a protocol for perforating the zona with a laser to transduce embryonic cells with lentiviral vectors and to create transgenic mice.

Fare Lentiviral Gene lazer destekli teslim yumurta döllenmiş

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...