Name: silencing of brca2 to identify novel brca2-regulated biological functions in cultured human cells
Uploaded: 2015-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells at JoVE.com

This work was supported by FIRB-Merit grants RBNE08YFN3_005 and RBNE08HWLZ_012, and the Italian Ministry of Economy and Finance to the CNR for the Project &#8220;FaReBio di Qualit&#224;&#8221;.

1. siRNA çözümleri hazırlayın <ol><li> (50 uM son konsantrasyon siRNA) RNaz içermeyen su, 100 ul BRCA2 siRNA kurutuldu pelet 5 karıştırılmış (CTRL) nmol ve 5 nmol yeniden süspanse edin. Bu siRNA stok ve 10 ul alikotları -20 ° C&#39;de saklanmalıdır. </li><li> SiRNA stoktan 10 ul bir kısım alın ve 10 uM siRNA çalışma çözeltisi elde etmek için RNaz içermeyen su içinde 40 ul ekle. Bu seyreltme, kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de saklanmalıdır. NOT: siRNA çalışma çözüm / dondurma geçmesi 3 kat daha fazla çözülme olmamalıdır. </li></ol> İnsan epitelyal hücre hattı olduğunu 2. Tohum <ol><li> 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde doku kültürü plakaları içinde hücre mono tabakaları olarak büyüyen insan epitelyal hücre hatları büyüme ortamı çıkarın. </li><li> Bir kez RT PBS ile plaka hücreleri (100 mm tabak için 10 ml PBS) yıkayın. </li><li> Plaka hücreleri ayırmak için,% 0.25 tripsin ve 2 ml / 0.53 mM EDTA çözeltisi ekleme ve hücre tipine bağlı olarak 3-5 dakika inkübe edin. </li><li> Müstakil hücreleri toplamak önce,% 10 fetal sığır serumu içeren tam büyüme ortamı 2 ml eklenerek tripsin nötralize eder. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüpe hücreleri aktarın. </li><li> Sallanan kepçeli rotor içinde 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 320-330 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Antibiyotikler-içermeyen ortamdan 5 ml hücre pelletleri yeniden süspanse edin. </li><li> Bir Bürker odasında mikroskop altında ya da imalatçının talimatlarına uygun olarak, otomatik bir sayma sistemi kullanarak hücreleri sayın. </li><li> 6-delikli plakalardaki hücreler 24 saat (de 0.5-1 x 10 her biri için ortam 2 ml 6 hücre) sonra yaklaşık% 80 konfluent olarak tohumu. Optimal hücre sayısı özel hücre çizgileri, büyüme oranına bağlı olarak değişebilir tohumlanır edilmesi. NOT: antibiyotikler olumsuz transfe verimliliği engel olacak çünkü bu noktada ortamda antibiyotik katmayınction. Bu BRCA2 siRNA transfeksiyon, yüksek verim elde etmek için, düşük bir kültür geçitlerin (&lt;10) en hücreleri olması çok önemlidir. </li></ol> SiRNA ile 3. Transfect hücreleri <ol><li> Yirmi dört saat sonra, hücreler kaplama sonrası, transfeksiyon ilk tur devam edin. <ol><li> Indirgenmiş serum ortamı 130 ul lipid bazlı 10 siRNA belirli transfeksiyon reaktif 6 ul sulandırmak. </li><li> Indirgenmiş serum ortamı 130 ul 10 uM siRNA (30 pmol) 3 ul sulandırmak. </li><li> Seyreltildi transfeksiyon reaktifi ile seyreltildi siRNA birleştirin ve oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> İnkübasyon sırasında, hücrelerden orta kaldırmak ve taze ortam (antibiyotiksiz), 37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış 2 ml ekleyin. </li><li> Hücrelere siRNA transfeksiyon reaktifi komplekslerinin 250 ul (bu miktar, 6 gözlü bir plakanın tek oyuk için) ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde hücreleri inkübe76;% 5 CO2 C. </li></ol></li><li> 24 saat sonra, adım 3.1.2 şu değişiklikler 3.1.1-3.1.5 adımları tekrarlayarak transfeksiyon ikinci tur devam: düşük serum ortamı 130 ul 10 uM siRNA (50 pmol), 5 ul seyreltilir. <ol><li> Analizden önce 37 ° C&#39;de 1-2 gün süreyle inkübe hücreleri. NOT: transfeksiyonları ve ikinci turda yüksek bir siRNA / transfeksiyon reaktif oranına kullanımının iki tur BRCA2 sessizliğini yüksek verim elde etmek için gereklidir. </li></ol></li></ol> Immunoblotting analizi için 4. Hücreleri, <ol><li> Iyonik-olmayan, denatüre edici olmayan deterjan oktilfenoksipolietokisetanol% 1, 5 mM sodyum pirofosfat, 1 mM sodyum ortovanadat, 10 mM sodyum flüorür, 2 mM fenilmetilsülfonil fluorür, 10 ug içeren PBS (pH 7.4), taze liziz tamponu / ml löpeptin, 10 | ig / ml aprotinin. Buz üzerinde tutun. </li><li> Hücreler ve w orta çıkarınlevhanın soğuk PBS (2 ml / oyuk) ile bir kez bunları kül. Herhangi bir PBS taşınmasını önlemek için, tamamen plaka çıkarın. </li><li> Her bir oyuğa liziz tamponu içinde 200 ul ekle. NOT: hücreler, diğer analizler için de kullanılabilir hücreleri trypsinize aşama 2,1-2,6 tarif edildiği gibi ve uygulamaya göre, uygun tampon / ortam içinde hücreler tekrar süspansiyon gerekir ise kullanılır. </li><li> Yavaşça eşit lizis tamponu dağıtma ve bir döndürücüde 4 ° C de 15 dakika inkübe etmek plaka döndürün. </li><li> Bir hücre kazıyıcı kullanılarak buz üzerinde, bir mikrosantrifüj tüpü içinde, hücre lizat toplayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 25 dakika boyunca 17.900 x g&#39;de santrifüje ve yeni bir tüp içinde supernatant toplamak. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir ticari olarak temin edilebilen protein deneyi kullanılarak protein konsantrasyonu ölçümü. </li></ol> 5. BRCA2 immunoblotting analizi <ol><li> 20x Tris-Asetat SDS çalışan b 50 ml seyreltilmesi ile çalışan tampon hazırlayınUffer (50 mM Trişin, 50 mM Tris baz,% 0.1 SDS, pH 8.24) damıtılmış su 950 ml. </li><li> Aşağıda örnek hazırlayın: 20 nihai bir hacme kadar 15 toplam hücre lizatı ug, 4x numune tamponu içinde 5 ul pH 8.4 lityum dodesil sülfat içeren, 10x Örnek indirgeyici madde (0.5 M DTT) 2 ul ve lizis tampon eklemek ul. NOT: Bu protokol, (5 ug kadar), aynı zamanda, toplam proteinlerin daha düşük bir miktarda kullanarak, normal hücre çizgilerinde BRCA2 saptanmasını sağlar. </li><li> 10 dakika boyunca 55 ° C&#39;de numune denatüre. NOT: 55 ° C kullanmak çok önemlidir. BRCA2 proteini ısıya 11 olduğu için, daha yüksek sıcaklıklar, denatüre edici tam boy (390 kDa), BRCA2 proteininin tutarlı bir azalmaya neden olur. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre elektroforetik bölmeyi ayarlayın. </li><li> Örnekler ve precasted jeli üzerinde yüksek molekül ağırlıklı ön-lekeli protein standardı 10 ul (Tris-Asetat% 3-8) yük ve ab 120 V çalıştırmak2 saat 12. 55 kDa mavi işaretleyici precasted jel ayrılmadan önce elektroforetik akışını durdurur. </li><li> 20x Transfer tamponu, 50 ml% 100 metanol, 100 ml ve 850 ml su ile birlikte Transfer tamponu hazırlayın. </li><li> 5 dakika boyunca% 100 metanol içinde ıslatarak PVDF membranı (0.45 mikron gözenek büyüklüğü) aktive damıtılmış su ile yıkayın ve en az 5 dakika için transfer tamponu içinde dengeye. Kullanılana kadar 4 ° C &#39;de transfer tampon maddesi transfer cihazının sünger bekletin. </li><li> Elektroforetik çalışma bittiğinde, aşağıdaki sırayla (aşağıdan yukarıya) transfer yığınında sandviç monte: transfer tamponu doymuş üç süngerler, tek 3MM sınıfı kağıt levha transfer tamponu, jel, aktif PVDF membran, tek 3mm doymuş Transfer tamponunda doymuş sınıf kağıt levha, üç süngerler transfer tamponu 13,14 doymuş. 4 ° C&#39;de gece boyunca mA 4 ° C ya da 180 ° C&#39;de 4 saat 350 mA&#39;da cihazı ve aktarım proteinleri içine yığın yerleştirin. NOT: yüksek molekül ağırlıklı proteinlerin tam transferini sağlamak üzere 4 saat veya gece için (üretici ve çoğu aktarım protokolleri tarafından önerilen) olmak BRCA2 çok büyük bir protein o 1 saat transfer süresini uzatmak için çok önemlidir. Buna ek olarak, uzun bir aktarım zaman, bu aşırı ısınmayı en aza indirmek ve sandviç Sökme kolaylaştırmak için 4 ° C &#39;de soğuk bir odada blotting işleminin gerçekleştirilmesi için çok önemlidir. Yarı kuru transfer sistemleri büyük proteinlerin aktarımı için iyi değildir. </li><li> Aktarma işleminden sonra (30 ul anti-BRCA2 tavşan poliklonal antikoru ile 4 ° C&#39;de bir gece boyunca% 5 yağsız kuru süt ve probu içeren TBS-Tween% 0.25 içinde oda sıcaklığında 1 saat (TBS-T) için bloke TBS ile zarın yıkanması [: 300 (h / h) sulandırma 1] 9 ml TBS-T +% 5 yağsız kuru süt içinde seyreltilmiş 200 ng / ml). </li><li> Daha sonra TBS 10 ml seyreltilmiş bayır turpu peroksidazı ile konjuge edilmiş anti-tavşan ikincil antikoru ile 1 ul, 1 saat boyunca filtre inkübe, TBS-T ile, membran üç defa (10 dk) yıkayın-T +% 5 yağsız kuru süt. Bundan sonra, TBS-T ile membranı üç defa (10 dk) yıkayın. </li><li> Gelişmiş kemilüminesans (ECL) Western Blot saptama reaktif maddesi kullanılarak, üretici talimatlarına göre BRCA2 proteini ortaya çıkarmak için ECL tarafından immunodeteksiyon gerçekleştirin. Yüksek çözünürlüklü ECL filmlerinde immunochemiluminescent bantları gözünüzde canlandırın. </li><li> 10 anti-tubulin antikoru 1000 (10 ul: β-tubulin bir monoklonal antikor kullanılarak 1 seyreltilmiş göre yükleme kontrolü olarak, aynı filtre üzerinde, β-tubulin (55 kDa) gibi bir ev bakıcısı geni için bir antikor ile immunodeteksiyon gerçekleştirme oda sıcaklığında 1 saat ml TBS-T +% 5 yağsız kuru süt). Yaban turpu peroksidazı ile konjuge edilmiş anti-fare yerine anti-tavşan sekonder antikor kullanılması haricinde, yıkama ve BRCA2 (5,10-5,11) için tarif edildiği gibi sekonder antikoru inkübe edin. </li><li> (Immunochemiluminescent bantları ile etkilendim filmlerin dijital görüntü elde ve özel görüntü analiz yazılımı tarafından bant yoğunluğunu analiz, örneğin., ImageJ). </li></ol>

<ol>
	<li>Thorslund, T., West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA2:+a+universal+recombinase+regulator.">BRCA2: a universal recombinase regulator.</a> Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).</li><li>Yoshida, K., Miki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+BRCA1+and+BRCA2+as+regulators+of+DNA+repair,+transcription,+and+cell+cycle+in+response+to+DNA+damage.">Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage.</a> Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).</li><li>Martin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+mutations+in+BRCA1+and+BRCA2+in+breast-ovarian+families+from+a+breast+cancer+risk+evaluation+clinic.">Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic.</a> J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).</li><li>Castro, E., Eeles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+BRCA1+and+BRCA2+in+prostate+cancer.">The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer.</a> Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).</li><li>Vencken, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensitivity+and+outcome+of+BRCA1-+and+BRCA2-associated+ovarian+cancer+patients+after+first-line+chemotherapy+compared+with+sporadic+ovarian+cancer+patients.">Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients.</a> Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434, 917-921 (2005).</li><li>Arbini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+depletion+sensitizes+cancer+cells+to+PARP+inhibitors+by+translational+and+post-translational+repression+of+BRCA2.">Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2.</a> Oncogenesis. 2, e82 (2013).</li><li>Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AURKA+and+BRCA2+expression+highly+correlate+with+prognosis+of+endometrioid+ovarian+carcinoma.">AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma.</a> Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).</li><li>Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+BRCA2+decreases+anoikis+and+its+heterologous+expression+sensitizes+yeast+cells+to+acetic+acid-induced+programmed+cell+death.">Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death.</a> Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).</li><li>Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-based+gene+delivery+systems:+pharmaceutical+perspectives.">Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives.</a> Pharm Res. 14, 853-859 (1997).</li><li>Su, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+BRCA2:+temperature+sensitivity+of+detection+and+cell-cycle+regulated+expression.">Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression.</a> Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Burnette, W. N. '. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Western+blotting':+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Hunter, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+targeting+of+hypoxia+and+homologous+recombination+repair+dysfunction+in+triple-negative+breast+cancer.">Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. , (2014).</li><li>Drew, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitor+AG014699+in+human+cancers+with+mutated+or+methylated+BRCA1+or+BRCA2.">Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2.</a> J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).</li><li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434, 913-917 (2005).</li><li>Ihnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+the+poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitor+rucaparib+for+the+treatment+of+sporadic+human+ovarian+cancer.">Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer.</a> Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).</li><li>Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brca2+Deficiency+Leads+to+T+Cell+Loss+and+Immune+Dysfunction.">Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction.</a> Mol Cells. , (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Kadın ve erkek meme kanseri, yumurtalık kanseri, prostat kanseri, pankreas kanseri ve melanom 3,4 dahil olmak üzere birçok kanser türleri, risk artışına BRCA2 geni kurşun germline mutasyonlar, çok sayıda çalışma biyolojik işlevini anlamak için yapılmıştır Çünkü BRCA2 protein. Bu çalışmaların çoğu nedeniyle BRCA2 gibi dev bir protein analiz teknik zorluklar genetik temelli çoğunlukla. BRCA2 protein ekspresyonu susturma ve analiz edilmesi için burada tarif edilen metot, biyolojik tahliller, geniş bir spektrum içinde BRCA2 tümör baskılayıcı gen işlevlerini araştırılması için etkili bir araç sağlar. susturma protokol henüz BRCA2 başarılı ve tutarlı demonte birkaç önemli değişiklikler yanı sıra ipuçları içerir, standart siRNA transfeksiyon prosedürleri dayanmaktadır. siRNA transfeksiyon protokolü genellikle len kullanan shRNA, farklı, güvenli, hızlı ve verimli veantiviral vektörler, belirli biyogüvenlik prosedürleri gerekmez ve kolayca hücre kültürü tesisi ile donatılmış herhangi bir laboratuvarda yapılabilir. Benzer şekilde, immunoblotting protokolü BRCA2 gibi büyük bir proteinin etkin bir şekilde tespiti için optimize edilmiştir. immunoblotting protokolü de heterolog maya hücreleri 9 eksprese edilen rekombinant insan BRCA2 proteinin tespit edilmesi için onaylanmıştır. SiRNA verimli verme için çeşitli önemli faktörler burada rapor edilmektedir. Özellikle ikinci çevrim iki transfeksiyonun döngüleri ve transfeksiyon reaktifi oranı yüksek bir siRNA içerir. Transfeksiyon prosedürü önce antibiyotik ve sırasında yokluğu başka önemli faktördür. Ancak bu işlem bakteriyel kontaminasyon riski kültür hücreleri ortaya; Böylece ekstra önlemler tüm adımlarda sterilite yüksek bir standart garanti alınmalıdır. Belirtilmelidir, hücre tipine bağlı olarak, etkili bir gen knockdo buwn tipik ikinci döngüden sonra 24-48 saat gerektirir. Geçerli yöntem, en azından gün 7 ikinci transfeksiyon döngüsü sonrasına kadar oldukça istikrarlı susturulması geni tutma avantajına sahiptir. Bu, farklı kemoterapötik ilaçlara hücresel yanıt da dahil olmak üzere, biyolojik tahliller, çeşitli demonte BRCA2 etkilerinin çalışma sağlar. Bununla birlikte, bu tekniğin bir sınırlama eksojen siRNA molekülleri genomuna entegre değildir gerçeği ile temsil edilir, gen ekspresyonu ve böylece stabil bir yok etme elde edilemez. Seçenek olarak ise, sabit bir demonte elde etmek için, shRNA lentiviral enfeksiyonu laboratuar ilave biyo-güvenlik gereksinimleri (BSL-2 standartları, NIH talimatlarına göre) için hazırlanmış olması şartıyla, gerçekleştirilebilir. Transfeksiyon, belirli bir hücre türü, gen fonksiyonunu incelemek için (örn., T lenfositler) uygulanabilir bir yaklaşım değildir Buna ek olarak, hücre spesifik koşullu BRCA2 knockout farelerde kullanımı, sadece altern kalır19 ative. Bu yöntem aynı zamanda rapor immünoblotlama ile bir yüksek molekül ağırlıklı protein başarılı bir şekilde saptanması için çeşitli ipucu ve yüksek ve düşük bolluk proteinleri hem de uygundur. Nedeniyle BRCA2 protein ısısal, özellikle de, bir düşük denatüre sıcaklığı önceki bir çalışmada 11 ile uyumlu olarak, optimal tespiti için kritik önem taşır. Bu teknik trick &#39;, standart bağışıklık beneklenme protokolleri ile algılama başarısız ispatlanmış olan diğer proteinler için yararlı olabilir. Biz bu yöntem susturulması ve diğer pek çok zorlu proteinlerin saptanmasını kolaylaştırabilir ve böylece genel geçerlilik ipuçları içerir ve öngörmekteyiz.

BRCA2 (Meme Kanseri yatkınlık geni-2) gen rekombinaz enzimi Rad51 1 işlevini düzenleyen DNA çift iplikli sonları onarımında önemli bir rol oynayan bir tümör baskılayıcı protein kodlayan. BRCA2 aynı zamanda transkripsiyonun modülasyonu ve hücre döngüsü kontrol 2 implike edilmiştir. BRCA2 geninin germline mutasyonlar için diğer kanser türleri 3,4 otozomal dominant erkeklerde meme ve kadınlarda yumurtalık kanseri ve prostat kanseri olan yatkınlığı, hem de yatkınlığı neden olur. Ancak, bastırmak ya da DNA hasarına neden olan 5-7 kemoterapötik ajanların kanser hücrelerinin daha hassas hale getirebilir BRCA2 fonksiyonunu azaltmak kanser, BRCA2 mutasyonları gelişmekte riski rağmen. Sporadik kanserler o BRCA2 protein düşündüren, BRCA2 proteininin azaltılmış düzeylerinin bazı kanser türlerinde tespit edilmiştir rağmen BRCA2 mutasyonları (&lt;% 3) düşük bir oran sergilemektedirolmayan mutasyon bağımlı mekanizmalar 7,8 ile sporadik kanserlerde tümör oluşumu sırasında kaybolmuş olabilir. Bu nedenle, tam Kanser biyolojisinde bağlamında gibi diğer biyolojik ortamlarda BRCA2 fonksiyonlarını anlamak önemlidir. Memeli hücrelerinde gen yeni işlevleri belirlemek için kullanılan güçlü bir araçtır ifadesini susturma etmektir. Bir örnek olarak, normal epitel hücrelerinin çeşitli susturma BRCA2 sentezleme en son anoikis direnci, kanser hücresi invaziv ve metastatik yeteneği 9 edinilmesi sırasında önemli bir aşama düzenleyici olarak BRCA2 yeni bir fonksiyon belirlenmesine yol açmıştır. Gen susması hücrelerin küçük müdahale (si) RNA ya da özel bir geni hedef alan kısa bir saç tokası (sh) RNA molekülleri ya sokulması ile elde edilebilir. Yüksek siRNA gücü ve kullanım kolaylığı kritik biyolojik süreçler içine yeni anlayışlar kazanma amaçlı deneyler susturmak için onu tercihli aracı yapmak birnd yeni tedavi hedefleri tespit etmek. Ancak, gen ekspresyonunun etkili bir yok etme tüm genler kolaylıkla elde olmayabilir ve hücre türüne bağımlı olarak oldukça değişken olabilir. Hücre içi protein seviyelerinde bir azalma araştırılmaktadır en uygun fenotip olduğu için, gen ürününün analizi immün gen susmasını ölçmek için son derece önemlidir. Bu bağlamda, BRCA2 proteininin bir başka meydan okuma sunuyor: Büyük bir protein (yaklaşık 390 kDa) olan, teknik zorluklar immunoblotting dahil olmak üzere geleneksel biyokimyasal analiz için mevcut. Biz burada insan epitel hücre hatlarında BRCA2 verimli susturulması için ve analiz immün demonte BRCA2 proteininin hızlı ve başarılı tespiti için optimize edilmiş bir protokol rapor.

<table><tbody><tr><td>BRCA2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003462-00</td><td>SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA</td></tr><tr><td>Ctrl siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>&amp;nbsp;D-001810-10-05</td><td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Reagent&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/13778075&quot;&gt;13778075&lt;/a&gt;</td><td>Transfection Reagent</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Medium for transfection procedure</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast</td><td>Life Technologies</td><td>EA0378</td><td>Gel for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample buffer&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>Reagent for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>NuPAGE Sample Reducing agent (10x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0004</td><td>Reagent for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxidant</td><td>Life Technologies</td><td>NP0005</td><td>Reagent for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>HiMark Pre-stained protein standard</td><td>Life Technologies</td><td>LC5699</td><td>Prestained marker for gel electrophoresis</td></tr><tr><td>XCell SureLoc Mini-Cell&amp;nbsp; System</td><td>Life Technologies</td><td>EI0002</td><td>Equipment for protein electrophoresis/transfer</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LA0041</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0006-1</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8326</td><td>1:300 dilution</td></tr><tr><td>Beta-tubulin monoclonal antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4026-100UL</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Skim Milk powder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70166</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>34080/34096</td><td>Chemiluminescence system</td></tr><tr><td>PNT1A cells</td><td>SIGMA Aldrich (for ECACC)</td><td>95012614</td><td>PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40</td></tr><tr><td>Nthy cells</td><td>SIGMA Aldrich (for ECACC)</td><td>90011609</td><td>Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells</td></tr><tr><td>Cell Proliferation Kit I (MTT)</td><td>Roche</td><td>11465007001</td><td>Kit for cell proliferation assays</td></tr></tbody></table>

silencing of brca2 to identify novel brca2-regulated biological functions in cultured human cells

Tümör baskılayıcı protein BRCA2 ve konvansiyonel biyokimyasal analizler tarafından tespit susturma insan BRCA2 proteininin (yaklaşık 390 kDa) büyüklüğü sayesinde büyük bir teknik sorun oluşturmaktadır. Biz insan epitel hücre hatlarında sırasıyla endojen BRCA2 proteini, insan BRCA2 susturmak ve tespit etmek için standart siRNA transfeksiyon ve immunoblotting protokolleri değişiklikler rapor. Anahtar adımlar transfeksiyon reaktif oranı yüksek siRNA ve aynı deney içinde siRNA transfeksiyon birbirini takip eden iki mermi bulunmaktadır. Anti-BRCA2 antikorlar ile analiz immün tarafından değerlendirilecek sürekli olarak insan BRCA2 geninin fazla% 70 susturulması elde standart protokole bu ve diğer değişiklikler kullanma. Buna ek olarak, bunun yerine klasik 70-100 ° C ve immunoblotting prosedür diğer teknik iyileştirmeler 55 ° C&#39;de hücre lizatlarının denatürasyon sağlam BRCA2 proteininin tespiti da WH izinbaşlangıç ​​malzemesinin çok düşük miktarlarda en mevcuttur ya da BRCA2 protein ekspresyon seviyesi çok düşük olduğunda. Insan hücrelerinde BRCA2 etkin susturulması, tümör hücreleri de dahil olmak üzere sağlam BRCA2, hücrelerde BRCA2 fonksiyonunu bozmaya yeni moleküler yollar ve tümör patojenik BRCA2 mutasyonu etkilenebilir hücre fonksiyonlarını incelemek için değerli bir strateji vardır. Verimli susturma ve BRCA2 gibi diğer &#39;büyük&#39; ​​protein analizi için bu protokolün Adaptasyon kolayca ulaşılabilir olmalıdır.

Hücre fonksiyonları üzerine BRCA2 susturma etkisini incelemek üzere bir biyolojik / biyokimyasal tahlil geçmeden önce, ilk adım bir şifreli siRNA (siRNA olmayan hedefleme) BRCA2 siRNA ile yan yana (Şekil 1A kullanarak susturma özgünlüğünü doğrulamak için ). Bu BRCA2 susturma yüksek verim elde etmek için yüksek bir siRNA / transfeksiyon oranı ile siRNA transfeksiyon ikinci tur gerçekleştirmek için önemlidir. Gerçekten de, siRNA transfeksiyon tek aşama performans ya da daha düşük, yok etme etkisi (Şekil 1B) neden olur ikinci turda (siRNA 25 pmol ve transfeksiyon reaktifi 6 ul) transfeksiyon oranı için daha düşük bir siRNA kullanılarak. İkinci adım gen susturma en üst düzeyde elde etmek için en uygun minimum zaman değerlendirmektir. Hücre tipine bağlı olarak, bu siRNA transfeksiyon ikinci tur sonra 24 ila 48 saat değişebilir. Örneğin, 24 saat Nthy tiroit hücreleri için yeterli olan, ancak en fazla 48HR PNT1A prostat hücrelerinde en verimli BRCA2 demonte (Şekil 2A) için gereklidir. BRCA2 susturma, ikinci transfeksiyon döngüsü (Şekil 2B) sonraki 7. günde kadar oldukça stabildir. Dikkat çekici bir şekilde, 55 ° C&#39;de (5 dakika için 100 ° C) üstünde bir sıcaklıkta, hücre lizatları denatüre nedeniyle BRCA2 11 ısısal için BRCA2 protein (Şekil 2C), en fazla% 50 kayıp ile sonuçlanır. Optimal susturma süresi belirlendikten sonra, BRCA2 protein kaybının etkileri, pek çok tayinde yararlanılabilir. DNA hasarı, 15-18 neden olan diğer kemoterapötik ilaçlara gibi PARP önleyicileri duyarlılığı arttıran BRCA2 fonksiyonunun kaybına yol in vivo mutasyonu için, ortak bir deney PARP önleyicisi rucaparib için BRCA2 -silenced hücrelerinin duyarlılığını tespit etmektir veya oloparib. Şekil 3&#39;te belirtilen deneyde, PNT1A hücreler o tükenmişsiRNA ile ön BRCA2 protein hücre proliferasyonu MTT-bazlı hücre proliferasyon deneyi ile değerlendirilmiştir sonra 24 saat boyunca 10 uM rucaparib ile muamele edilmiştir. Rucaparib tedavisi (Şekil 3) sonra hücre çoğalması, zamana bağlı bir azalmaya BRCA2 proteini sonuçları tükenmesi. <img alt="Figür 1" src="/files/ftp_upload/52849/52849fig1.jpg" /> Şekil 1. transfeksiyon reaktif oranı transfeksiyon ve yüksek siRNA&#39;nın iki tur BRCA2 susturulması geliştirmek. (A) BRCA2 susturma Özgünlük BRCA2 protein düzeylerinin karşılaştırılması için bir kontrol olarak karıştırılmış siRNA (CTRL) kullanılarak transfeksiyon ikinci turu sonrasında analizi 24 saat immün Nthy hücrelerinde doğrulandı. Moleküler ağırlık belirteçleri sol tarafta rapor edilir. (B) PNT1A hücreleri BRCA2 s 1 ya da 2 döngüsüne tabi tutulmuşturprotokol açıklanan [Döngüler (#) 1 ve 2] ve BRCA2 protein tükenmesi immunoblotting tarafından ölçüldü olarak IRNA transfeksiyonu. Karıştırılmış siRNA ile transfeksiyon iki döngü Kontrol (CTRL) olarak kullanılmıştır. 2b&#39;de, PNT1A hücreleri modifikasyon (25 pmol siRNA / 6 ul transfeksiyon reaktifi) ikinci çevrimde transfeksiyon reaktifi oranı için daha düşük bir siRNA kullanılarak BRCA2 siRNA transfeksiyon, iki döngüsüne tabi tutulmuştur. Tüm durumlarda, BRCA2 protein düzeyleri, ikinci döngüden sonra 48 saat analiz edildi. En altta, BRCA2 protein seviyelerinin ölçümü BRCA2 / tubulin oranı olarak bildirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52849/52849fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52849/52849fig2.jpg" /> BRCA2 demonte 2. Optimizasyon Şekil. (A) Optimal BRCA2 demonte ikinci siRNA transfeksiyon devrinden sonra 24 ila 48 saat gerektirebilir. İki farklı hücre hatları (PNT1A ve Nthy) BRCA2 demonte 24 saat karıştırıldı ve analiz immün ikinci siRNA transfeksiyon döngüsünden sonra 48 saat boyunca değerlendirilmiştir. Alt kısımda, BRCA2 protein seviyeleri 100 Veriler, üç bağımsız deneyin ortalamasını temsil etmektedir ± SE olarak belirlenmiştir, zaman 0 saat sonra seviyelerinin yüzdesi olarak rapor edilmiştir. (B) BRCA2 demonte 7 gün boyunca stabildir. PNT1A hücreleri immunoblotting tarafından ikinci siRNA transfeksiyon döngüsünden sonra 196 saat kadar BRCA2 demonte açısından değerlendirildi. Tübülin sinyaline BRCA2 oranı dibinde bildirilmiştir. (C) BRCA2 protein termosensitif olduğunu. Sigara transfekte PNT1A hücreleri protokole göre (yaklaşık% 70 ortak akışkanlığa) kaplama 24 saat sonra toplandı ve lize edilmiştir. Aynı hücre lizatı (15 ug toplam protein), iki alikotları, 10 dakika boyunca, 100 ve # 55 ° C &#39;de, ya denatüre edilmiştir176; 5 dakika ve BRCA2 protein düzeyleri Cı immunoblotting ile değerlendirildi. En altta, tubulin sinyali BRCA2 oranı bildirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52849/52849fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52849/52849fig3.jpg" /> Şekil 3. BRCA2 susturma PARP önleyicisi rucaparib hücre hassasiyetini arttırmaktadır. PNT1A hücreler ya Kontrol (CTRL) ya da BRCA2 siRNA ile transfekte transfeksiyondan sonra 48 saat toplandı ve 96-çukurlu plaka içinde kaplandı (2000 hücre / oyuk). 24 saat sonra, 10 uM rucaparib hücreleri 96 saat kadar, ilacın yokluğunda tutulmuş, sonra 24 saat için hücrelere ilave edildi. 690 nm - Hücre proliferasyonu 550 nm&#39;de absorbans ölçülerek MTT tahlili kullanılarak, belirtilen zamanda değerlendirildi. Each zaman noktası, bir temsili deneyden üç kuyu ortalama ± SD&#39;sini gösterir. Ctrl siRNA, mavi çizgi, BRCA2 siRNA, kırmızı çizgi. Üst kısmında, BRCA2 siRNA transfekte hücrelerde BRCA2 protein profili bildirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52849/52849fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells at JoVE.com

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

Susturulması<em&gt; BRCA2</em&gt; Kültür İnsan hücrelerinde Roman BRCA2 düzenlenmiş Biyolojik Fonksiyonları Belirlemek İçin

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

silencing-brca2-to-identify-novel-brca2-regulated-biological

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

9.0K Görüntüleme.  National Research Council. Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented. 

Video: Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Kanser Araştırmaları

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

CRISPR Aracılı Temel Editörler kullanılarak BRCA1 varyantlarının fonksiyonel değerlendirmesi

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Tıp

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Kanser İlaç Duyarlılık Etkinliğinin Değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the BRCA1 have been complicated by the lack of a robust assay for the full length BRCA1 protein and the difficulties inherent in working with cell lines that express hypomorphic BRCA1 protein1,2,3,4,5. We developed a system whereby the endogenous BRCA1 protein in a cell was acutely depleted by RNAi targeting the 3'-UTR of the BRCA1 mRNA and replaced by co-transfecting a plasmid expressing a BRCA1 variant. One advantage of this procedure is that the acute silencing of BRCA1 and simultaneous replacement allow the cells to grow without secondary mutations or adaptations that might arise over time to compensate for the loss of BRCA1 function. This depletion and add-back procedure was done in a HeLa-derived cell line that was readily assayed for homologous recombination activity. The homologous recombination assay is based on a previously published method whereby a recombination substrate is integrated into the genome (Figure 1)6,7,8,9. This recombination substrate has the rare-cutting I-SceI restriction enzyme site inside an inactive GFP allele, and downstream is a second inactive GFP allele. Transfection of the plasmid that expresses I-SceI results in a double-stranded break, which may be repaired by homologous recombination, and if homologous recombination does repair the break it creates an active GFP allele that is readily scored by flow cytometry for GFP protein expression. Depletion of endogenous BRCA1 resulted in an 8-10-fold reduction in homologous recombination activity, and add-back of wild-type plasmid fully restored homologous recombination function. When specific point mutants of full length BRCA1 were expressed from co-transfected plasmids, the effect of the specific missense mutant could be scored. As an example, the expression of the BRCA1(M18T) protein, a variant of unknown clinical significance10, was expressed in these cells, it failed to restore BRCA1-dependent homologous recombination. By contrast, expression of another variant, also of unknown significance, BRCA1(I21V) fully restored BRCA1-dependent homologous recombination function. This strategy of testing the function of BRCA1 missense mutations has been applied to another biological system assaying for centrosome function (Kais et al, unpublished observations). Overall, this approach is suitable for the analysis of missense mutants in any gene that must be analyzed recessively.

We provide a method for testing BRCA1 variants in a tissue culture based assay for homologous recombination repair of DNA damage by depleting endogenous BRCA1 protein from a cell using RNAi and replacing it with a BRCA1 point mutant that contains a coding change.

Endojen Wild-tip BRCA1 Express hücreler kullanarak Homolog Rekombinasyon BRCA1 Mutasyonlar Etkileri belirlenmesi

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Biyoloji

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

In Vitro Hedeflenen Epigenetik Susturma için Tasarlanmış Transkripsiyonel Baskılayıcıların Seçimi

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Biyomühendislik

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

Whole Sırasının NGS Analiz için bir transpozaz tabanlı Technology tarafından gDNA Zenginleştirme<em&gt; BRCA1</em&gt;<em&gt; BRCA2</emDNA Hasarı Onarım ilgilendim&gt; ve 9 Genler

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

Susturulması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler