Name: qpcrtag analysis - a high throughput, real time pcr assay for sc2.0 genotyping
Uploaded: 2015-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping at JoVE.com

Bu çalışma kısmen desteklenen Ulusal Bilim Vakfı Hibe MCB-0718846 ve (JDB kadar) Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı Sözleşme N66001-12-C-4020. LAM Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi doktora sonrası bursu tarafından finanse edildi. Bu yazının yayınlanması Roche tarafından desteklenmektedir.

1. (gDNA) Maya genomik DNA hazırlamak <ol><li> 50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl,% 1 SDS içeren maya Liziz Tamponu 9 bir stok hazırlanması (a / h),% 2 Triton X-100 (v / v), 1 mM EDTA, pH 8.0. </li><li> Tipik BY4741 10 arka plan laboratuar suşları için doymuş kültür 100 ~ için ul karşılık malzeme kullanımı ~ 2 x 10 6 hücre, başlangıç ​​olarak. Kültürlenmiş hücreler, bir 1.5 ml mikrofüj tüpe, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüj ile toplanabilir. Süpernatant aspire. </li><li> Maya Liziz Tampon 200 ul ekleyin ve pipetleme hücre pelletini. </li><li> Asit tanelerin seviyesinin, hücre harç seviyesinin altında yaklaşık 1 mm olacak şekilde cam boncuklar yıkanmış ~ 300 ul ekle. </li><li> Bir çeker ocak içinde izoamil alkol, fenol / kloroform ve 200 ul / ekleme (25: 24: 1). Mikrofuge&#39;ye tüp kap ve bu çalkalama sırasında sızıntı neden olur hiçbir boncuk başlık ve tüp arasında sıkışmış sağlamak(Adım 1.6). Mix ve kapağının sızdırmaz olduğundan emin olmak için 3 kez ters çevirin. </li><li> Bu tür bir Eppendorf 5432 bir tezgah üstü mikser kullanılarak, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile boru çalkalayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 20,800 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Aktarım,% 100 etanol içinde 1 ml içeren yeni bir mikro santrifüj tüpüne sulu fazın 75 ul. Karıştırmak için 10 kez ters çevirin. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 20,800 x g&#39;de santrifüj ile DNA pelleti. </li><li> DNA pelet yerinden oynatmamaya olmadan süpernatant aspire. % 70 etanol içinde 500 ul ile pelet yıkayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 20,800 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> DNA pelet yerinden oynatmamaya ve genellikle yaklaşık 10 dk fazla etanol çekinceye kadar açık mikrofuge&#39;de kapağı ile pelet hava kurumasına olmadan süpernatant aspire. </li><li> 75 10 mM Tris, pH 7.4 ul ve karıştırmak için vorteks DNA pelletini. Belirsiz bir süre -20 ° C&#39;de örnek saklayın. Bir kullanılarak numunedeki DNA konsantrasyonu ölçümüRNA DNA ayıran qubit, gibi fluorimeter tezgah üzeri. GDNA son konsantrasyonu ~ 1-2 ng / ml olduğundan emin olun. </li><li> Karıştırmak için su ve vorteks ile genomik DNA 1:10 seyreltme hazırlayın. </li><li> Kısım nano ölçekli akustik bir sıvı dağıtıcı (aşama 3) ile uyumlu olan bir kaynak plakasının uygun kuyuya seyreltildi gDNA 30 ul. Bir Labcyte Echo 550 kullanıyorsanız, 384 polipropilen plaka (384PP plaka) kullanın. Not: uygun bir sızdırmaz zaman bu plaka, -20 ° C&#39;de, en az bir ay depolanabilir. </li></ol> 2. 1.536 multiwell plaka içine hazırlayın ve Dağıtım qPCR Master Mix <ol><li> Karıştırmak için 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp ve vorteks böyle LightCycler 1536 DNA Yeşil Master olarak QPCR ana karışımı 850 ul, hazırlayın. Herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için oda sıcaklığında 20.800 xg&#39;de 2 dakika süreyle QPCR ana karışımı santrifüjleyin. Tek 1536 çok oyuklu bir plaka için gerekli qPCR ana karışımı bileşenleri aşağıdaki gibidirs: <ol><li> Enzim usta karışımı (konsantre Yeşil Usta Tüp 1, 5x), SYBR 42.5 ul (20x konsantre Yeşil Usta Tüp 4) 170 ul ve su 637,5 ul birleştirin. </li></ol></li><li> Dağıtın iyi böyle Sanat Robbins Cobra gibi dökme sıvı dağıtıcı kullanılarak 1.536 multiwell plaka içine / 500 nl. (2.2.1-2.2.4 Cobra özellikle atıfta adımları Not.) <ol><li> Aşağıdaki ayarlarla bir dağıtım programı oluşturun: Sıvı sınıf, su; aspirat hacmi 800 ul; hacim, 500 nl dağıtmak; süresi, 20 saniye yıkayın. Dağıtım ayarlarında, dağıtım hızı 49.6 mm / sn olarak ayarlanır doğrulayın ofset dağıtım 0,25 mm ve aşırı aspire sıvı de geri kaynağına reçete edilecektir. </li><li> Mikrofuge&#39;de tüp kapağını keserek ya da sadece açık bırakın güverte pozisyonunda 1. bulunur mikrofuge&#39;de tüp tutucu, iyi A1 qPCR ana karışımı içeren mikrofuge&#39;ye tüp yerleştirin. Aspirat düzenleyerek A1 &#39;de aspire&#39; SetE ayarları. </li><li> Önce &#39;koşmak&#39; vurmak sonra adım 2.2.2 kurmak programın ilk de-seçilmesi aspire ve dağıtmak adımlarla QPCR ana karışımı dağıtım ve bir yıkama adımı gerçekleştirmek. Tamamlandığında, aspire yeniden seçin ve qPCR ana karışımı dağıtmak için tam programını çalıştırmadan önce adımları dağıtmak. Cobra Başbakan sisteme hizmet veren az 10 dakika ilk yıkama aşaması, boşta oturan olmuşsa, gereksizdir. </li><li> Her oyuğa QPCR ana karışımı dağıtmak için &#39;koşmak&#39; vur. </li></ol></li><li> Iyi 1536 multiwell plaka (düşük hızda PCR plaka eğiren kullanarak 30 sn) kısa santrifüj her altındaki qPCR ana karışımı toplayın. </li></ol> 3. Dağıtım Şablon DNA ve 1.536 multiwell plaka içine Astarlar <ol><li> Böyle Echo 550 gibi bir akustik sıvı transferi sistemi kullanılarak 1536 multiwell plaka istenen kuyulara seyreltilmiş gDNA 5 nl (adım 1.3) koyun. <ol><li> Ech İçin550 o Plaka Reformat yazılımı kullanmak veya alternatif transferi programlamak için özel bir Excel sağlar. Program fiziksel gDNA (adım 1.3) dağıtılan sahip iyi içine kaynak eşleşir gDNA için iyi seçilmiş bir kaynak olun. 384PP plaka sıvı yüzey aktif olmayan bir tampon olduğunu gösterir kaynak plaka tipi &#39;384PP_AQ_BP2&#39; seçin. </li></ol></li><li> Primerler, öne doğru önceden karıştırılmış ve bu Echo 550 gibi bir akustik sıvı transfer sistemi kullanılarak 1536 çukurlu plakanın arzu edilen kuyulara 50 uM, her biri bir nihai konsantrasyona kadar tersine 10 NL koyun. <ol><li> Sıvı transfer sistemi için, Plaka Reformat yazılımı kullanmak veya alternatif transferi programlamak için özel bir Excel sağlar. NOT: Burada o kolay yani 1,536 multiwell plaka üzerinde düzeni görsel gerçek zamanlı PCR sonuçları incelemek için primerlerin kromozomal sırasını örtüşmesi şeklindedir primerler dağıtmak mümkündürDaha sonra (adım 6). </li><li> Akustik bir sıvı dağıtıcısı ile uyumlu olan bir plaka primerleri karışımlar. Echo 550, bir Labcyte 384LDV (düşük ölü hacim) plaka kullanmak ve kaynak plaka tipi &#39;384LDV_AQ_B&#39; sıvı hiçbir proteinler ile basit bir tampon olduğunu göstermek için Yankı programlama seçin. </li></ol></li></ol> 4. Mühür ve Santrifüj 1536 multiwell plaka <ol><li> Böyle Plateloc Termal Mikroplaka Sealer olarak bir mikroplaka mühürleyen sistemi kullanarak, hemen ısı mühürleyen cihazı ile uyumlu optik net mühür kullanılarak 1.536 çukurlu plaka mühür. Bulaşmaya işaretleri önlemek için mühür yüzeyine dokunmayın. <ol><li> Plateloc Termal Mikroplaka Sealer kullanıyorsanız, aşağıdaki ayarları kullanın: süresi 2.0 sn, mühür sıcaklığı 162 ° C, hava basıncı 82 psi mühür. Bu cihaz ısınmaya ~ 5 dakika sürer ve böylece önceden açık olmalıdır. </li><li> Plateloc Termal Mikroplaka macunu kullanarak ise, adaptöR iyi bir sızdırmazlık sağlamak için bir araç aşamasında 1536 çukurlu plakanın yüksekliğini artırmak için kullanılmalıdır. NOT: Plateloc Termal Mikroplaka Sealer için Sahne Plate satın tercih olmakla birlikte, alternatif bir çözüm 1,536 multiwell plaka yüksekliğini artırmak için köşelere herhangi bir donanım mağazasında mevcut dört ~ 2 mm kalınlığında standart pulları eklemek etmektir. </li></ol></li><li> Hemen her bir altındaki tüm reaktifler toplamak için, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 2000 x g&#39;de sızdırmaz 1536 çukurlu plaka santrifüj. </li></ol> 5. Real Time PCR <ol><li> Program, bir erime eğrisi analizine, ardından iki adımlı bir büyütme protokolüne böyle LightCycler 1536 olarak 1536 qPCR aleti. Aşağıdaki gibi LightCycler 1.536 yazılım programı kurmak kullanma: <ol><li> Ön inkübasyon: 95 ° C, 1 dakika tutun, rampa oranı 4.8 ° C / sn, hiçbir kazanım. </li><li> İki Adım Büyütme: [95 ° C 30 döngü, hiçbir tutma,oranı 4.8 ° C / sn rampa, hiçbir kazanım; 64 ° C, 30 saniye tutun, rampa oranı 2.5 ° C / sn, tek edinme]. </li><li> Eritin eğrisi: 95 ° C, 10 sn, rampa oranı 4.8 ° C / sn, hiçbir kazanım; 60 ° C, 1 dakika, rampa oranı 2.5 ° C / sn, herhangi bir satın alma; 97 ° C, rampa oranı 0.1 ° C / sn, 5 satın almalar / (sürekli) ° C. </li><li> Serin: 40 ° C, 30 saniye, rampa oranı 2.5 ° C / sn, hiçbir kazanım. </li></ol></li><li> Run Tanımı sekmesinde &quot;Yeşil intercalating Boya &#39;olarak algılama biçimi ayarlayın. </li><li> Run Tanımı sekmesinde &#39;Master Control&#39; için pipetleme kontrolünü ayarlayın. Bu özellik, bir iç kontrol olarak hizmet eder ve varsayımsal yanlış negatifler tespit etmek yararlıdır 1536 çok oyuklu bir plaka, her çukuruna qPCR ana karışımı varlığını kontrol eder. </li><li> 1.536 QPCR aracı haline adımlarla 2-4 hazırlanan 1536 çukurlu plaka takın ve programı çalıştırın. </li></ol> 6. Veri Analizi <ol><li> PerfQPCR yazılım içinde verilerin görsel kontrol kapatýnýz. NOT: 1.536 yazılım hem amplifikasyon görüntülenmesini sağlayarak ve çağrısı (pozitif, negatif, geçersiz, N / A, Şekil 2) gösteren bir ısı haritası yanı sıra, eğriler eritin (pozitif ya da gri renk skalası sürgülü, geçiş noktası değeri Negatif için; Şekil 3), ya da bir bitiş noktası floresan (EPF) değeri () renk skalası kayar. </li><li> Ham verilerden veya cihazdan çevrimdışı işleme için hesaplanan verilerde biriyle 1,536 formda Yazılım bir .txt dosyası (sonuç tablosu) veya .xml dosyası İhracat verileri. NOT: Yüksek güven ile olumlu / olumsuz ve Cp değeri aramaları belirlerken 1.536 yazılımı yerleşik özel otomatik geçiş noktası (Cp) çağıran algoritması nispeten düşük düşük alt mikrolitre reaksiyon hacimlerinde dikkate şekil ve amplifikasyon eğrisinin eğimini alır floresan değerleri. </li><li> LightCycler DNA Yeşil Usta kullanımı iseqPCR d, tüm kuyuları &#39;master kontrol&#39; geçti doğrulayın. Bir fail de qPCR ana karışımı ve eksik veri noktası potansiyel bir yanlış negatif kabul edilmelidir almadı gösterir. Tüm kuyuları &#39;master kontrol&#39; geçti doğrulayın. Bir fail de DNA MasterMix almak ve eksik veri noktası potansiyel bir yanlış negatif dikkate almadı gösterir. </li></ol>

<ol>
	<li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome.">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li><li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design.">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li><li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization.">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li><li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit.">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li><li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-A-Gene+with+GeneDesign.">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li><li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes.">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li><li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome:+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast.">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li><li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li></ol>

LAM, NAP, REÇEL ve JDB ifşa hiçbir şey yok. RC ve AL, Roche Yaşam Bilimleri tarafından ABD istihdam ve prensip deney bir kanıtı parçası olarak LAM ile uygulama geliştirmeye çalışılır.

Önemli ölçüde daha yüksek verim sağlar gibi PCRTag genotiplemesi tahlil içine gerçek zamanlı PCR algılama Kuruluş Sc2.0 projesi için önemli bir gelişmedir. Bir önceki iş akışı 384 gözlü PCR plakaları, 1.5 saat termal döngü çalışma süresi, agaroz jel elektroforezi ve jel manuel açıklama 2.5 ul reaksiyonlar belirtilmiş. qPCRTag analizi olarak adlandırılan Burada sunulan iş akışı, birkaç büyük darboğazlar üstesinden gelir. İlk olarak, bir qPCRTag çalıştırmak yaklaşık bir saat içinde bitirmek (plaka kurmak artı çalışma süresi) başlar, işlenebilir tek bir deney haline 4 x 384 kuyucuğu yoğunlaşır. Bu qPCRTag analizi için kuyu başına reaktif maliyeti daha düşük verim agaroz jel bazlı yaklaşımla eşit olduğuna dikkat etmek önemlidir. Ancak, jel elektroforezi ve manuel şerhi engellemeyi, qPCRTag iş akışı önemli avantajları zaman ve emek önemli tasarruf, tanıyor. Önemlisi qPCRTag iş akışı tr olduğunuotomasyon ile uyumlu yollarla ortaya çıktığı tam. PCRTag tahlilinde çıktısı olarak gerçek zamanlı saptama kullanımı ile büyük bir endişe yanlış pozitif ve yanlış negatif oran. PCRTag primerler başlangıçta gerçek zamanlı PCR kullanılmak üzere tasarlanmamıştır olduğundan, tüm primer çiftleri, bu çıkışı ile kullanım için uygun olması beklenmektedir. Bu amaçla, ön gerçek zaman bazlı bir deneyde çalışmaz alt kümesini tutmak için tüm PCRTag primer çiftleri fonksiyonu ve özelliğini doğrulamak için önemlidir. Örneğin, kromozom 3 PCRTag yanlış pozitif ve negatif olan by-ve-large PCR verileri (Şekil 2 ve 3) gerçek zamanlı olarak tekrarlanabilir ve bu diğer analizler dışında olabilir. Dahası, başarısız olduğu bilinmektedir primer çiftleri (jel elektroforezi ile değerlendirildi ve Şekiller S6 ve ark. 1 Annaluru arasında S7 gösterilen) de dahil edilebilir. Bu kolayca etkili olmuştur basit yapılırding akustik transfer protokolü hatalı primer çiftleri kurarken. En yüksek kapasiteli deneyleri gibi, biz daha fazla aşağı doğrulama hak transformantların belirlemek için birincil ekran olarak gerçek zamanlı PCRTag algılama kullanmak niyetinde. Daha sonra, ikincil tarama için altın standart okuma olarak jel elektroforezi ile PCRTag analizi kalacaktır. Yüksek verimlilik, gerçek zamanlı PCR teknolojisi ile state-of-the-art nano sıvı taşıma sistemleri birleştirerek Sc2.0 için PCRTag analizi uygulaması, ötesinde hızlı ve otomatik analiz sağlar ve birçok alanda etkileme potansiyeline sahiptir. Örneğin, bu iş akışı yüksek kapasiteli kütüphane taraması, bulaşıcı hastalık tanısı, mikrobiyomları analizi ve üstün genom düzenleme uygulanan olabilir aynı anda birden fazla lokus değiştirmeye teşebbüs yaklaşımları.

Sc2.0 veya Sentetik Maya Genom Projesi ( <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.org</a> ), tasarımı ve tamamen sentetik ökaryotik genom inşa hedefini belirledi. Bir başlangıç ​​noktası olarak Saccharomyces cerevisiae 3 derece küratörlüğünü genom dizisi kullanarak, onaltı doğrusal kromozomların her biri, hücre zindeliği korumak genom istikrarı geliştirmek ve genetik esnekliğinin artırılması belirttiğiniz tasarım ilkeleri bir dizi karşılamak üzere yeniden tasarlandı. Örneğin, bu gibi tekrarlar olarak destabilize edici elemanlar Sc2.0 kromozom silinir. TAG durdurma kodonunun tüm örnekleri olmayan bir genetik olarak kodlanan amino asidin sokulması için son suşunda bir kodon &#39;serbest&#39; TAA yeniden kodlanır. Ayrıca Cre-lox sistemi tarafından etkin bir uyarılabilir evrim sistemi, Scramble, yeni yapılar 4 türev genomları üretmek için benzersiz kapasite sağlar. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Sc2.0 genomunda başka önemli tasarım öğesi, sentetik ve yabani tip DNA izlemeyi etkinleştirmek için DNA filigran olarak hizmet PCRTags, giriştir. PCRTags sentetik kromozom üzerinde ORF kısa, yeniden kodlanmış segmentler; PCRTag sekansları sentetik, vahşi tip kromozom arasında, DNA seviyesinde farklılık ise, kodlanan proteinlerin amino asit dizisi ve bu nedenle, muhtemelen, işlev olarak aynıdır. PCRTag sekansları, özellikle, seçici amplifikasyon (Şekil 1A) kolaylaştırmak için primer bağlanma bölgeleri olarak tasarlanmıştır. PCRTag tasarımı, tipik olarak 58 ° C ile 60 ° C arasında erime sıcaklıkları olan, doğal dizilerden (en az% 33) daha ~ 60% farklı olan sentetik sekanslar Recoded, sonuçta GeneDesign 5,6 &#39;en farklı&#39; algoritması kullanılarak gerçekleştirilmektedir amplikonu 200-500 baz çifti 2 arasında uzunlukları. Bu bölgeler bildiği gibi Recoding her ORF ilk 100 bp mesafede izin verilmezkodon kullanımının 7 bakımından özel tercihleri ​​vardır. Birlikte, bu tasarım kuralları, sentetik ve yabani tip PCRTag primer çiftleri sadece sentetik ve doğal DNA sırasıyla (Şekil 1B) bağlamak ve yükseltmek sayede PCR koşulları tek bir set altında hemen hemen tüm PCRTags yüksek performansını tercih. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> Şekil 1:. PCRTag şematik bir (A), PCRTags Sc2.0 genlerin kromozomlar üzerindeki açık okuma çerçeveleri (ORF) içindeki dizileri yeniden kodlanır. (B) Sentetik (sin) ve yabani tip (WT) PCRTag primerler özel olarak ise, bağlanma ve (gDNA), sentetik ve yabani tip genomik DNA&#39;yı büyütmek. Şablon olarak WT veya yarı synVIL2 gDNA kullanarak onüç PCRTag primer çiftleri test kromozomun altı sol kolunun bir ~ 30 kb segmentinde bir analizi, burada gösterilmektedir. Pek çok durumda, tek bir ORF birden fazla P kodlayanCRTag. PCRTag amplikonlarının varlığı / yokluğu agaroz jel elektroforez ile değerlendirilir. PCRTag amplikonlar 200 bp ila 500 bp uzunluğundadır. Panellerin alt kısmında hızlı göç türler astar dimerleri bulunmaktadır. PCRTag analizi Sc2.0 kromozomların mecliste önemli bir araç olduğunu kanıtlamıştır. 20-30 PCRTags kodlayan sentetik bir DNA Tipik bir deneyde, 30-50 kb, olarak, karşılık gelen vahşi tip DNA 1,2,8 yerine, maya hücreleri içine transforme edilir. PCRTag analizi daha sonra DNA bu segmenti kapsayan sentetik değil vahşi tip PCRTags kodlayan transformantların tanımlamak için kullanılan, ya da &#39;kazananlar&#39; olarak adlandırılan. Bu &#39;kazananları&#39; belirlemek, böylece throughput ve PCRTag analizi maliyeti önemli hususlar şunlardır birden fazla transformantların test genellikle gereklidir. Şu anda iki Sc2.0 kromozom Sc2.0 genomunun% 10&#39;dan az temsil (synIII 1 ve synIXR 2) tamamlanmış, although fazla kalan kromozomların yarısı halen sentezini ve montaj geçiyor. Bu proje için gerekli PCRTag analizi ölçeği, hızlı, sentetik DNA ve yabani tip DNA varlığı veya yokluğunun jeller manuel olarak çalıştırmak ve skor yeteneği aşmıştır. Biz agaroz jel elektroforezi kullanımını engelleyecek şekilde gerçek zamanlı PCR kullanarak bir iş akışı geliştirdik PCRTag tahlil verimini artırmak için. iş akışı 1536 çok oyuklu bir plaka, şablon DNA ve primerler aktarmak için bir nano ölçekli akustik bir sıvı dağıtıcı her oyuğuna qPCR MasterMix dağıtmak için bir sıvı kimyasal dağıtıcı kullanan ve 1536 qPCR termal döngü cihazı, bize 500 nl tepkileri küçültmek izin veren ve verimi en üst düzeye çıkarmak. Ayrıca analiz otomatik hale getirilebilir. Yüksek verimlilik Genotipleme protokolünün Bu tip çoklu loci birçok klonlarının analizi gerektiren herhangi bir proje için genellenebilir olması gerekir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Yeast gDNA prep</td></tr><tr><td>yeast gDNA</td><td>custom</td><td>custom</td><td>template for real time PCR</td></tr><tr><td>Acid-washed glass beads (0.5 mm)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>yeast cell lysis</td></tr><tr><td>Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>yeast cell lysis</td></tr><tr><td>5432 Mixer</td><td>Eppendorf</td><td>5432</td><td>yeast cell lysis</td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td>yeast cell lysis</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td>gDNA quantification</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>gDNA quantification</td></tr><tr><td>Labcyte 384PP plate</td><td>Labcyte</td><td>P-05525</td><td>gDNA source plate</td></tr><tr><td colspan="4">DNA Green Mastermix prep and dispensing</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 DNA Green</td><td>Roche</td><td>5573092001</td><td>real time PCR mastermix</td></tr><tr><td>1.5 ml Microfuge Tube Holder</td><td>ARI</td><td>EST BD060314-1</td><td>microfuge tube holder for deck of Cobra</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 Multiwell Plate</td><td>Roche</td><td>5358639001</td><td></td></tr><tr><td>Cobra liquid handling system</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>630-1000-10</td><td>dispense qPCR master mix into 1536 plate</td></tr><tr><td>PCR Plate Spinner</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>cenrifugation of 1536 plate</td></tr><tr><td colspan="4">Template and primer dispensing</td></tr><tr><td>PCRTag primers</td><td>IDT</td><td>custom</td><td>premixed forward and reverse, 50 &amp;mu;M each</td></tr><tr><td>TempPlate pierceable sealing foil, sterile</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0110</td><td>temporary seal for PCRTag primer plates</td></tr><tr><td>Labcyte LDV 384 well plate</td><td>Labcyte</td><td>LP-0200</td><td>pre-mixed primer source plate</td></tr><tr><td>Echo 550 Liquid Handler</td><td>Labcyte</td><td></td><td>transfer 2.5 nl drops of primer and template DNA into 1536 plate</td></tr><tr><td>Plateloc Thermal Microplate Sealer</td><td>Agilent</td><td>G5402-90001</td><td>heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run</td></tr><tr><td>Clear Permanent Seal</td><td>Agilent</td><td>24212-001</td><td>optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate</td></tr><tr><td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage</td><td>Agilent</td><td>G5402-20008</td><td>can substitute ~2 mm thick washers</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR</td><td>Thermo Scientfic</td><td>75-004-521</td><td>centrifuge heat sealed 1536 plate</td></tr><tr><td>Industrial Air Compressor</td><td>Jun Air</td><td>1795011</td><td>to run the Echo and Heat Sealer</td></tr><tr><td colspan="4">Real Time PCR</td></tr><tr><td>LightCycler 1536</td><td>Roche</td><td></td><td>requires 220 V outlet</td></tr></tbody></table>

qpcrtag analysis - a high throughput, real time pcr assay for sc2.0 genotyping

Sentetik Maya Genom Projesi (Sc2.0) 16 tasarımcı maya kromozom oluşturmak ve tek bir maya hücresi bunları birleştirmeyi amaçlamaktadır. Tek sentetik kromozomu, synIII 1, ve bir sentetik kromozom kolu, synIXR 2 Bugüne kadar inşa ve in vivo fonksiyon gelen vahşi tip kromozom yokluğunda onaylanmıştır. Sc2.0 kromozomların önemli tasarım özelliği kendi vahşi tip muadilleri sentetik kromozom farklılaşmasını sağlayan açık okuma çerçeveleri (ORF) kapsamında kısa, yeniden kodlanmış dizileri olan PCRTags, giriştir. PCRTag, sentetik ya da vahşi tip kromozom ve basit bir PCR tahlili kullanılarak test edilebilir DNA her tür varlığı / yokluğu birine seçici olarak yeniden birleşir primerleri. PCRTag tahlilin standart okuma agaroz jel elektroforezi ile amplikonların varlığını / yokluğunu değerlendirmektir. Ancak, 1.5 kb ve ag başına bir ortalama PCRTag amplikon yoğunluğu ile~ 12 Mb enome boyutu tamamlanmış Sc2.0 genomu yaklaşık 8.000 PCRTags kodlamak. Verimlilik artırmak için, biz qPCRTag analizi diyoruz PCRTag genotipleme için gerçek zamanlı PCR-tabanlı algılama tahlil geliştirdik. İş akışı bize tek bir deneyde, sentetik ve yabani tip primer çiftleri hem 768 PCRTags kadar test etmenize olanak sağlayarak, bir 1.536 multiwell plaka 500 nl reaksiyonları belirtir.

Biz dört farklı suşları çıkarılan maya genomik DNA (gDNA) sentetik ve yabani tip kromozom 3 PCRTag primer çiftleri 1 test ettik. Kromozom 3 kromozomun uzunluğu yayılan 186 PCRTag primer çiftleri (synIII olduğunu ~ 270 kb ve yabani tip kromozom 3&#39;tür ~ 315 kb) sahiptir. Her iki primer seti ile dört türünün her test etmek için, alt yarısı, her bir çeyrek daire üst yarısı ve vahşi tip sentetik PCRTag primerleri atama, dört çeyrek, gDNA her türü için içine oyuklu bir plaka ayrılmıştır. Genomik DNA, vahşi tip kromozom 3 (vahşi tip, synIXR 2) kodlayan ikisi maya cinsleri, elde edilen geri kalan iki kodlayan sentetik kromozom 3 (synIII 1, synIII synIXR) iletilir. QPCR ana karışımı olarak aynı şekilde düzenlenmiştir, Eko 550 primerleri kullanılarak gDNA ve PCRTag primerler ardından bir sıvı kimyasal dağıtıcı kullanan bir 1536 çukurlu bir levhanın her bir gözü içerisine edildikolay görsel karşılaştırma için multiwell plakanın her kadranda. çukurlu plaka daha sonra, optik bakımdan saydam bir conta ile sızdırmaz kılınmış ve gerçek zamanlı PCR analizine tabi ısı oldu. Beklendiği gibi, bu qPCRTag deneyde sentetik primerler özel olarak sentetik DNA ve tersi amplifiye sayede, büyük bir kısmı, amplifikasyonu için, gözlenen (Şekil 2 ve Şekil 3). Ancak, biz de veri kümesi içinde yanlış negatifler ve yanlış pozitif düşündüren, beklenen desen birkaç sapmalar görülmüştür. Bu deneyde, ana kontrol başarılı bir plaka üzerindeki her içine MasterMix tevzi dökme sıvı dağıtıcı gösteren kuyuların% 100 olarak tespit edilmiştir (veriler gösterilmemiştir). Bu yanlış negatif bir potansiyel kaynak dışladı. Buna ek olarak, kromozom 3 PCRTags en ​​az 2 sin ve 1 ağırlık dahil olmak üzere, (Şekil S6 gösterilen ve Annaluru et al S7. 1) başarısız bilinmektedirprimer çiftleri; dolayısıyla bu kuyular, her kadranda göz ardı edilebilir. Doğru yanlış negatifler doğru Echo 550 kalibrasyon yanı sıra gDNA hazırlanması ve tarif edildiği gibi primerler verilen, deneyimlerimiz, ancak şablon gDNA&#39;sından veya primer transferi eksikliğinden ortaya çıkabilecek, bu hatanın önemli bir kaynak olmamıştır. Genel olarak, bu deneyde, yanlış negatif oran WT şablonu (~% 2), syn-DNA (~% 8) ile SYN primerler için biraz daha yüksek olmasına rağmen wt primerler için son derece düşüktü. Yanlış pozitif, SYN primerleri WT gDNA (ve tersi) ile karıştırılır kuyularda sinyalin tespiti, çapraz büyütme veya primer dimerleri ortaya çıkabilir. Nitekim, astar dimerleri jel elektroforezi (Şekil 1B) tarafından sıklıkla görülebilir ve hata makul bir kaynak oluşturmaktadır. QPCR uygulanması için, erimiş kitle eğrileri incelenmesi Bu primer dimerler olarak, farklı türlerin, bir sinyale katkıda edilebilir olup olmadığını belirlemek için yararlı olabilir. Bundan başka, perfprimerler dimerize etme eğiliminde olan primerler teşhis edilmesine yardımcı olabilir şablon DNA yokluğunda tevzi sayede bir kontrol deneyini oluşturmayan. Çok sayıda PCR döngüsü gerçekleştirilir veya tavlama sıcaklığı çok düşükse çapraz amplifikasyonu, özellikle de jel elektroforezi ile gözlenebilmektedir. Biz qPCRTag protokolü için bu parametrelerin ikisi optimize ederek nedeniyle çapraz amplifikasyon yanlış pozitiflerin sayısını en aza indirmek için çalıştık. Son olarak, gerçek zamanlı tabanlı algılama için uygun değildir primerler belirlemenize yardımcı olabilir her iyi için geçiş noktası (Cp) değerlerini inceleyerek (örn Şekil 3, BB22, Fb22, Bb46, Fb46). Genel olarak bu deneyde yanlış pozitif oran SYN şablonu (~% 10) ile WT primerleri WT şablonu (~% 5) ve daha yüksek olan SYN primerler için düşüktür. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> Şekil 2: varlığı / ab görüntüleyen Plakalı ısı haritasıBir qPCRTag deney için sense arama. SYN ayırmak için, beyaz kesikli çizgiler genomik DNA (kadran beyaz katı çizgiler ile ayrılmış) sentetik (sin) kullanılarak PCRTag analizine tabi tutulmuştur ve vahşi tip (WT) kromozom 3 PCRTag primerleri (dört farklı (üst Her kadranda) ve WT (alt)). WT ve synIXR gDNA. SynIII ve synIII synIXR gDNA SYN PCRTag primerleri ile PCR amplifikasyonu elde edilmiştir sentetik kromozom 3 şifreleyen WT PCRTag primerleri ile PCR amplifikasyonu elde edilmiştir, vahşi tip kromozom 3 kodlar. Astarlar kendi sol-sağ kromozomal konumlandırma göre dizilmiş ve karşılaştırma için dört kadranda aynı konumlandırılmış. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> Şekil 3: Plakalı ısıBir qPCRTag deney için geçiş noktası (CP) değeri gösteren haritası., Şekil 2 ile aynı veri seti ve plaka yerleşimi dolayısıyla aynıdır. N / A &#39;hayır amplifikasyon&#39; anlamına gelir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping at JoVE.com

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

qpcrtag-analysis-high-throughput-real-time-pcr-assay-for-sc20

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

17.0K Görüntüleme.  Institute for Systems Genetics. Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Video: qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Biyomühendislik

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

Multiplex RT-qPCR kullanarak tek hücreli Gen İfadesi Nadir Lenfoid Populasyonlarının Farklılıkları karakterize etmek

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Genetik

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the traditional method of choice is 3&#39; rapid amplification of cDNA ends (3&#39; RACE). Protocols for 3&#39; RACE require the careful design and selection of nested primers within the 3&#39; untranslated region (3&#39; UTR) of the target gene of interest. However, with a few modifications the protocol can be used to include the entire 3&#39; UTR and sequences within the open reading frame (ORF), providing a more comprehensive picture of the relationship between the ORF and the 3&#39; UTR. This is in addition to identification of the polyadenylation signal (PAS), as well as the cleavage and polyadenylation site provided by conventional 3&#39; RACE. Expanded 3&#39; RACE can detect unusual 3&#39; UTRs, including gene fusions within the 3&#39; UTR, and the sequence information can be used to predict potential miRNA binding sites as well as AU rich destabilizing elements that may affect the stability of the transcript.

The two different 3&#39; rapid amplification of cDNA ends (3&#39; RACE) protocols described here make use of two different DNA polymerases to map sequences that include a segment of the open reading frame (ORF), the stop codon, and the entire 3&#39; UTR of a transcript using RNA obtained from different cancer cell lines.

3' adapte CDNA hızlı amplifikasyon transkript kanser eşlemek için sona erer

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective tag single nucleotide polymorphism (SNP) approach using a multiplexed genotyping assay with mass spectrometry, to investigate gene pathway associations in clinical cohorts. We investigate the food allergy candidate locus Interleukin13 (IL13) as an example. This method efficiently maximizes the coverage by taking advantage of shared linkage disequilibrium (LD) within a region. Selected LD SNPs are then designed into a multiplexed assay, enabling up to 40 different SNPs to be analyzed simultaneously, boosting cost-effectiveness. Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify the target loci, followed by single nucleotide extension, and the amplicons are then measured using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry. The raw output is analyzed with the genotype calling software, using stringent quality control definitions and cut-offs, and high probability genotypes are determined and output for data analysis.

Identification of genetic variants contributing to complex human disease allows us to identify novel mechanisms. Here, we demonstrate a multiplex genotyping approach to candidate genes or gene pathway analysis that maximizes the coverage at low cost and is amenable to cohort-based studies.

Klinik kohort çalışmaları çoğaltılmış Genotipleme ve kütle spektrometresi ile test aday gen

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples from cancer patients often directly influences diagnosis, prognosis, and/or therapy selection. As a result, the accurate detection of gene fusions has become a critical component of clinical management for many disease types. Until recently, clinical gene fusion detection was predominantly accomplished through the use of single-gene assays. However, the ever-growing list of gene fusions with clinical significance has created a need for assessing fusion status of multiple genes simultaneously. Next generation sequencing (NGS)-based testing has met this demand through the ability to sequence nucleic acid in massively parallel fashion. Multiple NGS-based approaches that employ different strategies for gene target enrichment are now available for use in clinical molecular diagnostics, each with its own strengths and weaknesses. This article describes the use of anchored multiplex PCR (AMP)-based target enrichment and library preparation followed by NGS to assess for gene fusions in clinical solid tumor specimens. AMP is unique among amplicon-based enrichment approaches in that it identifies gene fusions regardless of the identity of the fusion partner. Detailed here are both the wet-bench and data analysis steps that ensure accurate gene fusion detection from clinical samples.

This article details the use of an anchored multiplex polymerase chain reaction-based library preparation kit followed by next-generation sequencing to assess for oncogenic gene fusions in clinical solid tumor samples. Both wet-bench and data analysis steps are described.

Yeni nesil sıralamanın ardından bağlantılı Multiplex polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak Onkojenik gen füzyon tespiti

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Kanser Araştırmaları

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Tıp

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

T-hücre reseptörleri Eksizyon Circles Eşzamanlı Niceleme (TREC) ve K-silme Rekombinasyon Eksizyon Circles (KRECs) Gerçek zamanlı PCR ile

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Büyük ölçekli SNP Genotiplendirme Uygulamaları için infinium Tahlili

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Biyoloji

Chip-Based Digital PCR to Detect Rare Transcript Variants Using a Nanofluidic Chip

Source: Molinari, C., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57066">Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates chip-based digital PCR &#8212; a variation of the digital PCR technique that is useful in detecting rare transcript variants. The PCR reaction is partitioned into the chambers of a nanofluidic chip, each of which acts as an independent reaction. The detection of fluorescence signals from the chambers with amplified targets confirms the presence of rare transcript variants in the sample.

Nanoakışkan bir çip kullanarak nadir transkript varyantlarını tespit etmek için çip tabanlı dijital PCR

Source: Molinari, C., et al. Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR. J. Vis. Exp. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biyolojik Teknikler

PCR Teknikleri

Chip-in-a-Tube-Based Digital PCR for Quantification of Single Nucleotide Variants

Source: Kahyo, T., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58199">Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the utility of digital PCR in a chip-in-a-tube format for the detection of single nucleotide variations in DNA samples. A single PCR reaction is partitioned into chambers that act as independent PCR reactions, and the detection of fluorescence signals from the amplified targets in the chambers is used to compute the frequency of the variant allele in the sample.

Tek nükleotid varyantlarının miktar tayini için tüp içinde çip tabanlı dijital PCR

Source: Kahyo, T., et al. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the ...