Name: using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements
Uploaded: 2015-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements at JoVE.com

The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.

NOT: Bir kırmızı iskelet kası mitokondri izole sonra Bu protokol başlar. Kırmızı iskelet kası 13, 100 mg - daha önce ~ 75 altında tarif edildiği gibi Mitokondri izole edilmiştir. Mitokondriyal protein 10 ug / ul mitokondri için izolasyon tampon ≤50 ul son mitokondriyal pelet (IBM) 2 (Frisard ve ark 13 bakınız) resuspending doku bu tutardan ulaşılacaktır - 5 arasında. 1. Kur <ol><li> Sonraki deneyleri için stok çözeltileri (Tablo 1) ve mitokondriyal tahlil çözeltisi (MAS) karışımları (Tablo 2) çalışma hazırlayın. Not: En stokları çözeltiler ve MAS saklanabilir gibi tahliller için hazırlık çoğu önceden yapılabilir. </li><li> 37 ° C &#39;de olmayan bir CO2 inkübatör içinde deneyden önce gece 1 mi kalibrasyon çözelti içinde respirometrik deney kartuşu hidratı. </li><li> Deney, t günlük37 ° C banyo veya inkübatör donmuş stokları (yüzeyler ve mitokondriyal modülatörleri MAS karışımı, MAS BSA o / w, Tablo 1) ve çözülme dışarı ake. </li><li> Tüm alt-tabaka solüsyon (Tablo 3) ve iğne (Tablo 4-5) hazırlamak ve (pH 7,4), arzu edildiği gibi pH ayarlamak. PH değeri ayarlandıktan sonra, buz üzerinde muhafaza edin. </li><li> Program, uygun karışımı, bekleyin ve ölçü parametreleri çok iyi oksijen tüketimi ölçüm makine ilk &quot;Standart&quot; modunda ardından analiz yazılımı, girerek ve etiket arka plan ve grup / durumu kuyular (Tablo 6 bakınız). <ol><li> &quot;Misafir&quot; forumunda giriniz ve &quot;Testi Sihirbazı&quot; üzerine tıklayın. Bir kez &quot;Deney Wizard&quot; olarak, karışımı değiştirmek bekleyin ve parametreleri ölçmek için &quot;Protokolü&quot; üzerine tıklayın. &quot;Geri altında arka plan kuyuları etiketleyin. Düzeltme &quot;sekmesine gidin ve vurgulamak için emin olun&quot; &quot;arka plan düzeltme yapın. </li><li> Etiket koşul&quot;Grup Info&quot; sekmesinin ardından &quot;Gruplar ve Etiketler&quot; sekmesine tıklayarak ilk tarafından itions. Bu parametreler girildikten sonra, &quot;Save Template&quot; ardından tıklayın &quot;End&quot;. </li></ol></li></ol> 2. Testi Çalıştır <ol><li> Bir tahlil çalıştırmak kartuşu içine enjeksiyon çözümleri yükleyin ve ilk &quot;Standard&quot; moduna girerek takip analiz yazılımı, girerek kalibrasyonu başlatın. &quot;Misafir&quot; forumunda giriniz. &quot;Şablonlar&quot; sekmesi altındaki &quot;XF&quot; sürücüsünün altında adım 1.5 kaydettiğiniz şablonu açın. Açık kez kalibrasyon başlamak için &quot;Başlat&quot; a tıklayın. Not: Tahlil çalıştırmak kartuş alt sol kesik köşesi makinenin içine girilmelidir. Bu yaklaşık 30 dakika sürer. Uygun liman içine enjekte çözüm için özen gösterin. Tablo 4-5 enjeksiyonları yükleme sırasına göre listelenir. </li><li> Yavaşça, ama iyice karıştırın mitochondnazikçe makas ile ucu ucuna kapalı ~ 3 mm keserek genişletmiştir onun deliği olmuştur 200 ul pipet ile stok triturating ardından 200 ul pipet ile çözüm karıştırılarak ria stok. </li><li> Mitokondriyal stokunun protein konsantrasyonu belirlemek için bir bisinkoninik asit (BCA) deneyi gerçekleştirmek. </li><li> Aşama 2.3 elde edilen stok konsantrasyonu kullanarak, / sukinat / rotenon substrat karışımı 200 ul (Tablo 3), mitokondriyal protein 10 ug yeniden süspanse edin. Mitokondriyal protein 14 ug / kalan substrat karışımları 200 ul (Tablo 3) (Bu, her substrat karışımı için yapılmalıdır) tekrar süspansiyon. Tüm mitokondriyal protein / alt-tabaka buz karışımları yerleştirin. Not: Önceden 9 tarif edildiği gibi her bir deney için oyuk başına mitokondriyal protein optimal miktarı belirlenmiştir. Bu tespit edilmiştir piruvat / malat, palmitoil karnitin / malat, glutamat / malat birsüksinat / rotenone tahlil mitokondriyal protein 2.5 ug başına iyi kullanır iken d elektron akışı deneyleri, mitokondriyal protein 3.5 ug kullanır. Bu nedenle, araştırmacı 4 beri bu adımda çoğaltır için yeterli mitokondriyal protein tekrar süspansiyon gerekiyor ya 2.5 ug veya 50 ul başına 3.5 ug kuyu başına yüklenir (adım 2.6 bakınız). </li><li> Yavaşça, ama iyice hafifçe sonu ~ 3 mm olmuştur 200 ul pipet ile stok triturating ardından 200 ul pipet ile çözüm karıştırılarak mitokondri / substrat çözümleri karıştırın kesti. </li><li> Yük 50 ul / oyuk mitokondri / substrat karışımı her biri buz üzerinde ve üç kopya halinde bir hücre kültür plakası yerleştirin. Mikro-bazlı respirometrik tahlilin geliştiriciler, tercihan, hücre kültür plakası üzerine iki tarafında, iki boş (mitokondri) kuyu en az bırakarak önerilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 2000 g&#39;da hücre kültürü plakası dönerler. Plaka s ikeniğneleme, 37 ° C su banyosunda substrat çözümleri ısınmak. </li><li> Sıkma işlemi tamamlandıktan sonra, dikkatli bir şekilde, ilgili haznelerin üstüne her bir taban çözeltisi 450 ul yük (örneğin, başlangıçta bu alt-tabaka çözeltisi içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş mitokondri sahip oyuklara piruvat / malat substrat yük). RT&#39;de plaka yüklemek için emin olun. Not: Boş kaplar alt-tabaka 500 ul ile yüklenmiş olması gerekir. Birleştirilmiş bir deney boş oyukları birleştirme deneyi, substrat ile yüklenebilir ise elektron akışı analizi için belirlenmiş Boş kaplar, elektron akışı alt-tabaka (Piruvat / Malat + FCCP) ile yüklenmiş olması gerekir. Not: Aynı plaka üzerinde akuple ve elektron akış deneyleri gerçekleştirmek Eğer tahlil çalıştırmak &quot;Enstrüman&quot; sekmesinden &quot;XF Reader&quot; platformu kullanarak tamamlandıktan sonra, araştırmacı ilgili deneyleri arka plan kuyuları yeniden atamanız gerekir. Bir kez &quot;Enstrüman&quot; ortamında, &quot;Administration&quot; linkine tıklayın&quot;Arkaplan Düzeltme&quot; takip sekmesi. Tamamlandığında Hit &quot;Cihaz Kurulumu Mode End&quot;. Askorbat / TMPD kombinasyonu böylece ayrı bir arka plan düzeltmesi her tahlil türü için gerekli olan O 2, tüketmek olmasıdır. </li><li> Alt-tabakanın 450 ul her bir göze ilave edildikten sonra, mitokondri, tek tek tabaka içinde muntazam bir şekilde dağılmış olduğundan emin olmak için iyi bir mitokondri katmanı görüntülemek (20X büyütme [Rogers 9 Bakınız, Şekil 4]). Bir eşit dağıtılmış tek tabaka var görünmüyor Wells sonrası hoc kaldırılabilir. </li><li> Mitokondriyal bağlılık için kontrol ettikten sonra, respirometrik tahlil aracı haline mikroplağı yerleştirin ve &quot;Tamam&quot; tıklayarak çalıştırın tahlil başlayın. Not: run başlayacak önce adım 2.1 kalibrasyon eksiksiz olmalıdır. Araştırmacı &quot;Tamam&quot; tıkladığında, makine kalibrasyonu için kullanılan bir yardımcı programdır plakasını çıkarır. <ol> &lt;li&gt; yarar plakasını çıkarın ve tepsiye mitokondri içerir hücre kültürü plakasını yerleştirin. Hücre kültürü plaka üzerinde mavi çentik kasetin sol alt köşesine yerleştirilmelidir. Tahlil çalışmasını başlatmak için &quot;devam&quot; üzerine tıklayın. </li></ol></li><li> Çalışma tamamlandıktan sonra, ekranda &quot;Çıkart&quot; düğmesine basarak hücre kültürü plakasını ve kartuşu çıkarın. <ol><li> Plaka atılır sonra, kaldırmak ve hücre kültürü plakasını ve kartuşu atmak ve ekranda &quot;Devam&quot; butonuna tıklayınız. Run otomatik olarak &quot;Veri&quot; dosyasında bir .xls dosyası olarak kaydedilecektir. </li></ol></li><li> Bu dosyayı açın ve altındaki aşağı ok vurarak &quot;OCR&quot; ile &quot;O2&quot; dan görüntüsünü değiştirmek &quot;Y1:&quot; işaretleyici. <ol><li> Seçeneği altında: Sonraki değişiklik için &quot;Noktadan Noktaya Oranları&quot; &quot;Middle Point&quot; &quot;Oranı Verileri görüntüleniyor&quot;. Bu değişiklikleri uygulamak için &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. </li></ol&gt; </li><li> Birbirine benzer koşullar grup kuyuları için ekranın alt solunda &quot;Eh Grubu Mode&quot; sekmesini tıklayın. Son olarak, sola, ekranın ortasına doğru &quot;Örnek Ortalama / Standart Hata&quot; sekmesine tıklayın. Tahlil &quot;Tahlil Sihirbazı&quot; ayarı başlamadan Alternatif olarak, bu komutlar kurulum olabilir. Not: Her koşul her oranda ve her durum için görüntülenen ± standart sapma bir ortalama olacaktır. Durum (Devlet 2 [Kavrama] / State3u [Elektron Akışı] solunum dört enjeksiyonları takiben) başına alınan hızı ölçümleri vardır. , Enjeksiyon oligomycin sonra asgari noktada State 4o belirlemek, ikinci ölçüm Devlet 2 oranının ortalamasını kullanın sırasıyla ADP ve FCCP enjeksiyonu, sonra Devlet 3 ve Devlet 3U için maksimum noktası kullanmak ve Antimycin A için minimum noktası kullanmak Kavrama Tahliller için indüklenen solunum. Minimum kullanmak, piruvat / malat kaynaklı Devlet 3u solunum için maksimum noktası kullanınrotenone kaynaklı solunum için gelin, süksinat kaynaklı Devlet 3u solunum için maksimum noktası kullanmak ve Elektron Akış analizi için Antimycin bir neden olduğu solunum için minimum noktasını kullanın. Bütün deneyler 3 kez yapıldı ve gösterilen veriler temsili bir izleme sonuçlarıdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Brand, M., Nicholls, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435, 297-312 (2011).</li><li>Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+muscle+mitochondrial+DNA+content,+mitochondrial+enzyme+activity+and+oxidative+capacity+in+man:+alterations+with+disease.">Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease.</a> European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80, 22-27 (1999).</li><li>Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome+in+aging+and+senescence.">The mitochondrial genome in aging and senescence.</a> Ageing Research Reviews. 18C, 1-15 (2014).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148, 1145-1159 (2012).</li><li>Dube, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+lipid+overload+on+skeletal+muscle+insulin+resistance,+metabolic+flexibility,+and+mitochondrial+performance.">Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance.</a> Endocrinology and Metabolism. 307, E1117-E1124 (2014).</li><li>Disease Control and Prevention Services. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+diabetes+statistics+report:+estimates+of+diabetes+and+its+burden+in+the+United+States.">National diabetes statistics report: estimates of diabetes and its burden in the United States.</a> , (2014).</li><li>Guarino, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+determining+oxygen+consumption+rates+of+static+cultures+from+microplate+measurements+of+pericellular+dissolved+oxygen+concentration.">Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 775-787 (2004).</li><li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes.">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nature Protocols. 1, 2563-2572 (2007).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746 (2011).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, C125-C136 (2007).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells.">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods (San Diego, Calif.). 26, 292-297 (2002).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li><li>Frisard, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+levels+of+lipopolysaccharide+modulate+mitochondrial+oxygen+consumption+in+skeletal+muscle.">Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle.</a> Metabolism. 64, 416-427 (2015).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation.">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. 17, 65-134 (1956).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pathways+and+respiratory+control.">Mitochondrial pathways and respiratory control.</a> , (2007).</li></ol>

George W. Rogers, bu deneyleri geliştirildi hangi cihazı üretmektedir Seahorse Bioscience bir çalışanıdır.

Fare iskelet kası 100 mg - Bu makalede sunulan yöntemler 75 izole edilen mitokondri kullanarak mikroplaka bazlı Respirometrik tahlillerin bir koleksiyon performansı için adım adım yönergeler sağlar. Üç kopya halindeki gözlerin arasında sıkı standart sapma ile kanıtlandığı gibi Bu deneyler, yüksek bir kesinlikle gerçekleştirilebilir. Önemlisi, bu Respirometrik deneyler anormallikler ve / veya uyarlamalar yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelinde ETC, TCA döngüsü, β-oksidasyon yolu, alt tabaka taşıyıcılar, vb meydana olabilir nerede saptayarak izin verir. Bu protokolde kullanılan çeşitli yakıtlar ve inhibitörleri kullanım gerekçesini vurgulamak önemlidir. Piruvat / malat ve glutamat / malat respirometrik deneyler Kompleks I aracılı solunum değerlendirmesi ve aynı zamanda bunların ilgili taşıyıcılar değerlendirilmesi için izin verir ve glutamat durumunda deaminaz 15. Seçenek olarak ise, kombinerotenone karmaşık I inhibe eder ve süksinat flavin adenin dinükleotid azaltılması yoluyla Kompleks II&#39;nin elektronları sağladığı süksinat / rotenone (FADH 2) 15 ETC Kompleksi II ile mitokondriyal solunum akının değerlendirilmesini sağlar. Bu deneyler kavrama verimliliği ve maksimal solunum olarak substrat özgü bilgiler sağlar. Elektron akış deneyi substratları ve önleyicilerinin kombinasyonu mitokondriyal solunum akı 9 sırasında birden fazla kompleksleri değerlendirilmesi için izin vermesidir eşsizdir. Süksinat ardından rotenone enjeksiyon Kompleksi II tarafından tahrik değerlendirme maksimum solunum için izin verirken piruvat / malat + FCCP ilk substrat karışımı, Kompleks I tarafından yönlendirilen maksimal solunum değerlendirilmesi için izin verir. Askorbat enjeksiyonu takiben Antimycin A enjeksiyonu, Kompleks III inhibitörü, / TMPD Askorbat yana Kompleks IV ile tahrik edilen solunum değerlendirilmesine olanak tanır / TMPD is anSitokrom C / Kompleks IV elektron verici. Bağlama verimliliği hiçbir bilgi elde edilirken, yöntem bağımsız birden fazla alt tabakaları çalışan engel çok küçük örneklem büyüklüğü için idealdir. Son olarak, palmitoil karnitin / malat kullanılması β-oksidasyon ve palmitik asit (β-oksidasyon) oksidasyonu sonucunda ortaya çıkan indirgeme eşdeğer beri ETC arasındaki koordinasyon değerlendirilmesi için izin verir flavoprotein 15 aktarma elektron yoluyla ETC besleyen. Bu bağlama ve elektron akış deneyleri, aynı zamanda, bazı müdahale nedeniyle (ilaç tedavisi, genetik manipülasyon) mitokondriyal fonksiyon değişiklikleri tespit etmek üzere birbiri ardında olarak kullanılabileceği unutulmamalıdır. Bu tahliller için elde yüksek hassasiyetli protein tayini, ya da alt-tabaka çözeltiler ile önceden olup, mitokondri iyice karışması yatmaktadır. Bu doğrultuda, mitokondri kez substrat solutio içinde resuspendend edilirns, bu genişletilmiş bir menfez pipet ile Aşama 2.2 de tarif edildiği gibi hücre kültür plakası yüklemeden önce iyice Bu çözelti karıştırmak için kritik öneme sahiptir. Mitokondri karıştırmak için Başarısızlık iyice tahlil içinde büyük değişime yol açacaktır. Buna ek olarak, mitokondri karıştırma ve süre kesme kuvvetleri yaratacak dar delikli bir pipet kullanarak yapışma adım (2.7) de bu protokolü önemli bir adımdır mitokondriyal membranlar ve Sitokrom C salınımını zarar potansiyelini artırır. Uzun / yeterince hızlı yüklenen hücre kültürü plakasını dönmeye Başarısızlık böylece kuyu ve ölçümler arasında artan değişkenliği lider, kuyuya mitokondri eksik bağlılık neden olacaktır. Hisse senedi ve yüzey çözümleri yapmak için doğru konsantrasyonları / hazırlama yöntemleri kullanılarak, başına iyi mitokondriyal protein optimum miktarda yükleme tahlil çalıştırmak değiştirerek mitokondriyal devlet pla sağlamak için: açıklanan protokol içerecek şekilde optimize edilmiştirteaus ve mitokondriyal stok ve mitokondriyal / substrat karışımları uygun karıştırma. Bu optimizasyon çalışmalarından önce, yazarlar tahlil vadede tuzaklar karşılaştı. Aşağıdaki sorun giderme yöntemlerini / bu protokolü optimize yararlı değişiklikleri tartışıyor. Microchamber içindeki oksijeni dışarı atmasını sağlar ve ölçümde yol açacaktır çok mitokondri yüklenirken optimal yüklenmesi ile ilgili olarak, yükleme çok az mitokondri, güçlü bir yanıt ortaya çıkarmak olmaz. Rogers ve diğerleri 9 mikroplaka göre respirometrik deneyleri için oyuk başına mitokondri optimal yükleme miktarını belirlemek örnekleri sağlar. Daha sık, çok fazla mitokondri başına yüklenen sıra devlet tarafından kanıtlanan 2 oranlarını 100-200 pmol / dakika boyunca / kuyu ve devlet 3 oranlar&gt; 1500 pmol / dak / kuyu olduğunu. (. - 10 ug, örneğin 1 arasında) dinamik r içindeki OCRs ortaya çıkarmak için üzerinde yükleme oluşursa, mitokondriyal protein konsantrasyonu değişen bir deneyi gerçekleştirmekoksijen tüketimi ölçüm makinesinin ange. Hazırlanması ve yüzeylerde ve stokların doğru konsantrasyonları kullanılarak büyük önem taşımaktadır. Her alt-tabakalar / enjeksiyon asit formunun kullanımı ve potasyum hidroksit ya da HCI ile pH ayarlamak; Sodyum tamponları / çözüm tavsiye edilmez. Buna ek olarak, resuspending yüzeyler / DMSO veya% 100 etanol içinde stokları ölçüm hatası veya hata neden olur. Not nerede% 95 etanol kullandığınızdan emin olun. Bu palmitoil karnitin ve böylece büyük bir değişkenlik neden dondurulmuş stok çözündürüldükten sonra% 95 etanol içinde çökelmeye yaygındır. Kullanmak için iyi önce palmitoil karnitin stok ve girdap ısınmak emin olun. Buna ek olarak, bir çok değişken piruvat / malat tahlil sonucu nedeniyle 2 hafta eski piruvat stok varlığa&gt; olabilir. Pirüvat dondurulmuş alikotları 2 haftada yeniden emin olun. Tahlil çalıştırmak mitokondriyal devlet yaylaları sağlamak için 2-min ölçümlerine güncellenmiştir. ADP tüketilmesi gözlem isteniyorsa, araştırmacı olabilir&quot;Deney Sihirbazı&quot; forumun altında &quot;Protokol&quot; sekmesi altında ölçüm süresini uzatmak. Son olarak, büyük değişkenlik mitokondriyal hisse senedi ve mitokondrinin artı alt tabakanın çözümleri yükleme tam öncesinde homojenize değildir oluşur. Kuyular arasındaki değişkenlik tahlil çalıştırdıktan sonra yüksek ise, tam öncesinde bir sonraki deneyde substrat çözüm karıştırmak emin olun. Asla mitokondri / substrat çözümleri vorteks yerine, püre karıştırın ve nazikçe genişletilmiş menfez pipet ile çiğnemek. Fazlalaştı olan bu tekniğin bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, bu deneyler için kullanılan hücre kültürü levha üzerindeki kuyu sayısı nispeten düşüktür (yani., 24 kuyu ve boş kuyu için belirlenmiş en az 2). Bu bir plaka üzerinde, bu tahlillerde tüm 5 gerçekleştirmek için arzu edildiği takdirde, araştırmacı bir seferde sadece bir fare yanıtları incelemek edebilmektedir. Bununla birlikte, 96 gözlü araçlar highe için uygun olduğuna dikkat edilmelidirr çıktı. İkincisi, bozulmamış hücrelere 1 ile karşılaştırıldığında izole mitokondri mitokondriyal disfonksiyon değerlendirilmesi doğasında güçlü ve zayıf yönleri vardır. Bazı zayıflıklar bozulmamış hücreler ve izolasyon süreci uyaran eserler ile karşılaştırıldığında daha az fizyolojik alaka sahip bulunmaktadır. Son olarak, bu yöntemin başarısı mitokondriyal izolasyon sürecinin kalitesi bağlıdır. Bu deneylerin bir kısmını ya da farklı sistemlerde geliştirilmiştir ve diğer hayvan modellerinde doğrulanmıştır olmasına rağmen, burada sunulan metotlar, bir çok-çukurlu oksijen tüketimi ölçüm makinesi kullanılarak farede en iyi kullanım için yukarıda bahsedilen deneylerde tüm sentez ilk sırada iskelet kas. Böylece çok az malzeme ile yüksek verim sağlayan bir fare iskelet kasının 100 mg - Daha da önemlisi, bu tahlillerin tümüne 5 ~ 75 izole mitokondri miktarı ile gerçekleştirilebilir. Büyük öneme, çok çukurlu yeteneği arasındaoksijen tüketimi teknolojileri optimize edilmiş bir izolasyon yönteminin ile birleştirilmiş mitokondri minimal miktarlarda ile analizi gerçekleştirmek için, bir araştırmacı, iskelet kas dokusunda geri kalan diğer deneyler (örneğin., Western lekeleme çok sayıda gerçekleştirmek için olanak sağlar, RT-PCR, enzimatik deneyler, sık sık bu hayvan modeli ile bir mücadele vb). Sonuç olarak, burada sunulan yöntemler fare iskelet kası minimal miktarlarda kullanılarak mikroplaka bazlı Respirometrik tahlillerin bir koleksiyon performansı için adım adım yönergeler sağlar. Önemli olarak, sunulan yöntemler doku ve mitokondri az miktarlarda gerektirir. Hakim sonra, burada tarif edilen teknikler araştırmacılar sıklıkla kullanılan bir hayvan modeli mitokondriyal oksijen tüketimi bir bileşik ya da bir gen ürünün muhtemelen mekanizmasını belirlemek için izin verir.

İskelet kası mitokondri ana fizyolojik rolü oksidatif fosforilasyon 1 ATP üretmektir. Önemlisi, iskelet kası mitokondrinin 3, dejeneratif hastalıkları 4 ve Tip II diyabet 5 yaşlanma, egzersiz kapasitesi 2 belirli bir rol oynamaktadır. Yaşlanan bir toplum ve Tip II Diyabet ABD&#39;de 6 ölüm 7. önde gelen nedeni olarak, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek yöntemlere ihtiyaç biyomedikal araştırma 7,8 giderek daha yaygın hale gelmiştir. Oksidatif fosforilasyon 9 fonksiyonel bileşenlerini ifade mitokondriyal ve nükleer genom koordineli fonksiyonunu temsil beri Özellikle, oksijen tüketiminin ölçülmesi mitokondriyal fonksiyon değerlendirilmesinde olağanüstü yarar vardır. Çeşitli teknolojiler bu sağlam hücrelerde oksijen tüketiminin ölçümü sağlar ve izole bulunmamaktad mitokondri 7-10. Buna ek olarak, deneyler, birden fazla hücre tipi ve dokusunda için geliştirilen ve mitokondriyal yolları ve solunum kontrolü 9,11,12 ölçümüne imkan veren türün çeşitli edilmiştir. Bununla birlikte, mikro-tabanlı oksijen tüketimi teknolojileri kullanım için fare iskelet kasından izole mitokondri kullanarak bu tahlillerin tümüne derlenmesine açısından literatürde void vardır. Önemlisi, mikroplate bazlı Respirometrik tahlillerin kullanılması mitokondriyal biyologlar arasında büyüyen ve izole mitokondri 9 minimal miktarlarda kullanılarak yüksek verimli ölçümler için izin verir. Bu nedenle, mikroplate bazlı Respirometrik tahliller bir koleksiyon anormallikleri ve / veya uyarlamalar elektron taşıma zinciri (ETC) meydana olabilir nerede saptayarak izin veren geliştirilmiştir. Buna ek olarak, iki ilave mikroplaka göre respirometrik deneyler koordinasyon değerlendirme betwee etkinleştirmek geliştirilmiştirtrikarboksilik asit (TCA) döngüsü ve OGS ve ß-oksidasyon ve VB ile n Önemlisi, sunulan yöntemlerin yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelinde mitokondriyal fonksiyon mekanik değişiklikleri ölçmek için bir açık ve özlü bir yol sağlar.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63559</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>HEPES minimum 99.5% titration</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Essentially Fatty&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Acid Free- BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic Acid, 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107360</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Succinic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9512</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>L(-) Malic Acid, BioXtra, &amp;ge;95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6413</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>L-Glutamic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7394</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>99%, powder [TMPD]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Palmitoyl L-carnitine chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1645</td><td>Store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Oligomycin A, &amp;ge; 95% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td>Store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>Store at 2 - 8 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>phenylhydrazone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;ge;98% (TLC), powder [FCCP]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A from streptomyces sp.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8674</td><td>Store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5285</td><td>Store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; BCA Protein Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

Şekil 1 piruvat / malat, süksinat / rotenone, palmitoil karnitin / malat ve glutamat / malat deneyler (Kavrama Tahliller) için oksijen tüketimi oranlarını (OCR) temsil eder. Bu tahlil iz, Oksijen Tüketimi Oranı veya OCR, vs zaman olarak gösterilir arka correceted edilir ve noktadan noktaya oranları olarak görüntülenir. Her panel Şans ve Williams 14 tarafından açıklandığı gibi farklı mitokondriyal devletlerde oksijen tüketimini gösterir. Birinci panel, ADP enjeksiyonundan sonra bazal oksijen tüketimi ya da State 2. ikinci panel, temsil eden oligomycin enjeksiyonu (Karmaşık V inhibitörü) sonra, maksimal birleştiğinde solunum ya da State 3. Üçüncü paneli temsil nedeniyle solunum temsil proton sızıntısı, ya da Devlet 4o için. Dördüncü panel FCCP enjeksiyonundan sonra, maksimum Kuplajsız solunum veya Devlet 3U temsil eder. Son olarak, beşinci paneli Antimycin A enjeksiyonundan sonra, oksidatif solunumun engellenmesini gösterir. Özellikle, arkl mitokondriyal devletler minimal standart sapma var. Bu mitokondriyal stok ve mitokondri / substrat karışımları ve bağlılık dönüş (Adım 2.6) sonra mitokondri tek tek tabaka ulaşma kapsamlı karıştırma kaynaklanmaktadır. Öte yandan, her bir göze olup mikrolevhanın oyuk mitokondri tek tek tabaka elde eşit olmayan mitokondri yükleme Şekil 2 &#39;de gösterildiği gibi, her bir durumda, standart sapma sebep olur. Her mitokondriyal devlet ve her alt tabaka için Şekil 1 ekran yaylalarda iz. İki ölçüm döngüsünden sonra elde plato iyi mitokondriyal kalitesini göstermektedir ve mitokondri tahlil süresince de uyulması kalması. Bu sayede oluşabilecek önyargı azaltarak, araştırmacı bu mitokondriyal devletlerin ortalama OCR almasına izin veriyor çünkü ek olarak, plato maksimal oranları ulaşılması daha arzu edilebilirkeyfi bir noktaya seçerek. Oyuk başına mitokondri miktarı optimizasyonu çalışmalarla belirlenmiştir. Oyuk başına mitokondri optimum miktar, State sonuçlanmalıdır 100-200 pmol / dak / oyuk ve devlet 3 oranları &lt;2 ila oranları 1500 pmol / dak / oyuk, bu değerler, çok oyuklu oksijen dinamik oksijen algılama aralıkta olması nedeniyle tüketim ölçüm makinesi. Kuyu başına çok mitokondriyal protein yüklenmesi. Enstrüman (Şekil 3A) dinamik aralığın dışında OCRs neden (3 kuyu başına mitokondriyal protein yüklenmesi 2.5 ug göre kuyu başına mitokondriyal protein (mavi izleme) ve 3.5 ug yükleniyor tasvir kırmızı Şekil olabilir süksinat / rotenone tahlil için) izleme. Kuyu başına çok mitokondriyal protein yüklenmesi de böylece birbirini izleyen ölçümü 9 (Şekil 3B &lt;OCR doğru ölçümü engelleyen, kuyunun microchamber içinde oksijenin tükenmesi yol açabilir/ strong&gt;). Noktadan noktaya OCR OCR değişim anlık oranıdır. Düz ise, OCR / sabit kararlı olduğunu, ancak azalan, sonra bir biyolojik veya teknik bir sorun olabilir. Devlet 3 Devlet 3u solunum (Şekil 3A) OCR dik düşüş ölçümü (Şekil 3B) sonundan önce oksijen kaynağı yorucu mitokondri neden olur. Şekil 4, elektron akışı analizi için zamana karşı OCR temsil eder. Şekil 1 için tarif edildiği gibi izleme giderilmiştir ve görüntülenir. Bu deneyde ilk panel ikinci panel, rotenone enjeksiyonundan sonra, kompleks I aracılı solunum inhibisyonu Kompleks I ile piruvat / malat Devlet 3u solunum temsil eder. Üçüncü paneli, süksinat enjeksiyonundan sonra, elektronlar Kompleks II&#39;nin (Site II aracılı solunum) de ETC girerek substrat uyarılan Devlet 3U temsil eder. Antim enjeksiyonundan sonra dördüncü panelgentamisin A, Kompleksi III ve böylece toplam solunum inhibisyonu temsil eder. Son olarak, beşinci paneli, askorbat / TMPD enjeksiyonundan sonra, Kompleks IV aracılı solunum temsil eder. Şekil 1&#39;de traselerine benzer tüm mitokondriyal devletler minimal standart sapma var ve her oran bir plato ulaşmıştır neredeyse vardır ya. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig1.jpg" /> Şekil 1. Birleştirme Deneyleri (A). 10 mM piruvat / 5 mM malat, (B), 10 mM süksinat / 2 uM rotenon, (C) 40 uM palmitoil karnitin / 1 mM malat ve (D) 10 mM glutamat / 10 mM oksijen tüketimi, çok oyuklu ölçümü ile tespit edildiği üzere, malat mitokondriyal solunum deney trase bağlanmış. Değerler ortalama ± SD olarak ifade edilir. Kuyu başına yüklenen Mitokondriyal protein süksinat / rot dışındaki tüm analizleri için 3.5 ug oldumitokondriyal protein 2.5 ug göz başına kullanan enon. Veriler, n = 3 eşleştirilmiş biyolojik çoğaltır temsil eder. OCR = Oksijen Tüketim Hızı; ADP = Adenozin difosfat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Karbonil siyanür 4 - (triflüorometoksi) fenilhidrazon; Anti-A = Antimycin A; PYR = Piruvat; SUCC = Süksinat; ROT = Rotenone; PAL-C palmitoil karnitin =; GLUT = glutamat. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53216/53216fig1large.png" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53216/53216fig2.jpg" /> Şekil 2. Yüksek derecede Değişken Piruvat / Malat Deneyi. Eksik ve böylece değişken mitokondriyal pro yol alt tabaka / MAS karışımı mitokondriyal stoktan mitokondri karıştırma kaynaklanan yüksek değişken 10 mM piruvat / 5 mM malat tahlilHer oyuktaki tein yükleme. Oyuk başına yüklü Mitokondrial proteini 3,5 ug idi. Veriler, n = 3 eşleştirilmiş biyolojik çoğaltır temsil eder. OCR = Oksijen Tüketim Hızı; ADP = Adenozin difosfat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Karbonil siyanür 4 - (triflüorometoksi) fenilhidrazon; Anti-A = Antimycin A; PYR = Piruvat. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53216/53216fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53216/53216fig3.jpg" /> Sukinat / Rotenone Testi için Şekil 3. Aşırı Mitokondriyal Protein. (A) kuyu başına mitokondriyal protein (mavi izleme) ve 3.5 ug yükleyerek neden çok iyi oksijen tüketimi ölçüm makinesinin dinamik aralığının dışında Oksijen tüketimi oranları kuyuda (kırmızı izleme) başına mitokondriyal protein yüklenmesi 2.5 ug göre. (B ) Oxyaklaşan gerginlik yGen sıfır ADP ve kuyu başına mitokondriyal protein optimal miktarda (2.5 ug) (kırmızı izleme) yüklenmesi ile karşılaştırıldığında iyi (mavi tracing) başına aşırı mitokondriyal protein (3.5 ug) yükleyerek neden FCCP enjeksiyonlar takip. Veriler mitokondriyal protein miktarı başına n = 3 eşleştirilmiş biyolojik çoğaltır temsil eder. OCR = Oksijen Tüketim Hızı; ADP = Adenozin difosfat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Karbonil siyanür 4 - (triflüorometoksi) fenilhidrazon; Anti-A = Antimycin A; SUCC = Süksinat; ROT = Rotenone; O 2 = oksijen; cıva mm Hg = milimetre. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53216/53216fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53216/53216fig4.jpg" /> Şekil 4. Elektron Akış Testi. 5 mM piruvat / 1 mM malat + 4 iM FCCP, elektron foksijen tüketimi, çok oyuklu ölçülmesi ile belirlendiği üzere, düşük mitokondriyal solunum deneyi takip. Değerler ortalama ± SD olarak ifade edilir. Oyuk başına yüklü Mitokondrial proteini 3,5 ug idi. Veriler, n = 3 eşleştirilmiş biyolojik çoğaltır temsil eder. OCR = Oksijen Tüketim Hızı; Anti-A = Antimycin A; Artan = Askorbat; TMPD = N, N, N &#39;, N&#39; tetrametilsiklopentadienil p -fenilendiamin. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53216/53216fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0"><tbody><tr><td> Ayıraç </td><td> Hazır Konsantrasyon </td><td> MW </td><td> Nihai Cilt </td><td> Kitle Eklendi </td><td> Yorumlar / Açıklama </td></tr><tr><td></td><td> (M) </td><td> (g / mol) </td><td> (mi) </strong&gt; </td><td> (g veya ml) </td><td></td></tr><tr><td> EGTA, pH 7.2 </td><td> 0.1 </td><td> 380,35 </td><td> 1 M Tris baz, 100 mi </td><td> 3,801 g </td><td> Mağaza 4 ° C &#39;de </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 </td><td> 238,3 </td><td> Dihidro 2 O 250 mi </td><td> 59. 57 g </td><td> Mağaza 4 ° C &#39;de </td></tr><tr><td> MgCl2, heksahidrat </td><td> 1 </td><td> 203,31 </td><td> Dihidro 2 O 250 mi </td><td> 50,82 gr </td><td> Mağaza 4 ° C &#39;de </td></tr><tr><td> Piruvat pH 7.4 </td><td> 0.1 </td><td> 88,06 (14,11 M solüsyon olarak gelir) </td><td> Dihidro 2 O 40 mi </td><td> Piruvik asit 0,283 mi </td><td> -20 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik numuneler hazırlayın ve mağaza sağlayın her iki haftada bir taze yapmak </td></tr><tr><td> Süksinat pH 7.4 </td><td> 0.5 </td><td> 118,09 </td><td> Dihidro 2 O 100 mi </td><td> Su 9.4 gccinic asit </td><td> -20 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik numuneler hazırlayın ve mağaza sağlayın </td></tr><tr><td> Malat, pH 7.4 </td><td> 0.5 </td><td> 134,09 </td><td> % 95 Etanol 100 ml </td><td> Malik asit 6.7 g </td><td> -20 ° C&#39;de 200 ul alikotları ve mağaza olun </td></tr><tr><td> TMPD </td><td> 0.01 </td><td> 164,25 </td><td> 10 mi </td><td> 0,0164 g </td><td> -20 ° C&#39;de 300 ul alikotları ve mağaza olun; Indirgenmiş TMPD tutmak için askorbat bir eş-molar miktarıyla karıştırılır </td></tr><tr><td> Palmitoil L-karnitin klorit </td><td> 0.01 </td><td> 436,07 </td><td> % 95 Etanol ve 1.14 mi </td><td> 0.005 g </td><td> -20 ° C&#39;de 40 ul alikotları ve mağaza sağlayın </td></tr><tr><td> Oligomycin A </td><td> 0.006 </td><td> 791,06 </td><td> % 95 Etanol 0.987 ml </td><td> 0.005 g </td><td> -20 ° C&#39;de 20 ul alikotları ve mağaza sağlayın </td></tr&gt; <tr><td> FCCP </td><td> 0.01 </td><td> 254,17 </td><td> % 95 Etanol ve 3,9 mi </td><td> 0,01 g </td><td> -20 ° C&#39;de 40 ul alikotları ve mağaza sağlayın </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 0.001 </td><td> 394,4 </td><td> % 95 Etanol ve 10 ml </td><td> 0.0039 g </td><td> -20 ° C&#39;de de </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> 0.005 </td><td> 548,63 </td><td> % 95 Etanol ve 9.12 mi </td><td> 0.025 g </td><td> -20 ° C&#39;de de </td></tr><tr><td> K + ADP </td><td> 0.5 </td><td> 501,32 </td><td> MHP 2 O 3.9 ml </td><td> 1.0 g </td><td> -20 ° C&#39;de de </td></tr><tr><td> Malik asit, pH 7.4 </td><td> 0.5 </td><td> 134,09 </td><td> 40 mi </td><td> 2.68 g </td><td> -20 ° C&#39;de 200 ul alikotları ve mağaza olun </td></tr></tbody></table><strong&gt; Tablo 1. Stok Çözümleri <table border="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Ayıraç </td><td> Hazır Konsantrasyon </td><td> Kitle Eklendi </td><td rowspan="2"> Final Molarite / Yüzde </td></tr><tr><td> (M) </td><td> (g veya ml) </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> - </td><td> 11,98 g </td><td> 70 mM </td></tr><tr><td> Mannitol </td><td> - </td><td> 20.04 gr </td><td> 220 mM </td></tr><tr><td> Potasyum fosfat monobazik </td><td> - </td><td> 0.34 g </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MgCl2, heksahidrat </td><td> 1 </td><td> 2,5 mi </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 </td><td> 1,0 mi </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.1 </td><td> 5,0 mi </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Esas yağlı asit, SERBEST BSA </td><td> - </td><td> 1.0 g </td><td> % 0.20 </td></tr></tbody></table> . Tablo 2. MAS Mix pH 7.4, 500 ml: Kısım 25 ml ve mağaza -20 ºC * Not at: tahlil enjeksiyonlar için kullanılan MAS karışımı için BSA hariç. <table border="0"><tbody><tr><td> Yüzey Orta </td><td> Nihai Konsantrasyon </td><td> Stokta miktarı (ul) </td><td> MAS * Miktarı (ml) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Piruvat / Malat </td><td rowspan="2"> 10 mM / 5 mM </td><td> Piruvat: 1000 </td><td rowspan="2"> 9 </td></tr><tr><td> Malat: 100 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Succicinate / Rotenone </td><td rowspan="2"> 10 mM / 2 mcM </td><td> Süksinat: 200 </td><td rowspan="2"> 10 </td></tr><tr><td> Rotenone 20 </td></tr><tr><td rowspan="3"> * Piruvat / malat + FCCP </td><td rowspan="3"> 5 mM / 1 mM / 4 uM </td><td> Piruvat: 500 </td><td rowspan="3"> 10 </td></tr><tr><td> FCCP: 4 </td></tr><tr><td> Malat: 20 </td></tr><tr><td> Palmitoil L-karnitin / Malat </td><td> 40 uM / 1 mM </td><td> Palmitoylcarnitine: 40 malat: 20 </td><td> 10 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Glutamat / Malat </td><td rowspan="2"> 10 mM / 10 mM </td><td> Glutamat: 400 </td><td rowspan="2"> 10 </td></tr><tr><td> Malat: 200 </td></tr></tbody></table> Tablo 3. Yüzey Çözümleri pH 7.4: Deney gün taze olun. * Elektron akış deneyi çözeltisi. <table border="0"><tbody><tr><td> Enjeksiyon Orta </td><td> Konsantrasyon </td><td> Stokta miktarı (ul) </td> &lt;td&gt; MAS Miktarı (ml) </td><td> Tutar Kartuş enjekte </td><td> Nihai Konsantrasyon </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> (İkinci levha enjekte) </td></tr><tr><td> ADP </td><td> 50 mM </td><td> 300 ul </td><td> 3 </td><td> 50 ul </td><td> 5,0 mM </td></tr><tr><td> Oligomycin A </td><td> 20 uM </td><td> 10 ul </td><td> 3 </td><td> 55 ul </td><td> 2,0 uM </td></tr><tr><td> FCCP </td><td> 40 uM </td><td> 12 ul </td><td> 3 </td><td> 60 ul </td><td> 4,0 uM </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> 40 uM </td><td> 24 ul </td><td> 3 </td><td> 65 ul </td><td> 4,0 uM </td></tr></tbody></table> TCoupled Tahliller için mümkün 4. Enjeksiyonlar pH 7.4. Deney gün taze olun. * Birleştirme tahlilleri bulunmaktadır (bunlarla sınırlı değildir), piruvat / malat, süksinat / rotenon, palmitoil karnitin / malat ve glutamat / malat. <table border="0"><tbody><tr><td> Enjeksiyon Orta </td><td> Konsantrasyon </td><td> Stokta miktarı (g veya ul) </td><td> MAS Miktarı (ml) </td><td> Tutar Kartuş enjekte </td><td> (İkinci levha enjekte) nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 20 uM </td><td> 60 ul </td><td> 3 </td><td> 50 ul </td><td> 2,0 uM </td></tr><tr><td> Sukinat </td><td> 50 mM </td><td> 300 ul </td><td> 3 </td><td> 55 ul </td><td> 5,0 mM </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> 40 uM </td><td> 24 μl </td><td> 3 </td><td> 60 ul </td><td> 4,0 uM </td></tr><tr><td> TMPD / Ascorabte </td><td> 1 mM, 100 mM </td><td> TMPD: 300 ul </td><td> 3 </td><td> 65 ul </td><td> 100 uM, 10 mM </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Askorbat: 0,059 g </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Elektron Akış Testi için Tablo 5. Enjeksiyonlar pH 7.4. Deney gün taze olun <table border="0"><tbody><tr><td> Komut </td><td> Süre (dk) </td><td> Döngü içinde </td></tr><tr><td> Kalibre </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bekleyin </td><td> 10 dakika (plaka uyumu aşamasından ısınmasını sağlamak için) </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1 dakika </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Beniaşure </td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td> A enjekte </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1 dakika </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td> B enjekte </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1 dakika </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td> C enjekte </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1 dakika </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td> D enjekte </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1 dakika </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 2 dakika </td></tr></tbody></table> Tablo 6. Enstrüman çalıştırın Protokolü.

Watch this Scientific Journal Video about Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements at JoVE.com

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

using-isolated-mitochondria-from-minimal-quantities-mouse-skeletal

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.6K Görüntüleme.  Virginia Tech. The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Video: Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Cardiotoxin Enjeksiyonu ile Akut İskelet Kası Regeneration indüksiyon

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Yetişkin ve Yaşlı İnsanların İskelet Kası miyojenik Öncü Hücreler / İlköğretim miyoblastların hazırlanması ve Kültür

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Tıp

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Biyoloji

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Kas Liflerinde Mitokondriyal Solunumun Gerçek Zamanlı Miktar Tayini

Measurement of Mitochondrial Respiration in Human and Mouse Skeletal Muscle Fibers by High-Resolution Respirometry

Mitochondrial function, a cornerstone of cellular energy production, is critical for maintaining metabolic homeostasis. Its dysfunction in skeletal muscle is linked to prevalent metabolic disorders (e.g., diabetes and obesity), muscular dystrophies, and sarcopenia. While there are many techniques to evaluate mitochondrial content and morphology, the hallmark method to assess mitochondrial function is the measurement of mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) by respirometry. Quantification of mitochondrial OXPHOS provides insight into the efficiency of mitochondrial oxidative energy production and cellular bioenergetics. A high-resolution respirometer provides highly sensitive, robust measurements of mitochondrial OXPHOS in permeabilized muscle fibers by measuring real-time changes in mitochondrial oxygen consumption rate. The use of permeabilized muscle fibers, as opposed to isolated mitochondria, preserves mitochondrial networks, maintains mitochondrial membrane integrity, and ultimately allows for more physiologically relevant measurements. This system also allows for the measurement of fuel preference and metabolic flexibility - dynamic aspects of muscle energy metabolism. Here, we provide a comprehensive guide for mitochondrial OXPHOS measurements in human and mouse skeletal muscle fibers using a high-resolution respirometer. Skeletal muscle groups are composed of different fiber types that vary in their mitochondrial fuel preference and bioenergetics. Using a high-resolution respirometer, we describe methods for evaluating both aerobic glycolytic and fatty acid substrates to assess fuel preference and metabolic flexibility in a fiber-type-dependent manner. The protocol is versatile and applicable to both human and rodent muscle fibers. The goal is to enhance the reproducibility and accuracy of mitochondrial function assessments, which will improve our understanding of an organelle important to muscle health.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Metabolik Hastalıklarda Mitokondriyal Fonksiyonun ve Hücresel Metabolik Adaptasyonun Ortaya Çıkarılması

Here, we describe a comprehensive method for measuring mitochondrial oxidative phosphorylation in fresh permeabilized skeletal muscle fibers from either human or mouse muscle. This method allows for the real-time quantification of mitochondrial respiration and the assessment of fuel preference and metabolic flexibility while preserving existing mitochondrial networks and membrane integrity.

İnsan ve Fare İskelet Kası Liflerinde Mitokondriyal Solunumun Yüksek Çözünürlüklü Respirometri ile Ölçülmesi

Mitochondrial function, a cornerstone of cellular energy production, is critical for maintaining metabolic homeostasis. Its dysfunction in skeletal muscle ...