Name: geomagnetic field (gmf) and plant evolution: investigating the effects of gmf reversal on arabidopsis thaliana development and gene expression
Uploaded: 2015-11-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression at JoVE.com

This work was supported by a grant to MEM from the Dept. of Life Sciences and Systems Biology of the University of Turin, Italy. The authors thank G. Gnavi for technical assistance during some experiments. CTR is funded by the Wellcome Trust and the Royal Society (Grant Number 098436/Z/12/Z).

Üç Eksenli Rulo 1. Ayar NOT: Şekil 1 GMF ters kullanılan üç eksenli bobinler gösterir. <ol><li> Kimin sonda üç eksenli bobinler eklenir üç eksenli manyetometre, açın. </li><li> Veri üç eksenli magnetometer toplanan sağlar magnetometre yazılım bilgisayarınızı açın ve başlatın. </li><li> GMF büyüklüğünü hesaplamak için manyetometresi tarafından bildirilen bileşen değerleri kullanın. Manyetometre değerleri ile Mesela,: Bx = 6,39 μT, tarafından = 36,08 μT, Bz = 20,40 μT aşağıdaki eşitlik kullanılarak 41,94 μT bir alan gücünü hesaplar: A, B = B GMF + B ek burada B, ek = (Bx 2 + 2 + Bz 2) tarafından ½ (yani, örneğin 41.9 μT). </li><li> Üç DC güç kaynakları (dual aralığı: 0-8V / 5A ve 0-20V / 2.5A, 50W) çevirin üç coupl bağlı her biriHelmholtz bobinleri es ve bir GPIB bağlantısı (Şekil 1B) üzerinden bir bilgisayara bağlı. </li><li> Güç kaynakları kümesi gerilimler ters bir manyetik alan vektörü ile istenen manyetik alan üretir. Yeni bir bileşke B üretmek amacıyla, örneğin, adım 1.3 ve burada açıklanan enstrümantasyon bobin boyutu ile gibi B GMF ile V. voltaj set x = 0,00 V, V y = 30.52 V, V z = 0.00 V = B + B GMF üç eksenli bobinleri = (6.38, -36,08, 20.39) μT. yani aynı B GMF olarak büyüklüğü, ancak farklı bir yöne işaret ile yeni bir alan. </li><li> 1.3 anlatılan prosedürü kullanarak magnetometre yazılımı ile yeni bir alan doğrulayın. </li><li> Hem normal bitkileri Açığa ve bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi Petri plakaları kullanılarak GMF koşulları ters. </li><li> Eşit alanın büyüklüğünü tutarak sahte maruziyet deneyler | B GMF | ve tutmaGMF o ama eşit alanın düşey bileşeni alanı ters durumuna göre üç eksenli bobinler eşit akımlarla alan yatay bileşeni yönünü (yani, &quot;Kuzey, Doğu ya da Batı&quot;) değiştirilmesi. 1.5 açıklandığı gibi bobinlerin gerilim değiştirerek bunu yapın. Not: Bu sahte poz potansiyel ince ısıtma veya iki bobinler titreşim etkilerini kendileri veya bobinleri kontrol etmek için kullanılan elektronik dışarı yönetir. </li><li> Veri deneyler kalanını gerçekleştirmek ve / veya sözlü personelinden kör alan koşulları uygulayarak çift kör deneyler çalıştırın. </li></ol> Bitki Materyalleri ve Bitki Büyüme Şartlar 2. Hazırlık <ol><li> Arabidopsis thaliana&#39;nın tohumları kullanarak, ekotip Columbia 0 (Col 0), bir 1.5 ml tüp içine daha sonra yer ve yüzey, bir% 5 ile işlenerek sterilize edin (ağırlık / hacim), kalsiyum hipoklorit çözeltisi ve% 0.02 (hac / hac) Triton X-Sürekli çalkalanarak 25-28 ° C&#39;de 10-12 dakika boyunca% 80 etanol (EtOH), 100. Daha sonra% 100 EtOH ile yıkayın,% 80 EtOH ile iki kez yıkayın ve son olarak da steril damıtılmış su ile yıkayın. </li><li> Ekleyerek orta modifiye Murashige ve Skoog 22 (MS) 1 L hazırlayın: MS 2,297 g (0.5 x MS temel tuz karışımı), 10 g sükroz, 1 L, KOH ile ayarlanmış pH 5.8-6.0 kadar deiyonize su kadar. 20 dakikada, 120 ° C, agar ve otoklav 16 g ekleyin. </li><li> Katılaşma önce, her (120 x 120 mm 2) kare Petri kapları içine orta 80 ml ​​dökün. Mumsu film ile plakaları mühür sonra plaka üzerinde otuz steril tohumlarını ekmeye ve. </li><li> Hızlandırabilir ve çimlenme senkronize ve sonra ya normal Petri plakaları maruz veya GMF ters 2 gün boyunca 4 ° C&#39;de karanlıkta yatay plakaları Vernalize. </li><li> Üç eksenli bobin içinde ve üç eksenli bobin dışındaki paralel deneylerde dikey konumda 22 ° C&#39;da bir iklim kontrollü bir ortamda tohumları açığaSodyum buharlı lambalar kullanılarak 8 saat karanlık ve 16 saat ışık fotoperiyod takvimi altında (220 x 10 -6 E m -2 s -1). Lambaların kırmızı bileşeni azaltmak için spot için mavi jelatin filmi kullanın. </li><li> Normal (kontrol) hem RNA ekstraksiyon ve ters (tedavi) GMF koşulları önce 10 gün süreyle bitki Açığa. </li><li> Maruz kaldıktan sonra, Petri fotoğraflarını çekmek. </li><li> Kök uzunluğu ve yaprak alanlarını hesaplamak için ImageJ yazılımı kullanın. <ol><li> Kısaca, daha sonra Petri plaka ve tam plaka yan haçlar bir çizgi çizmek için &quot;düz&quot; çizgi seçeneğini kullanarak görüntüyü açmak, Petri plakasının tarafını ölçmek. </li><li> &quot;Analiz&quot; menüsünde &quot;set ölçek&quot; seçin ve &quot;bilinen mesafe&quot; kutusuna (örneğin, 120 mm), daha sonra uzunluğu (mm) birimini takın gerçek mesafeyi eklemek; nihayet tüm ölçümler için ayarları yapmak &quot;küresel&quot; seçeneğini tıklayın. </li><li> Roo içint uzunluğu, serbest aracını kullanarak dikkatlice kök şeklini izleyin. &quot;Analiz&quot; menüsünden &quot;ölçü&quot; seçeneğini kullanarak uzunluğunu ölçün. Resimde tüm kökleri ölçmek ve ileri istatistiksel analizler için dosyayı kaydetmek için devam edin. </li><li> Yaprak alanı için, &quot;image&quot; menüsünden seçeneğini ve ardından &quot;renkli eşiği&quot; ayarlamak kullanın. Tek yaprak seçin ve &quot;analiz&quot; menüsünden &quot;parçacıklar analiz&quot; i seçin. Istatistiksel analizler için bireysel ölçümler kaydedin. </li></ol></li></ol> 3. Arabidopsis Toplam RNA Ekstraksiyon, Kantitatif Real Time PCR (qPCR) Reaksiyon Koşulları ve Arabidopsis için astarlar <ol><li> Ayrı ayrı 30 sürgünler ve 30 kökleri toplayın ve hemen sıvı nitrojen içinde dondurarak. Daha sonra havanda sıvı azot içinde öğütün. </li><li> Üretici kullanarak bir saflaştırma seti ve RNase-barındırmayan DNase işleme kiti kullanılarak toplam RNA izole edilirer talimatları. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir RNA nano kiti ve kapiler jel elektroforezi kullanarak örnek kalitesini ve miktarını kontrol edin. Spektrofotometrik RNA ölçümü onaylayın. </li><li> Toplam RNA, üreticinin tavsiyelerine uygun olarak, birinci kol cDNA&#39;ları elde etmek için bir cDNA Ters Transkripsiyon Kit kullanılarak rastgele primerler 2 ug kullanın. </li><li> Bir iç yükleme standart olarak ROX ile SYBR yeşil I ile bir Real-Time Sisteminde tüm deneyler. </li><li> 2x SYBR Green qPCR Master Mix 12,5 ul cDNA 0,5 ul ve 100 nM primer oluşan karışımın 25 ul reaksiyon gerçekleştirin. Tablo 1&#39;de listelenen primerleri kullanarak. Kontrollerde (genomik DNA kontaminasyonu izlemek için ters transkripsiyon total RNA kullanılarak) non-RT kontrol ve şablon olmayan kontroller (yerine su şablonu) ekleyin. </li><li> Standart kullanan tüm primerler çifti astar verimi olarak hesaplanıreğri yöntemi 23. </li><li> CRU3, COTP1, RRTF1: Aşağıdaki PCR koşulları kullanarak. 95 ° C de 10 dakika, 95 ° C, 58 ° C &#39;de 30 saniye ve 72 ° C&#39;de 30 saniyede 15 saniye 40 döngü, UBP6, eEF1Balpha2, ACT1, GAPC2, CAT3 TAPX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 en az 95 ° C &#39;de, 95 ° C, 57 ° C&#39; de 20 saniye ve 72 ° C&#39;de 30 saniyede 15 saniye 40 döngü. </li><li> Her tavlama ve uzatma fazında aşağıdaki floresan okuyunuz. Tüm koşular için, termal profilinde ayrışma segmenti dahil ederek 55 ° C 95 bir erime eğrisi analizi gerçekleştirmek. Ayrışma profili (sıcaklığın bir fonksiyonu olarak floresan arsa) görmek için sonuç sekmesi aracılığıyla erişilen ayrışma eğrisi ekranını kullanın. Deney ayrışma kesimi sırasında toplanan veri kümesi Analiz / Kurulum ekranını kullanarak analiz için seçili olduğundan emin olun. </li><li> L belirleyinÜç kez tekrarlanmış, teknik 24,25 analiz üç bağımsız RNA ekstraksiyonlardan cDNA kullanılarak on kat inceltilmiş serileri (1-kat 3 ile 10 arasında) gerçekleştirerek eşik döngüsü değeri (Ct değeri) şablon konsantrasyonunun linear aralığı. </li><li> Ct değerlerini elde etmek için Real-Time PCR cihazı yazılımı ile tüm amplifikasyon araziler analiz edin. Kalibre ve aşağıdaki gibi en iyi temizlik genlerin düzeyi ile göreli RNA düzeylerini normalleştirmek: 3.11.1) Sonuçları sekmesinden Arsalar ekranında Amplifikasyon yapın, veri analizi Seçimi / Kurulum ekranını kullanarak analiz edilmelidir hangi rampa veya plato seçin ve sonra komut panelinde Floresan menüden DRN (taban düzeltilmiş normalize floresan) seçin. Örneklenmiş kuyuları için Ct değerleri görüntülemek için Sonuçlar sekmesinden örnek Değerleri ekranı Plate erişin. </li><li> Dört farklı referans genleri için [örneğin, sitoplazmik gliseraldehid-3-fosfat dehidrojenaz, (GAPC2), ubikitin specific proteaz 6 (UBP6), Actin1 (ACT1) ve uzama faktörü 1B alfa-alt birimi 2 (eEF1Balpha2)] gerçek zamanlı PCR sonuçları normalleştirmek için. Bir analiz yazılımı 26 kullanılarak gen sırada üst seçiniz; ve normalleşmesi için en stabil gen kullanın. <ol><li> Kısaca, örnek adlarını içeren gen isimleri ve ilk satırı içeren birinci sütun ile bir Excel sayfasında girdi verileri düzenlemek. Sonra menü çubuğundan analiz yazılımı seçin. Giriş verileri seçmek için iletişim kutusunu kullanın. </li><li> Sonra, alanları örnek isimler, gen adlarını ve basit çıktı sadece kontrol ediniz. Analizi gerçekleştirmek için Git düğmesine tıklayın. En stabil dile aday gen olarak (küçük stabilite değerine sahip olan) üst sıradaki geni seçin. </li></ol></li><li> Sürgünler ve kökler hem de farklı kat değişimi ifadesini göstererek arsa verileri. </li></ol> 4. Statistik analizler <ol><li> Standart hata ± ortalama değerler olarak verileri ifade eder. Co karşılaştırınntrol ve varyans (ANOVA) ve Bonferroni ve Dunn-Sidak Düzeltilmiş Olasılık testi (% 0.95 güven) ile Tukey testi analizi yaparak tedavi grupları. </li></ol>

<ol>
	<li>Maffei, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+field+effects+on+plant+growth,+development,+and+evolution.">Magnetic field effects on plant growth, development, and evolution.</a> Front. Plant Sci. 5, (2014).</li><li>Occhipinti, A., De Santis, A., Maffei, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetoreception:+an+unavoidable+step+for+plant+evolution.">Magnetoreception: an unavoidable step for plant evolution.</a> Trends Plant Sci. 19 (1), 1-4 (2014).</li><li>Harris, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+magnetic+fields+on+cryptochrome-dependent+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Effect of magnetic fields on cryptochrome-dependent responses in Arabidopsis thaliana.</a> J. Royal Soc. Interf. 6 (41), 1193-1205 (2009).</li><li>Phirke, P. S., Kubde, A. B., Umbarkar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+magnetic+field+on+plant+growth.">The influence of magnetic field on plant growth.</a> Seed Sci. Technol. 24 (2), 375-392 (1996).</li><li>Abe, K., Fujii, N., Mogi, I., Motokawa, M., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+high+magnetic+field+on+plant.">Effect of a high magnetic field on plant.</a> Biol. Sci. Space. 11, 240-247 (1997).</li><li>Volpe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+zero-frequency+and+oscillating+magnetic+fields+with+biostructures+and+biosystems.">Interactions of zero-frequency and oscillating magnetic fields with biostructures and biosystems.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2 (6), 637-648 (2003).</li><li>Belyavskaya, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+effects+due+to+weak+magnetic+field+on+plants.">Biological effects due to weak magnetic field on plants.</a> Adv. Space. Res. 34 (7), 1566-1574 (2004).</li><li>Weber Bittl, R., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+radical+pairs+studied+by+time-resolved+EPR.">Transient radical pairs studied by time-resolved EPR.</a> Biochim. Biophys. Acta- Bioenerg. 1707 (1), 117-126 (2005).</li><li>Pazur Galland, P., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetoreception+in+plants.">Magnetoreception in plants.</a> J. Plant Res. 118 (6), 371-389 (2005).</li><li>Minorsky, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+geomagnetic+variations+affect+plant+function.">Do geomagnetic variations affect plant function.</a> J. Atm. Solar-Terrestr. Phys. 69 (14), 1770-1774 (2007).</li><li>Burda Vanderstraeten, J., H, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+magnetoreception+mediate+biological+effects+of+power-frequency+magnetic+fields.">Does magnetoreception mediate biological effects of power-frequency magnetic fields.</a> Sci. Tot. Environ. 417, 299-304 (2012).</li><li>Job, C., Rajjou, L., Lovigny, Y., Belghazi, M., Job, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+protein+oxidation+in+Arabidopsis+seeds+and+during+germination.">Patterns of protein oxidation in Arabidopsis seeds and during germination.</a> Plant Physiol. 138 (2), 790-802 (2005).</li><li>Wan, L. L., Ross, A. R. S., Yang, J. Y., Hegedus, D. D., Kermode, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+the+12+S+globulin+cruciferin+in+wild-type+and+abi1-1+mutant+Arabidopsis+thaliana+(thalecress)+seeds..">Phosphorylation of the 12 S globulin cruciferin in wild-type and abi1-1 mutant Arabidopsis thaliana (thalecress) seeds..</a> Biochem J. 404, 247-256 (2007).</li><li>Sancenon, V., Puig, S., Mira, H., Thiele, D. J., Penarrubia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+copper+transporter+family+in+Arabidopsis+thaliana.">Identification of a copper transporter family in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Mol. Biol. 51 (4), 577-587 (2003).</li><li>Foyer, C. H., Karpinska, B., Krupinska, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+Whirly1+and+Redox-Responsive+Transcription+Factor+1+in+cross+tolerance+responses+in+plants:+A+hypothesis.">The functions of Whirly1 and Redox-Responsive Transcription Factor 1 in cross tolerance responses in plants: A hypothesis.</a> Philos.Trans.Royal Soc.B-Biol.Sci. 369 (1640), 20130226 (2014).</li><li>Myouga, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heterocomplex+of+iron+superoxide+dismutases+defends+chloroplast+nucleoids+against+oxidative+stress+and+is+essential+for+chloroplast+development+in+Arabidopsis.">A heterocomplex of iron superoxide dismutases defends chloroplast nucleoids against oxidative stress and is essential for chloroplast development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20 (11), 3148-3162 (2008).</li><li>Mhamdi, A., Queval, G., Chaouch, S., Vanderauwera, S., Van Breusegem, F., Noctor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalase+function+in+plants:+a+focus+on+Arabidopsis+mutants+as+stress-mimic+models.">Catalase function in plants: a focus on Arabidopsis mutants as stress-mimic models.</a> J. Exper. Bot. 61 (15), 4197-4220 (2010).</li><li>Bassham Contento, A. L., C, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+catalase-3+activity+as+a+response+to+use+of+alternative+catabolic+substrates+during+sucrose+starvation.">Increase in catalase-3 activity as a response to use of alternative catabolic substrates during sucrose starvation.</a> Plant Physiol. Biochem. 48 (4), 232-238 (2010).</li><li>Kangasjarvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+roles+for+chloroplast+stromal+and+thylakoid-bound+ascorbate+peroxidases+in+plant+stress+responses.">Diverse roles for chloroplast stromal and thylakoid-bound ascorbate peroxidases in plant stress responses.</a> Biochem. J. 412, 275-285 (2008).</li><li>Begara-Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+of+cytosolic+ascorbate+peroxidase+(APX)+by+tyrosine+nitration+and+S-nitrosylation.">Dual regulation of cytosolic ascorbate peroxidase (APX) by tyrosine nitration and S-nitrosylation.</a> J. Exper. Bot. 65 (2), 527-538 (2014).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtrbohD+and+AtrbohF+negatively+regulate+lateral+root+development+by+changing+the+localized+accumulation+of+superoxide+in+primary+roots+of+Arabidopsis.">AtrbohD and AtrbohF negatively regulate lateral root development by changing the localized accumulation of superoxide in primary roots of Arabidopsis.</a> Planta. 241 (3), 591-602 (2014).</li><li>Skoog Murashige, T., F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).</li><li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nuc. Acids Res. 29 (9), (2001).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Phillips, M. A., D'Auria, J. C., Luck, K., Gershenzon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+candidate+reference+genes+for+real-time+quantitative+PCR+of+plant+samples+using+purified+cDNA+as+template.">Evaluation of candidate reference genes for real-time quantitative PCR of plant samples using purified cDNA as template.</a> Plant Mol. Biol. Rep. 27 (3), 407-416 (2009).</li><li>Andersen, C. L., Jensen, J. L., Orntoft, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+real-time+quantitative+reverse+transcription-PCR+data:+A+model-based+variance+estimation+approach+to+identify+genes+suited+for+normalization,+applied+to+bladder+and+colon+cancer+data+sets.">Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets.</a> Cancer Res. 64 (15), 5245-5250 (2004).</li><li>Tsukaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+genetics+of+leaf+morphogenesis+in+dicotyledonous+plants.">Developmental genetics of leaf morphogenesis in dicotyledonous plants.</a> J. Plant Res. 108 (1092), 407-416 (1995).</li><li>Szymanowska-Pulka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form+matters:+morphological+aspects+of+lateral+root+development.">Form matters: morphological aspects of lateral root development.</a> Ann. Bot. 112 (9), 1643-1654 (2013).</li><li>Black Bewley, J. D., Seeds, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physiology of development and germination. , (1994).</li><li>Kato-Noguchi, H., Ota, K., Kujime, H., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+momilactone+on+the+protein+expression+in+Arabidopsis+germination.">Effects of momilactone on the protein expression in Arabidopsis germination.</a> Weed Biol. Manage. 13 (1), (2013).</li><li>Khandelwal, A., Elvitigala, T., Ghosh, B., Quatrano, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+transcriptome+reveals+control+circuits+regulating+redox+homeostasis+and+the+role+of+an+AP2+transcription+factor.">Arabidopsis transcriptome reveals control circuits regulating redox homeostasis and the role of an AP2 transcription factor.</a> Plant Physiol. 148 (4), 2050-2058 (2008).</li><li>Haddad, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-sensing+mechanisms+and+the+regulation+of+redox-responsive+transcription+factors+in+development+and+pathophysiology.">Oxygen-sensing mechanisms and the regulation of redox-responsive transcription factors in development and pathophysiology.</a> Respirat. Res. 3 (1), (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Biz son zamanlarda inanılmaz bir korelasyon GMF ters ve ailesel Angiosperm soyları çoğunun derivasyon 2 oluştu zaman arasında var olduğunu gösterdi. Ancak, GMF ters kendisi bitki gen ifadesi ve morfoloji önemli değişiklikler neden olabilir uyarıcı hipotezler ve çeşitli GMF şiddetlerinde etkisi üzerine yapılan çalışmaların bolluğu, varsayım rağmen gösterilmiştir olmamıştı. Burada, ilk kez için, laboratuarda GMF tersine çevirmek için üç eksenli sekizgen Helmholtz bobini kullanan ve çevre manyetik alanın tersine fenotipik değişiklik ve bitkilerde gen ekspresyonunun modüle edilmesine neden olduğu bir yöntem göstermektedir. Bitki büyüme deneylerinde (2 x 2 x 2 m 3) için yeterli bir hacmi üzerinde GMF ters (veya değiştirilmesi) elde etmek için, biz sekizgen Helmholtz bobin sistemi kurdu. Bu sistem (genellikle Helmholtz bobinleri halka şeklinde ve daha küçük olan) ticari olarak mevcut değildirve inşaat maliyetleri önemli idi. Önemlisi, bu sistem değiştirilmiş manyetik alanlarda olağanüstü zaman istikrar ve homojenlik ile sağlam alan değişikliği sağlıyor. Sistem normal şartlarda bir binde GMF değerini azaltmak veya manyetik alanın üç boyutlu herhangi tersine tasarlanmış ve inşa edilmiştir. Ancak, ruloların tasarımı, yüksek bir manyetik alan gücünden oluşturmak için izin vermez. Bu nedenle, bu biçimde, bu cihaz ya da diğer organizmalar bitkiler yüksek manyetik alan gücü etkisini değerlendirmek için tasarlanmıştır deneyler için uygun değildir. Laboratuarda, bu yöntemde tarif edilenlere benzer GMF değiştirilmesi manyetik alan sapma ve metal kendi içinde onları konsantre yüksek manyetik geçirgenliğe sahip ferromanyetik metal levhalar, deneysel bölgeyi çevreleyen tarafından koruyucu dahil olmak üzere farklı yöntemlerle elde edilmiştir. ThHelmholtz bobinleri kullanılarak e avantajı, sistemin bu nedenle sadece in vitro çalışmalar için (Petri kaplarının kullanımı ile ilgili olarak) doğru değil, aynı zamanda yapım bitkiler daha doğal koşullar (ışık, hava dolaşımı, vs.) maruz kalmasına olanak sağlamasıdır in vivo bitki büyüme ve gelişme deneyler için. Sistemimizde boyutları, böylece birkaç Petri plakaları veya bazı küçük ev sahibi için izin (Şekil 1A bakınız) 25 x 25 x 25 cm3 küresel bir hacim boyunca doğal GMF &lt;1 / 1000. a kadar bastırma izin veren bir boşluk oluşturmak bitki büyümesi için tencere. Burada sunulan yöntem, bitki biyolojisi çalışmaları uygulanmıştır; Bununla birlikte, sistem viroloji, mikrobiyoloji içeren deney geniş bir yelpazede izin verir, hem de nematodlara (örneğin Caenorhabditis elegans), böcek ve (fareler ve sıçanlar da dahil olmak üzere), küçük hayvanlar üzerinde çalışmaları. Bu nedenle, hipotez testleri GMF bu ters yapabiliyormorfolojik ve transkripsiyonel değişiklikler de belki sonuçta hatta insan hücrelerine, diğer pek çok canlı sistemler için uzun olabilir ikna etmek. GMF sürekli değişen ve dalgalanıyor. Bu nedenle, deneylerde bir meydan okuma istenen yeni GMF değerlerini elde etmek için GMF sabit bir telafi sağlamaktır. Bu yalnızca manyetometre değerleri ve gerilim telafisi okunması üzerinden manyetik alan değerleri sürekli bir kontrolü ile elde edilebilir. Bu nedenle, sistem GMF yavaş yavaş değişen bir bölümünü telafi edebilirsiniz ama yüksek frekans dalgalanmaları için hiçbir şey yapmaz. Sonuç olarak, vektör GMF ters üç eksenli bobinlerinin kullanımı GMF vektörünün bu bitki ters morfolojik değişiklikler ve farklı gen ekspresyonunu başlatmak için mümkün olduğunu göstermek için etkili oldu. Sunulan yöntem ile elde edilen sonuçlar hipotezi GMF yeniden destekleyen bir zorlayıcı kanıtevrenselleri jeolojik zaman ölçekleri üzerinde 2 bitki gelişimi için itici güçlerden biri olabilirdi.

Dünya&#39;nın manyetik alanı (veya eşdeğer jeomanyetik alan, GMF) bitkiler de dahil olmak üzere gezegende yaşayan tüm canlılar için kaçınılmaz bir çevresel faktör olduğunu. GMF her zaman Dünya&#39;nın doğal özelliği olmuştur, bu yüzden evrim sırasında, bütün canlı organizmalar eylemini yaşadı. Kanıtlar giderek artan vücut GMF birçok biyolojik süreçleri 1 etkilemek mümkün olduğunu göstermektedir. GMF üniforma değildir ve Dünya&#39;nın yüzeyinde, büyüklüğü ve yönü önemli yerel farklılıklar vardır. Dünya&#39;nın yüzeyinde GMF az 30 μT neredeyse 70 μT arasında değişen, büyüklükleri geniş bir yelpazede gösterir. GMF magnetosphere 2 aracılığıyla yüklü parçacıkların çoğu saptırma ile güneş rüzgarının öldürücü etkilerinden Dünyayı ve biyosfer korur. Bitkiler çevresel uyaranlara cevap; ve ışık ve yerçekimi gibi abiyotik faktörlere klasik tepkiler t olmuşturhoroughly adlandırılan phototropic ve gravitropic yanıtları tanımlayarak tarif. Çok az ya da hiçbir şey bu konuda yayınlanmış ve son zamanlarda 1 yorum kağıtları bolluk rağmen, algı ve manyetik alanlar bitki yanıtların mekanizmaları üzerine bilinmektedir. Yerçekimi alanı aksine, GMF böylece son zamanlarda çeşitlendirilmesi ve türleşme 2 bitki katkıda sonunda potansiyel itici güç olarak kabul edilmiştir önemli bir stres faktörü temsil eden abiyotik bitki evrimi sırasında sürekli değişti. Jeomanyetik ters (veya geziler) GMF kutupluluğunda değişikliklerdir. Dünya&#39;nın yaşam tarihi boyunca, GMF ters birkaç kez oluştu. Bunlar her polarite geçişi sırasında azalmış GMF gücü dönemlere gezegeni maruz. Düşük GMF gücü bu geçişler dönemleri böylece bir uyarıcı, yeryüzüne ulaşması güneş rüzgardan iyonizan radyasyon izin olabileceğini Bazı yazarlar hipotez varevrimi 2 bitki lider sonunda gen değişiklikleri ikna etmek için yeterince güçlü olabilirdi canlı organizmalar için tutarlı stres. Bitkiler üzerinde manyetik alanların etkilerini anlatan deneylerin ayrıntılı bir analiz makul biyofizik etkileşim mekanizmalarının bir eksiklik ile karakterize çatışan raporlar, çok sayıda gösterir. Diğerleri sonuçta 3 inandırıcılıktan uzak olan, bir denenebilir hipotezini eksikliği ve süre birçok deney, sadece gerçekçi değildir. Son yıllarda, bitki manyetik alanların etkisi ilerleme ve araştırma statüsü 2,4-11 gözden geçirilmiştir. Son zamanlarda, hem düşük hem de yüksek manyetik alan etkisi iyice bitki evrimi 2 GMF ters olayların katılımı özel bir odaklanma ile, 1 tartışılmıştır. En doğrudan aracı GMF ters bitki evrimi bir GMF sentezlenmesi etkileyecek hipotezini kanıtlamak içinNormal ve ters manyetik alan koşullarına bitkilerin tepkisini test ederek laboratuvar ters. Hipotezi test etmek için, biz bu nedenle doğru, normal GMF koşulları tersine için güçlü bir üç eksenli sekizgen Helmholtz bobin-çiftleri manyetik alan kompanzasyon sistemi (üç eksenli bobinler), inşa. Biz bir model bitki olarak, Arabidopsis thaliana kullanılır ve bazı önemli genlerin gen ifadesi üzerinde ters GMF etkisi test edilmiştir: CRUCIFERIN 3 (CRU3), Trosin-fosforilat olan ve fosforilasyon durumu karşılık olarak modüle edilen bir 12S tohum depolama proteini kodlayan Arabidopsis thaliana tohumları 12,13 yılında ABA için; Toprak Cu edinimi ve polen gelişimi 14 baskın fonksiyonu ile bir ağır metal taşıma / detoksifikasyon süperailesi proteinini kodlayan Bakır Ulaşım Protein1 (COTP1); ve Redoks Responsive Transkripsiyon faktörüne 1 (RRTF1),Bu EAF (etilen tepki faktörü) alt familyası B-3 gen sentezleme yollarının sinerjistik eş aktivasyonunu kolaylaştırır ve abiyotik çapraz tolerans ve biyotik 15 gerilmeler bir AP2 alanını ihtiva EAF / AP2 transkripsiyon faktörü ailesinin bir üyesi kodlar. Ayrıca biz de oksidatif stres tepkileri ile bağlantılı olan beş genleri analiz: enzimatik ve hızlı bir süperoksit anyonu dönüştüren bir sitoplazmik enzimi kodlayan Fe Süperoksit Dismutase1 (FSD1), (O 2 -) ve su (H2O) hidrojen peroksit (H su ve oksijene 17,18 H nin parçalanmasını 2 O 2 katalize Catalase3 (diğer bir deyişle kodladığını CAT3) ve enzim,, 2 O 2) ve moleküler oksijen (O 2) 16 Thylakoidal askorbat peroksidaz (TAPX) bir kodlayan H 2 O scavenges kloroplastik tilakoit peroksidaz2 19, H2O 2 temizler ve NO türetilen moleküller 20 tarafından aracılık edilen translasyon sonrası modifikasyonların potansiyel hedefler birini temsil sitozolik peroksidazı kodlayan Askorbat Peroxidase1 (APX1); ve O 2 üreten bir enzimi kodlayan NADPH- Solunum patlama oksidaz protein D (RbohD) - ve Arabidopsis 21 büyüme, gelişme ve stres yanıtları düzenlenmesinde önemli rol oynar. Bizim alan ters metodolojisi GMF ters A. morfolojisi ve gen ifadesinde önemli bir değişiklik uyarabilir ilk kanıt sağlar thaliana kökler ve sürgünler. Bu protokol ro tartışma bitki morfolojisi ve gen ifadesi üzerinde GMF bozma etkisini değerlendirmek için ve bitki davranışının diğer yönlerini GMF bozma potansiyeli etkisini değerlendirmek için kullanılabilir ve böylece rehberlik yenilikçi bir yol sağlarBitki evrimi GMF bozma le.

<table><tbody><tr><td>Three-axis magnetometer</td><td>Bartington&amp;nbsp;</td><td>Mag-03MC</td><td>triaxial fluxgate magnetometer</td></tr><tr><td>Magnetometer power supply</td><td>Bartington&amp;nbsp;</td><td>Mag-03PSU</td><td>triaxial fluxgate magnetometer</td></tr><tr><td>Magnetometer software</td><td>Bartington&amp;nbsp;</td><td>Mag03DAM</td><td>triaxial fluxgate magnetometer</td></tr><tr><td>DC power supply&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>E3642A</td><td></td></tr><tr><td>Calcium hypochlorite&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>211389</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>X100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>GroLux Sodium vapor lamps&amp;nbsp;</td><td>OSRAM Sylvania</td><td>600W</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plant RNA kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74903</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>not available</td><td></td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>Mx3000P</td><td>Agilent Technologies</td><td>401512</td><td></td></tr><tr><td>2x MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix&amp;nbsp;</td><td>Fermentas International, Inc</td><td>K0221</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Medium</td><td>Sigma</td><td>M5519&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish square (120 x120 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td><td>Sigma</td><td>Z692344&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

geomagnetic field (gmf) and plant evolution: investigating the effects of gmf reversal on arabidopsis thaliana development and gene expression

Bitkilerin evrimi en uyarıcı gözlemlerden biri jeomanyetik alanın oluşumu (GMF) ters (veya geziler) ve Angiospermlerin radyasyon anı arasında bir ilişki olduğunu. Bu GMF polariteli değişiklikler, bitki gelişiminde rol oynayabilir hipotezine yol açmıştır. Burada, biz yapay GMF koşulları tersine için Arabidopsis thaliana&#39;yı teşhir ederek, bu hipotezi sınamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu üç eksenli bir manyetometre ve toplanan veriler GMF büyüklüğünü hesaplamak için kullanıldı. Üç DC güç kaynakları üç Helmholtz bobin çiftleri bağlandı ve GMF şartlarını değiştirmek için bir bilgisayar tarafından kontrol altına alındı. Petri kapları yetiştirilen bitkiler hem normal maruz kalan ve GMF koşulları tersine döndü. Sham uyarı deneyleri de gerçekleştirildi. Exposed bitkiler deney sırasında fotoğraflandı ve görüntüleri kök uzunluğu ve yaprak alanlarını hesaplamak için analiz edildi. Arabidopsis toplam RNA, ekstre edilmiş ve nicel edildiGerçek zamanlı PCR (qPCR) CRUCIFERIN 3 (CRU3), bakır taşıma protein1 (COTP1), Redox Duyarlı Transkripsiyon faktörüne 1 (RRTF1), Fe Süperoksit dismutaz 1 (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal gen ekspresyonu üzerindeki analizleri yapılmıştır Askorbat peroksidaz (TAPX), sitozolik Askorbat Peroxidase1 (APX1) ve NADPH / solunum patlaması oksidaz protein D (RbohD). Dört farklı referans genleri qPCR sonuçları normalleştirmek için analiz edildi. Dört genin en seçildi ve normalleşmesi için en kararlı gen kullanıldı. Bizim verilerimiz üç eksenli bobinleri kullanarak GMF kutuplarını ters bitki büyüme ve gen ifadesi üzerinde önemli etkileri olduğu ilk kez gösteriyor. Bu sonuçta p giden, daha yüksek bir seçici baskı haklı olabilir GMF ters bitki gelişiminde değişiklikleri uyaran katkıda hipotezini desteklemektedirlant evrim.

Bu protokolün amacı, set GMF ters kullanılan Şekil 1A gösterildiği gibi jeomanyetik alanın (GMF) ters bitki gelişimi ve Arabidopsis thaliana ekotip Col 0. Üç eksenli bobinlerin gen ifadesini etkileyebilir olmadığını değerlendirmek için bir yöntem sağlamaktır Protokolde aşama 1,5 de tarif edildiği gibi uygun bir tahrik gerilimleri (Şekil 1B), elde edilmiştir. Üç eksenli bobin boyutları ~ birkaç Petri plakaları barındırmak için ters GMF koşulları yeterli boşluk izin 2 x 2 x 2 m 3. Kontroller, aynı çevre koşullarında, normal GMF değerleri büyütülmüştür. GMF koşulları normale maruz 10 gün sonra ve ters, bitkilerin fenotipi belirgin morfolojik değişiklikler göstermiştir. Şekil 2 de gösterildiği gibi, (normal GMF koşullarında yetiştirilen yani,) kontrol bitkileri belirgin bir şekilde (Dunn-Bonferroni Sidak ve Arındırılmış Prob &lt;0,001 kök uzunlukları göstermiştir;Ters GMF maruz bitkilere göre (17.53 mm N = 32);; Student t = 10.68, df = 31) yüksek değerler (29.41 mm; SEM = 1.04 SEM = 0.58; N = 36). GMF-ters bitkilerde sürgün morfolojisi de yaprak genişlemesinin indirgenmiş gelişme göstererek değiştirilmiştir. Öğrencinin t = 31.32, df normal koşullara maruz kalan bitkiler 4.95 mm 2 (SEM 0.025, N = 54), ters GMF koşullarına maruz kalan bitkiler anlamlı gösterdi oysa (Dunn-Sidak ve Bonferroni Düzeltilmiş Prob = &lt;0.001 ortalama yaprak alanı gösterdi = 53) daha düşük yaprak alanı değerleri (3.71 mm 2, SEM = 0.032; N = 54). Bu nedenle, ters GMF koşulları Arabidopsis maruz kök uzunluğu ve yaprak alanı hem de bir azalmaya neden. Yaprak genişlemesi ve kök gelişiminin bölünmesi ve hücreler 27 uzama hem de bağlıdır. Bu nedenle, bitki gelişimi, verimlilik ve genel uygunluk &lt;optimal atış ve kök-sistem mimarisine bağlıdırsup&gt; 28. Ters GMF koşullarına maruz kalan bitkiler, indirgenmiş kök uzunluğu ve yaprak boyutu manyetik alan yoğunluğu değişimleri algılamak sadece bir sensör sisteminin varlığı mümkün olduğunu hem de gravite ile karşılaştırıldığında manyetik alan &quot;yönünde&quot; değişikliklere cevap vermek. GMF ters bitki büyümesini etkileyebilir hipotez GMF ters koşulları önemli ölçüde bitki gelişimini etkileyebilir olduğunu göstermektedir deneyler, zorlayıcı kanıtlar bulur. Morfolojik değişiklikler aynı zamanda gen ekspresyonunda değişmeler ile eşlik edilmiştir. Temizlik genler arasında, en kararlı gen uzama faktörü 1B alfa alt birim 2 idi. Genin (CRU3, COTP1, RRTF1) ilk grubu gen ekspresyonunda belirgin bir değişiklik (Şekil 3). Üç genin ekspresyonu anlamlı rezerv maruz bitkilerde yaklaşık 2.5 misli (p &lt;0,05) artmıştır Sürgünd GMF koşulları. CRU3 kök ekspresyonu normal GMF koşullara maruz kalan bitkiler köklerinin yukarı regüle ancak (P &lt;0.05) ters GMF koşulları olarak azaldı belirgin oldu. Ters (Şekil 3), normal koşullarda olarak azaldı ve GMF ters mevcudiyetinde yukarı regüle edilmiştir ve COTP1 RRTF1 için bulunmuştur. Krusiferin (12 S globulin) A&#39;nın tohumlarda en çok görülen bir depolama proteinidir thaliana ve diğer turpgillerin, ve kaba endoplazmik retikulum içinde bir ön işaret olarak sentezlenir. Daha sonra, protein, depolama vaküol 13 nakledilir. Çimlenme Fide azot bir başlangıç ​​kaynağı olarak kullanılmaktadır krusiferin, parçalanmasını gerektirir. Yük Atma bozulması krusiferin hücre yapılarını ya da hücre bileşenleri geliştirme 29,30 bozarak embriyoların gelişimi azaltır. Sonuçlarımız CRU3 üst ayarlanması ile ilişkili olduğunu göstermektedirböylece aşırı ekspresyonu GMF ters ve bu hassas, bu gen, bitki gelişiminin azalmaya neden olabilecek belirten bir alt kanat genişlemesi ve daha düşük bir kök uzunluğu. Ayrıca, GMF ters azaltılmış kök uzunluğu ile ilişkilidir köklerinde CRU3 önemli bir down-regüle, uyarmaktadır. Bakır bitkilerde önemli süreçler için temel kofaktör, ancak aşırı zararlı etkiler; Böylece, bakır taşıma fazla sentezleyen bitki büyümesini taviz. GMF bozma etkisi dolayısıyla azaltılmış bitki gelişimini açıklayan sürgün ve kökleri hem COTP1 önemli bir aşın oldu. İyon stres sıkıca hücrenin redoks durumuna bağlıdır kloroplast metabolizması, bozar. Arabidopsis olarak transkripsiyon faktörü RRTF1 31 değişikliği redoks ayarlamak yeteneği ilişkili genlerin ekspresyonu için önemlidir. Bu nedenle, ne zaman bitkiler fizyolojik ve gelişimini değiştirmek mümkün dış uyaranlara maruzal programları bu önemli transkripsiyon faktörünün bir aşın bekleniyor. GMF iptali böylece ters GMF koşulları bitkilerin yüksek oksidatif stres tepkileri gösteren sürgünler ve kökler hem RRTF1 önemli bir aşın kaynaklı. Ilginç sonuçlar oksidatif stresi dahil beş genleri analiz edilerek elde edilmiştir. Genel olarak, sürgünler çıkarılan ve analiz tüm genlerin bitkiler normal yetişen veya GMF koşulları (Şekil 4 ve Şekil 5) tersine dönmüş önemli farklılıklar (P&gt; 0.05) yoktu. Bununla birlikte, önemli bir aşağı-regülasyon, her zaman ters GMF koşullarına maruz kalan bitkilerin kökleri gözlenmiştir. Özellikle, CAT3 (Şekil 5), APX1, FSD1, RBOHD ve TAPX (Şekil 4) ile aşağı doğru düzenleme sırasına ardından yüksek down-regüle göstermiştir. Bir Çapraz toleransbiyotik ve biyotik stres biyokimyasal yollarla ilgili farklı genlerin aktivasyonu ile sağlanır. RRTF1 transkripsiyon faktörü, bu yolların 15,31 gen ekspresyonunun sinerjistik eş aktivasyonunu kolaylaştırır, ve potansiyel olarak oksidatif stres 32 dahil edilebilir. Oksijen tutucu azalır, bu nedenle, RRTF1 yukarı-regülasyonunun beklenmektedir. Kök kirleticilerin alınmasına yönelik enzim baskılanması artan oksidatif strese tepki olarak hareket eden RRTF1 yukarı regülasyonu ile ilişkilidir. CAT3, APX1 ve TAPX dramatik kök downregülasyonu FSD1 azalma ile süperoksit anyon dismutate yeteneğinde azalma eşlik eder H 2 O 2, temizlemek için kök hücreleri azalır yeteneğini gösterir. Oksidatif stres yanıtları ters GMF algı ana site gibi görünen kökleri, daha yüksektir. Şekil 1. jeomanyetik alan Tazminat sistemi. (Üç dikey eksenin her biri için sekizgen bir çift bobini içerir) (A) üç eksenli rulolar yer manyetik alanın vektör tersine çevirmek için kullanılabilir. (B) bir bilgisayar kontrollü güç kaynağı Helmholtz bobinleri her bir çiftine bağlanmıştır. (Bu rakamlar Gerilimler keyfi) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53286/53286fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53286/53286fig2.jpg" /> Şekil Arabidopsis morfolojisi jeomanyetik alan bozma 2. Etkileri. Pozlama, kontrol bitkilerinin on gün sonra (normal GMF koşullara maruz kalanlar, yani) anlamlı olarak daha fazla kök uzunluğu ve daha Expan göstermekded bildiriler ters GMF koşullarına maruz kalan bitkiler ile karşılaştırıldığında. Metrik bar = 18 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53286/53286fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53286/53286fig3.jpg" /> Şekil Arabidopsis gen ifadesi üzerinde jeomanyetik alan bozma 3. Etkileri. Maruz kalma on gün sonra, kontrol ve tedavi edilen bitkilerin toplam RNA ekstrakte edildi ve ekspresyon analizi için gerçek zamanlı PCR ile analiz edildi. . COTP1, Bakır Taşıma Protein1;, RRTF1, Redoks Duyarlı Transkripsiyon faktörüne 1 GMF tersine etkisi CRU3, krusiferin 3, test edilen tüm genlerin gen ifadesi ciddi bir değişikliğe neden oldu. Barlar standart hata gösterir; yıldızlarla pl arasında anlamlı (p &lt;0.05) farklılıklar gösterirters ve normal GMF şartlara maruz karıncalar. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53286/53286fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53286/53286fig4.jpg" /> Şekil Arabidopsis antioksidan ilgili gen ifadesinin üzerinde jeomanyetik alan bozma 4. Etkileri. Maruz kalma on gün sonra, kontrol ve tedavi edilen bitkilerin toplam RNA izole edildi ve Gerçek Zamanlı PCR kullanılarak gen ekspresyon analizi için kullanılmıştır. GMF tersine etkisi sürgün gen ifadesinde anlamlı değişikliklere neden oldu; Bununla birlikte, ciddi bir aşağı doğru düzenleme ters GMF koşullar altında yetiştirilen bitkilerin kök gen ekspresyonu gözlenmiştir TAPX, Thylakoidal Askorbat Peroksidaz;. APX1, Askorbat Peroxidase1; FSD1, Fe Süperoksit Dismutase1; RbohD, NA. DPH / Solunum patlama oksidaz protein D Barlar standart hata gösterir; yıldız ters ve normal GMF şartlara maruz bitkiler arasında önemli (P &lt;0.05) farklılıklar gösterir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53286/53286fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53286/53286fig5.jpg" /> Şekil Arabidopsis Katalaz 3 (CAT3) gen ifadesi üzerinde jeomanyetik alan bozma 5. Etkileri. Maruz kalma on gün sonra, kontrol ve tedavi edilen bitkilerin toplam RNA izole edildi ve Gerçek Zamanlı PCR kullanılarak gen ekspresyon analizi için kullanılmıştır. GMF tersine etkisi sürgün gen ifadesinde anlamlı değişikliklere neden oldu; Bununla birlikte, ciddi bir aşağı doğru düzenleme ters GMF koşullar altında yetiştirilen bitkilerin kök gen ekspresyonu gözlenmiştir. Barlar standart Erro gösterirr; yıldız ters ve normal GMF şartlara maruz bitkiler arasında önemli (P &lt;0.05) farklılıklar gösterir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53286/53286fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression at JoVE.com

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

Manyetik Alan (GMF) ve Bitki Gelişimi: GMF İptalleri Etkileri üzerine Araştırılması<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Geliştirme ve Gen İfadesi

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

geomagnetic-field-gmf-plant-evolution-investigating-effects-gmf

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

13.2K Görüntüleme.  University of Turin. This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

Video: Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

Gen ifadesinin artan işlem hacmi ile alı arpa Aleurone katmanlarında ölçme

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

Genetik

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade Arabidopsis thaliana aracılığıyla LhGR-aracılı Trans-harekete geçirmek

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Embriyogenez Arabidopsis olarak karakterize bir yöntem

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Gelişim Biyolojisi

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Biyoloji

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-daldırma Dönüşüm Arabidopsis thaliana Inceleyin PTSO2: β-glucuronidase Reporter Gen İfadesi

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of dormant seeds or that of nondormant seeds irradiated by a far red (FR) light pulse. In order to further gain insight into the molecular genetic mechanisms underlying the germination repressive activity exerted by the endosperm, a &#34;seed coat bedding&#34; assay (SCBA) was devised. The SCBA is a dissection procedure physically separating seed coats and embryos from seeds, which allows monitoring the growth of embryos on an underlying layer of seed coats. Remarkably, the SCBA reconstitutes the germination repressive activities of the seed coat in the context of seed dormancy and FR-dependent control of seed germination. Since the SCBA allows the combinatorial use of dormant, nondormant and genetically modified seed coat and embryonic materials, the genetic pathways controlling germination and specifically operating in the endosperm and embryo can be dissected. Here we detail the procedure to assemble a SCBA.

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

We present the procedure to assemble a seed coat bedding assay (SCBA) from Arabidopsis thaliana seeds. The SCBA was shown to be a powerful tool to explore genetically and in vitro how the endosperm controls seed germination in dormant seeds and in response to light cues. The SCBA is in principle applicable under any situation where the endosperm is suspected to influence embryonic growth.

Genetiği keşfedin A Tohum Kabuğunun Yatak Deneyi<em&gt; In Vitro</em&gt; Nasıl Endosperminde Denetimler Çimlenme içinde<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Ölçme Mekansal ve zamansal Ca<sup&gt; 2+</supArabidopsis Bitkilerde&gt; Sinyalleri

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Manyetik Alan (GMF) ve Bitki Gelişimi: GMF İptalleri Etkileri üzerine Araştırılması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Gen ifadesinin artan işlem hacmi ile alı arpa Aleurone katmanlarında ölçme

İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade Arabidopsis thaliana aracılığıyla LhGR-aracılı Trans-harekete geçirmek

Embriyogenez Arabidopsis olarak karakterize bir yöntem

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana

Floral-daldırma Dönüşüm Arabidopsis thaliana Inceleyin PTSO2: β-glucuronidase Reporter Gen İfadesi

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon

Genetiği keşfedin A Tohum Kabuğunun Yatak Deneyi

Ölçme Mekansal ve zamansal Ca

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme