Bu çalışma ve ShanghaiTech Üniversitesi, Shanghai, Çin (DP1CA174426 Carlos F. Barbas için) (JL) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Moleküler grafik Pymol kullanılarak elde edilmiştir.

1. Klonlama <ol><li> PET-28 ifade vektörü sistemi içine alt-klonlandığında, istek (pET-2F-ZiF) üzerine mevcuttur edilmiştir alanin ile ikame edilmiş, iki parmak ZiF etki elde edilir. 34 </li><li> PCR primerleri ile plazmid zümrüt-pBAD gelen EmGFP amplifiye 5 &#39;Xmal-EmGFP (5&#39;-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3&#39;; kalın olarak Xma I bölgesi) ve 3 &#39;Sacl-EmGFP (5&#39;-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3&#39; ; kalın Sac sitesi). <ol><li> Şablon DNA 5 ng, 10x polimeraz tamponu 10 ul damıtılmış / iyonu giderilmiş su oluşur 1 Taq DNA polimeraz, 0.2 mM her bir dNTP Birimi (U) ve geri kalan hacim 100 ul çözelti içinde, her bir primerden 0.2 uM kullanın . Siklusları: 5 dakika boyunca 95 ° C; 30 saniye için 95 ° C 30 döngü, 30 saniye için 55 ° C sıcaklıkta ve 1 dk için 72 ° C; 10 dakika boyunca 72 ° C. Jel extracti PCR ürünü saflaştırmakve Abs 260 x 50 ug / ml ölçen bir spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonunu belirlemek. </li></ol></li><li> Özet pET-2F-ZiF ve sınırlama EmGFP kodlayan uç DNA 1 ug başına enzimin 10 u kullanarak 37 ° C &#39;de 3 saat boyunca tavsiye edilen tamponda Xma I ve Sac I enzimleri. Gibi etidyum bromür gibi floresan interkalasyon boya kullanılarak agaroz jel elektroforezi ile DNA görselleştirmek. </li><li> Jel ekstraksiyon kiti ile sindirilmiş DNA arındırın ve ABS 260 x 50 ug / ml ölçen bir spektrofotometre ile DNA konsantrasyonu belirlenir. </li><li> Oda sıcaklığında en az 1 saat boyunca T4 DNA ligazı 1 ünite kullanılarak pET-2F-ZiF 50-100 ng saflaştırılmış EmGFP kodlayan DNA Arter. 1 insert-vektör molar oranı: En iyi sonuç için, 6 kullanarak ligasyon reaksiyonu gerçekleştirmek. </li><li> Buz üzerinde herhangi bir kimyasal uyumlu XL-1 Mavi E. coli hücreleri 50 ul çözülme ve 10-20 ng lige pET-2F-ZiF-EmGFP bölgesinin ile yavaşça karıştırın. </li><li> 3 için buz tutun0 dak. Isı şoku 90 sn için 42 ° C sıcaklıkta karışım ve çalkalanarak 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca katabolik baskı (SOC) ile süper optimal suyu 2 ml hücreler geri kazınılmıştır. </li><li> 50 ug / ml kanamisin içeren bir lizojeni suyu (LB) agar plakası üzerine geri kültür, 100 ul yayıldı ve 37 ° C &#39;de O / N inkübe edin. </li><li> Bir sonraki gün, Süper Broth (SB), ya da 50 ug / ml kanamisin, 37 ° C&#39;de LB agar plakası ve kültür göre O / N itibaren bir koloni içeren LB kültür 6 ml inoküle. Not: Koloni PCR primerlerini 5 &#39;Xmal-EmGFP ve 3&#39; Sacl-EmGFP kullanılarak miniprep önce pozitif klonları tanımlamak için kullanılabilir. </li><li> Miniprep ile pET-2F-ZiF-EmGFP arındırmak ve T7 promotörü kullanılarak DNA dizilemesi ile teyit plazmid (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;). </li></ol> 2. İfade ve saflaştırma <ol><li> Kimyasal yetkili BL21 E. 50 ul çözülme Buz üzerinde coli hücreleri ve PL pET-2F-ZiF-EmGFP 100 ng ile yavaşça karıştırınasmid. Adımlarda 1.7-1.8 açıklandığı gibi Transform. </li><li> Ertesi gün, tek bir koloni ile 50 ug / ml kanamisin içeren LB ortamında 10 ml aşılamak ve çalkalanarak 37 ° C&#39;de O / N büyür. </li><li> Bir sonraki gün, 50 ug / ml kanamisin,% 0.2 glikoz ve 100 uM ZnCI2 ile takviye edilmiş LB ortamı 1 L O / N kültür 10 ml seyreltik. 0.8, 600 nm (OD 600) de optik bir yoğunluğa kadar çalkalanarak 37 ° C&#39;de kültür büyütün ve 2 mM izopropil-β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ve protein ifadesini teşvik eder. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüj ile 37 ° C&#39;de büyüme 6 saat, hasat sonrasında, hücreler. Not: İndüksiyon koşulları oldukça değişkendir ve ifade edilen proteinlerin istikrar bağlıdır. 0.8 600 ulaşıldığında bir OD kadar OD 600 her 30 dk izleyin. </li><li> Liziz tamponu, 5 ml (50 mM Tris-HCI, 500 mM NaCl içinde hücre pelletini, 100 uM ZnCl2, 1 mM ditiyotreitol (DTT), 1mM MgCl2, 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve 10 mM imidazol, pH 8.0). Aşağıdaki ayarı ile sonikasyon ile buz üzerinde lizleyin hücreleri: 50% güç çıkışı, / 10 saniye kapalı aralıklarla üzerinde 5 saniye ile 4 dakika işlem süresi. Çözüm aşırı ısınma kaçının. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 25,000 x g&#39;de hücre lizat santrifüj ve yeni bir toplama tüpüne süpernatant aktarın. En iyi sonuçlar için, 4 ° C&#39;de aşağıdaki adımları uygulayın. </li><li> Bir sütun dengelenmiş Ni-NTA bulamacın 1 ml kullanıma hazır süpernatanın çalıştırın. Yıkama tamponu, 20 ml (50 mM Tris-HCI, 500 mM NaCl, 100 uM ZnCI2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2, 30 mM imidazol, pH 8.0) ile reçinenin yıkayın. </li><li> 5 yıkama tampon maddesinin ml&#39;si (50 mM Tris-HCI, 500 mM NaCI, 100 uM ZnCI2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2, 300 mM imidazol, pH 8.0) ile proteininin elüt edilmesi. </li><li> Tampon saklama tamponu ile elüt protein (50 mM alışverişiTris-HCI, 500 mM NaCI, 100 uM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 ve% 10 gliserol, pH 8.0) kullanılarak ve imalatçının talimatlarına uygun olarak santrifüj ile bir spin konsantratör kullanılarak en az 40 uM proteinin konsantre edilir. </li><li> BCA veya Bradford deneyi ile protein konsantrasyonu belirleyin. 10 dakika boyunca 95 ° C &#39;de 2 ul 2 x SDS-PAGE yükleme boyası, kaynatma ile saflaştırılmış proteinlerin 2 ul karıştırın ve daha sonra% 4 protein saflık (Şekil 2) üzere% 20 Tris-Glisin, SDS-PAGE gidermek. </li></ol> 3. Protein Depolama <ol><li> -80 ° C&#39;de, sıvı azotun ve depoda konsantre protein, flaş dondurma alikosu. EmGFP füzyon proteinleri için, ışıktan proteini korumak için alüminyum folyo ile tüp kapsamaktadır. </li><li> Tekrarlanan donma ve protein çözeltisi çözülme kaçının. Not: ZiF-kaynaşık proteinler en az 1 ay boyunca bu koşullar altında stabildir. Uygunsuz veya&gt; 4 ay depolama yol açabilirProtein yağış veya EmGFP ve photobleaching. </li></ol> 4. Protein İletimi <ol><li> % 10 ihtiva eden Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde HeLa hücrelerini muhafaza (h / h) cenin sığır serumu (FBS) ve% 1 antibiyotik-antimikotik% 5 CO2 ile bir tam nemli bir atmosferde 37 ° C &#39;de. Not: Hücreler fazla 30 kat protein iletimi için tavsiye edilmez pasajlandı. </li><li> Ön kaplama, 25 ° C&#39;de 30 dakika ila 60 poli-lisin, 50 mg / ml 500 ul, 24 oyuklu bir plaka. Oyuk başına 2 x 10 5 hücre yoğunluğunda 24 kuyulu bir levha üzerine tohum hücreleri. Hücreler% 80 arasında -90% konfluent sonra tohumlama 24 saat sonra ya da her bir gözden ortamını çıkarın ve önceden ısıtılmış serum içermeyen DMEM içinde 500 ul (SFM) ile yıkayın. </li><li> Her bir oyuğa, SFM, 250 ul ZiF-EmGFP proteininin 2 uM ve 100 uM ZnCl2 ihtiva eden ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. Not: ZiF etki hücrelerine girmek primarily bir enerji-bağımlı bir mekanizma makropinositozlar, 34 ile. Bu nedenle, hücreleri verimli bir protein içselleştirme 37 ° C&#39;de inkübe edilmesi gerekir. </li><li> Kalsiyum ve magnezyum içermeyen 500 ul ile üç kez hücrelerden Ortamı çıkarın ve yıkama Dulbecco fosfat-tamponlu tuzlu su, heparin, 0.5 mg / ml ile takviye edilmiş (DPBS). Not: Heparin, mansap analizler zorlaştırıyor olabilir yüzey bağlı protein kaldırmak için gereklidir. </li><li> Gelişmiş teslimat için üç kata kadar (İsteğe bağlı) Tekrar tedavileri. </li><li> Hemen 2 dakika süreyle 37 ° C&#39;de% 0.05 tripsin-EDTA ile sindirme ile yıkama heparin sonra muamele edilmiş hücreler izole edin. % 1 FBS ile takviye edilmiş DPBS 0.5 ml müstakil hücreleri yeniden askıya. </li><li> Fluoresein izotiyosiyanat (FITC) kanal (Şekil 3) kullanılarak 35 akış sitometrisi ile her bir numunenin floresan yoğunluğu ölçülür. Nüfusu yerleştirmek için ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) ayarlayınFarklı özelliklere sahip popülasyonlar birbirinden çözümlenir sağlamak ölçekte faiz. </li><li> Her numune için 10,000 canlı etkinliklerle toplayın ve sadece SOY ile tedavi edilen hücrelere ZiF-EmGFP ile tedavi HeLa hücrelerinde veri analiz yazılımı. 36 Normale floresan flow sitometri kullanarak verileri analiz. </li></ol>

<ol><li>Berg, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+domain+delivery+of+therapeutic+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).</li>
<li>Lindsay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+cell+delivery%3A+application+in+protein+target+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).</li>
<li>Luo, D., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+DNA+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic DNA delivery systems.</a> Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).</li>
<li>Guo, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+nonviral+vectors+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances in nonviral vectors for gene delivery.</a> Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).</li>
<li>Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).</li>
<li>Frankel, A. D., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+of+the+tat+protein+from+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus.</a> Cell. 55, 1189-1193 (1988).</li>
<li>Elliott, G., O'Hare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+trafficking+and+protein+delivery+by+a+herpesvirus+structural+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein.</a> Cell. 88, 223-233 (1997).</li>
<li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).</li>
<li>Smith, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+cationic+cell-permeable+miniature+proteins+via+alpha-helical+arginine+display%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).</li>
<li>Daniels, D. S., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+cell-permeable+miniature+proteins+based+on+a+minimal+cationic+PPII+motif%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).</li>
<li>Karagiannis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+biomimetic+cell+penetrating+peptide+library%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nan%22%5BJournal%5D)">Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library.</a> ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).</li>
<li>Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r,, Banta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+cell+penetrating+peptide+identified+using+a+plasmid+display-based+functional+selection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform.</a> ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).</li>
<li>Fuchs, S. M., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+grafting+to+endow+cell+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Arginine grafting to endow cell permeability.</a> ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).</li>
<li>Cronican, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+delivery+of+functional+proteins+into+mammalian+cells+in+vitro+and+in+vivo+using+a+supercharged+protein%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein.</a> ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).</li>
<li>Panyam, J., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanoparticles+for+drug+and+gene+delivery+to+cells+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).</li>
<li>Zelphati, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+of+proteins+with+a+new+lipid-mediated+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system.</a> J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).</li>
<li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).</li>
<li>Voelkel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+from+retroviral+Gag+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Protein transduction from retroviral Gag precursors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).</li>
<li>Sinha, V. R., Trehan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+microspheres+for+protein+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Biodegradable microspheres for protein delivery.</a> J. Control Release. 90, 261-280 (2003).</li>
<li>Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+TALEN+proteins+via+bioconjugation+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering.</a> PLoS One. 9, e85755(2014).</li>
<li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).</li>
<li>Fuchs, S. M., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyarginine+as+a+multifunctional+fusion+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Polyarginine as a multifunctional fusion tag.</a> Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).</li>
<li>Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+protein+transduction+is+cell+type-dependent+and+is+enhanced+by+dextran+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate.</a> J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).</li>
<li>Al-Taei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+traffic+and+fate+of+protein+transduction+domains+HIV-1+TAT+peptide+and+octaarginine.+Implications+for+their+utilization+as+drug+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors.</a> Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).</li>
<li>Jones, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+cell-penetrating+peptide-mediated+peptide+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery.</a> Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).</li>
<li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 188, 773-782 (2011).</li>
<li>Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+an+enhanced+and+highly+efficient+FokI+cleavage+domain+for+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases.</a> J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).</li>
<li>Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+knockout+by+direct+delivery+of+zinc-finger+nuclease+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins.</a> Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).</li>
<li>Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+zinc+finger+proteins%3A+the+advent+of+targeted+gene+regulation+and+genome+modification+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies.</a> Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+and+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li>
<li>Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in targeted genome editing.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).</li>
<li>Cronican, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+human+proteins+that+deliver+functional+proteins+into+mammalian+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo.</a> Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).</li>
<li>Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+using+Cys2-His2+zinc-finger+domains%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains.</a> ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).</li>
<li>Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+of+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Basics of flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).</li>
<li>Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endogenous+human+gene+expression+by+ligand-inducible+TALE+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors.</a> ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).</li>
<li>Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F. 3rd, Horton, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Aart%2C+a+designed+six-finger+zinc+finger+peptide%2C+bound+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA.</a> J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada, hücre-geçirgen çinko-parmağı (ZiF) sahaları kullanılarak protein temini için adım adım bir protokol verilmektedir. ZiF etki kaynaşık enzimatik yük 34 etkinliğini azaltmaz; üretim ve değişikliğe uğratılmamış proteinle birlikte gözlenenler ile hemen hemen aynı mayalarda proteinlerin saflaştırılması için izin verir; ve geleneksel hücre nüfuz peptid ya da protein transdüksiyon alan sistemleri aşan randımanı olan hücre tiplerinin geniş bir aralığı içine proteinler ve enzimler taşıyabilir. Bununla birlikte, bu bulgular, geniş bir uygulama yelpazesi için hücreler içine doğrudan protein teslim aracılık edecek ZiF alanlarının geniş bir potansiyel göstermektedir. Maksimum proteini dağıtım önce daha büyük bir pozitif yük taşıyan üç ve dört parmak ZiF etki dizileri uzatılmış olmasına rağmen, sadece iki parmak ZiF alanı kullanılarak elde edilmiştir. Bu bulgular ZiF-aracılı hücre giriş ücreti, inc dışındaki faktörlerden etkilendiği olabileceğini göstermektedirProtein stabilitesini veya yapısal rijidite luding. ZiF etki aracılı proteini dağıtım enerji bağımlı olduğu bulunmuştur ve bu nedenle protein ile tedavi edilmiş tüm hücreler 37 ° C&#39;de kuluçkaya yatırılır gerektirir edildi. Çeşitli endositik yollar makropinositoz küçük molekül inhibitörlerinin kullanımı ile, ve daha az bir ölçüde kaveolin bağlı endositoz için ZiF aracılı hücre giriş için ana yolları olarak tespit edilmiştir. 34 Özellikle, diğer protein transdüksiyon sistemlerinden farklı olarak, ZiF alanlardır verimli, kaynaşmış makromoleküler kargo sitozolik teslim yüksek düzeyde aracılık etmek endozomlar kaçan sağlam protein teslim ulaşmak için bu alanların potansiyelini vurgulayan yetenekli. Bizim tecrübelerimize göre, hücrelerin ekim yoğunluğu protein iletimi yüksek düzeyde ulaşmak için kritik bir adımdır. Biz onlar% 80 -90% konfluense ulaştığınızda hücreleri tedavi ve önceden gözlenen tavsiye olduğunu&gt;% 95 confluency gösterisi subfertilitesi numaralı seribaşı hücreleruygun iletim kapasitesi, düşük yoğunluklarda (&lt;% 50) tohumlanmıştır hücre yüzeyi proteini, toksisitesi duyarlı iken. Önemli bir şekilde, yüksek ayırma eğilimi olan hücre tipleri için, hücre kültür plakaları, poli-lisin ile önceden kaplamış olarak tavsiye edilir. Poli-lizin, negatif yüklü hücre yüzeyi bileşenleri ile elektrostatik etkileşimler yoluyla hücre eki kolaylaştırır. Her ZiF etki α-sarmal DNA bağlayıcı kalıntılar DNA tanıma için bir potansiyelini ortadan kaldırmak için kaldırılmış olmasına rağmen, ΒΒα ZiF alanı kat stabilize Zn2 + iyonu ile koordine bir sistein ve histidin kalıntıları gibi kalır. Böylece, herhangi bir depolama tampon protein bütünlüğünü korumak için ZnCİ2 en az 100 uM ile takviye edilmesi önerilir. ZiF etki daha önce hücre tiplerinde çeşitli içine proteinler ve enzimler sunmak için gösterilmekle birlikte, ZiF teslimat etkinliği, aynı zamanda, her iki macromo bağlı olabilirMolecular kargo ve protein konsantrasyonu. Örneğin, hücreler iki parmak ZiF-lusiferaz füzyon proteini ile tedavi edilen hücreler, iki parmak ile muamele sırasında daha yüksek konsantrasyonlarda düştü aktivite ile, 0.5 uM proteini ile tedavi edilen maksimum ışıldamayı görüntülemek için gözlendi EmGFP floresan doza bağımlı bir artış sergiledi yoğunluğu 8.0 mcM protein kadar, ve ardışık protein tedavileri üzerine. Bu nedenle bir konsantrasyon aralığında benzersiz her ZiF etki füzyon hücre delici yeteneğinin değerlendirilmesi önerilir. Henüz ortaya olmamasına rağmen Nihayet, biz ZiF etki teslim hücrelere makromoleküllerin çeşitli bir dizi sunma yeteneğine son derece esnek bir platform olduğunu tahmin. DNA ve RNA hem de kimyasal bir hidrolize edilebilir bağlayıcı vasıtasıyla ZiF etki yüzeyi üzerine fonksiyonalize olarak veya geçici olarak ZiF etki kapsüllenmesi hücrelere transfekte edilmesi için, örneğin, mümkün olabilir. Buna ek olarak, verimlilik veZiF proteini teslim Ensi daha yüzey yükü optimizasyonu odaklanmış rasyonel tasarım çabaları tarafından geliştirilmiş olabilir.

Yüksek verimli ve çok yönlü bir protein teslim stratejileri birçok temel araştırma ve terapötik uygulamalar için kritik öneme sahiptir. hücrelere saflaştırılmış proteinler direkt verilmesi, bunun başarılması için güvenli ve kolay yöntemlerden biri. 1,2 nükleik asitlerin gen ifadesi üzerindeki kullanan stratejiler farklı temsil eder 3-5 proteini dağıtım girmeyle mutagenez riski teşkil bağımsızdır Hücresel transkripsiyon / çeviri makine ve derhal yürürlüğe sağlar. Ancak, proteinlerin üzerine hücre delici aktivitesini endowing basit ve genellenebilir yöntemlerin eksikliği rutin hücre içine doğrudan giriş boşa. Hücre içi protein sağlanmasını kolaylaştırmak için geçerli yöntem, doğal olarak, 6-8 ya da tasarlanan hücre-delici peptidler, 9-12 kompresörlü transdüksiyon etki, 13,14 nano-tanecikleri 15 ve lipozomlar, 16 virüs benzeri partiküller 17,18 meydana kullanımına dayanmaktadır </sup&gt; ve polimerik malzemeler Mikroküre. 19 Ne yazık ki, bu yaklaşımların çoğu düşük hücresel alım oranları, 20,21 yoksul kararlılık, 22 yanlışlıkla hücre tipi özgüllük, 23 düşük endozomal kaçış özellikleri 24 ve ek toksisite. 25 tarafından engellenmektedir, birçok protein iletim teknolojileri teslim proteinlerin biyoaktivitesini azaltır. 14 Biz daha önce laboratuarımızda çinko-parmak nükleazı göstermiştir (ZFN) protein - kimerik kısıtlama programlanabilir Cys 2 -His 2 çinko parmak, DNA bağlama proteini ve Fokl sınırlama endonükleazı 26-28 bölünme alanından oluşan endonükleazlar - doğal olarak hücreye olan geçirgen. 29 Bu şaşırtıcı hücre delici etkinlik özel tasarlanmış çinko-parmak etki, hedeflenen genom tr için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır bir DNA-bağlanma platformun bir içsel özelliği olduğu gösterilmiştirMühendisliði, 30-32 ve kabul protein yüzey altı pozitif yüklü kalıntıların takımyıldızı sonucu olduğu. Gerçekten de, c-Jun N-DEK dahil olmak üzere birçok DNA-bağlama proteinleri,., Hücre zarlarını geçme yeteneği doğuştan gelen bir kapasiteye sahip olduğu gösterilmiştir 33 Daha yakın zamanda, laboratuar Bu sonuçlar genişletilmiş göstermiştir ki, çinko-hücre-delici aktivitesi parmak (ZiF) etki hücre içi protein teslimat için kaldıraçlı olabilir. Bir çok geleneksel hücre nüfuz peptit uygulama sistemlerinin aşıldı verimliliği artışa neden oldu spesifik protein yük için bir ya da iki parmak ZiF etki ya da genetik füzyonu. 34 En önemlisi, ZiF aracılı teslim kaynaşık enzimatik kargo aktiviteyi tehlikeye ve kolaylaştırdı Sitozolik teslimat yüksek düzeyde. Topluca, bu bulgular proteinlerin verimli ve kolay teslim kolaylaştırmak için ZiF etki potansiyelini göstermek ve makro potansiyel olarak daha farklı tiplerihücrelere molekülleri. Burada, memeli hücrelerinde protein temini için ZiF teknolojisi nasıl uygulanacağına ilişkin ayrıntılı adım adım bir protokol verilmektedir. Daha önce bir paketi inşa bir, iki, üç, dört, beş ve altı parmak bağlı α-sarmal DNA bağlayıcı artıkların herbirinin, bir ikame, DNA bağlama yeteneğinden yoksun ZiF etki, ancak hücreler 34 (Şekil 1) içine proteinleri üretmektedirler. İki parmak ZiF etki alanı kullanılarak HeLa hücrelerine Emerald GFP (EmGFP) üretimi ve transdüksiyon tarif edilmektedir. Bu protokol, Escherichia coli içinde çözünür ifade ve hemen hemen her memeli hücre tipinde edebilen hemen hemen herhangi bir protein verecek şekilde uzatılabilir. Beklenen sonuçlar sağlanır ve bu sistemin performansını maksimize etmek için stratejiler de tartışılmıştır.

<table><tbody><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180L</td><td></td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0156L</td><td></td></tr><tr><td>Expand High Fidelity PCR system</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells</td><td>Life Technologies</td><td>EC6028BOX</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>BioRad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Life Technologies</td><td>15224-017</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0391</td><td></td></tr><tr><td>Zinc Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-25</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR-V3151&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose Resin</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td><td>EMO Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Flat Bottom Plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, No Calcium, No Magnesium</td><td>Life Technologies</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>Heparan Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4777</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Nano Drop ND-1000 spectrophotometer&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

direct protein delivery to mammalian cells using cell-permeable cys2-his2 zinc-finger domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

İki parmak ZiF-EmGFP füzyon proteinleri E. ifade edilebilir E. coli,&gt;% 95 homojenlik ve yüksek verimle (&gt; 25 mg / ml) (Şekil 2). Genel bir ve iki parmak ZiF füzyon proteinleri, vahşi tip uğratılmamış proteinin kişilerce hemen hemen aynı miktarlarda üretilebilir. Bununla birlikte, bazı bağlamlarda, beş ve altı parmak ZiF füzyon proteinleri alt baş uygulamalar için yeterince yüksek verimlerle üretilmesi mümkün değildir. 37 ° C&#39;de 90 dakika boyunca, HeLa hücreleri üzerine iki parmak ZiF-EmGFP proteininin doğrudan uygulama EmGFP floresan (Şekil 3A) bir doza bağlı bir artışa yol açar. Kritik olarak, herhangi bir flüoresan ZiF sahasının mevcut olmaması halinde görülmektedir. Daha önce hücrelerin yaklaşık% 100, sadece 2 uM iki parmak ZiF-EmGFP protein ile işlendikten sonra bir floresan olduğu görülmüş ve ZiF füzyon proteini ile muamele edilmiş HeLa hücreleri protein konsantrasyonlarında EmGFP floresan için pozitif olduğu<html> düşük 0.25 uM (Şekil 3B). <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52814/52814fig1.jpg" /> Şekil 1. Yapı ve çinko-parmak protein sekansı. Tek bir çinko-parmak (ZiF) etki (Üst) Kristal yapı. . Zn 2+ ile koordine korunmuş Cys ve O&#39;nun kalıntılarının yan zincirler iyon sopa (PDB ID: 2I13) olarak gösterilmiştir ZiF etki 37 (Alt) Dizi. Oklar ve silindirler, sırasıyla, Β-sac ve α-sarmal ikincil yapılar gösterir. alanin ile ikame edilmiştir α-sarmal DNA bağlayıcı kalıntılar pembe vurgulanır. Hücre içselleştirilmesi aracılık tahmin pozitif yüklü kalıntılar açık mavi vurgulanır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52814/52814fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> &quot;Fo: keep-together.within-sayfa =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52814/52814fig2.jpg" /> Bir, iki, üç ve dört parmak ZiF-EmGFP füzyon proteinlerini kapsamına almaktadır. ZiF-EmGFP füzyon proteinleri E. ifade Saflaştırılmış Şekil 2. SDS-PAGE E. coli ve Ni-NTA agaroz reçinesine ile saflaştırılmıştır. Elüt edilen protein,% 4% 20 Tris-Glisin jel ile SDS-PAGE ile saflık için analiz edilmiştir. Önemli bir bozulma veya ZiF-EmGFP füzyon proteinlerinin kesilmeleri gözlenmiştir. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52814/52814fig3.jpg" /> Şekil 3. HeLa hücrelerine protein verilmesinin ZiF aracılı. Iki parmak ZiF-EmGFP proteininin artan miktarları ile tedavi edilmiş HeLa hücrelerinde (A), flüoresan yoğunluğu. EmGFP proteini ile muamele edilmiş HeLa hücreleri, tek başına muamele edilmemiş hücreler ile tamamen üst üste gelir. (B) 2 uM o ile arka arkaya muamele edilmiş HeLa hücrelerinin Normalleştirilmiş florasan yoğunluğuf iki parmak ZiF-EmGFP proteini. Flüoresan yoğunluğu akış sitometresi ile tespit edildi.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains at JoVE.com

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Çinko-Parmak etki doğal olarak hücre-geçirgen ve memeli hücre türlerinin geniş bir aralığı içine protein verilmesinin aracılık edebilmektedir. Burada, hücre içi protein teslimat için çinko-parmak teknolojisi uygulanması için ayrıntılı bir adım-adım protokolü sunulmuştur.

Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim<sub&gt; 2</sub&gt; His<sub&gt; 2</sub&gt; Çinko-parmak Alanlar

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

direct-protein-delivery-to-mammalian-cells-using-cell-permeable-cys2

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

9.9K Görüntüleme.  The Scripps Research Institute.  Çinko-Parmak etki doğal olarak hücre-geçirgen ve memeli hücre türlerinin geniş bir aralığı içine protein verilmesinin aracılık edebilmektedir. Burada, hücre içi protein teslimat için çinko-parmak teknolojisi uygulanması için ayrıntılı bir adım-adım protokolü sunulmuştur. 

Video: Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Peptit kaynaklı Yöntem Bitkiler Genler ve Proteinler Hücresel karşısında ve Organel Engeller Transport

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Genetik

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Biyokimya

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Biyomühendislik

Engineering Intracellular Protein Sensors in Mammalian Cells

Proteins can function as biomarkers of pathological conditions, such as neurodegenerative diseases, infections or metabolic syndromes. Engineering cells to sense and respond to these biomarkers may help the understanding of molecular mechanisms underlying pathologies, as well as to develop new cell-based therapies. While several systems that detect extracellular proteins have been developed, a modular framework that can be easily re-engineered to sense different intracellular proteins was missing.
Here, we describe a protocol to implement a modular genetic platform that senses intracellular proteins and activates a specific cellular response. The device operates on intracellular antibodies or small peptides to sense with high specificity the protein of interest, triggering the transcriptional activation of output genes, through a TEV protease (TEVp)-based actuation module. TEVp is a viral protease that selectively cleaves short cognate peptides and is widely used in biotechnology and synthetic biology for its high orthogonality to the cleavage site. Specifically, we engineered devices that recognize and respond to protein-biomarkers of viral infections and genetic diseases, including mutated huntingtin, NS3 serine-protease, Tat and Nef proteins to detect Huntington&#8217;s disease, hepatitis C virus (HCV) and human immunodeficiency virus (HIV) infections, respectively. Importantly, the system can be hand tailored for the desired input-output functional outcome, such as fluorescent readouts for biosensors, stimulation of antigen presentation for immune response, or initiation of apoptosis to eliminate unhealthy cells.

<meta charset="utf8"></head><body>Memeli Hücrelerinde Hücre İçi Protein Sensörlerinin Mühendisliği

Here, we present a protocol for engineering genetically-encoded intracellular protein sensor-actuator(s). The device specifically detects target proteins through intracellular antibodies (intrabodies) and responds by switching on gene transcriptional output. A general framework is built to rapidly replace intrabodies, enabling rapid detection of any desired protein, without altering the general architecture.

Memeli Hücrelerinde Hücre İçi Protein Sensörlerinin Mühendisliği

Proteins can function as biomarkers of pathological conditions, such as neurodegenerative diseases, infections or metabolic syndromes. Engineering cells ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the efficiency with which macromolecules penetrate the cytosolic space of cells. Recently, we have circumvented this problem by identifying the reagent dfTAT, a disulfide bond dimer of the peptide TAT labeled with the fluorophore tetramethylrhodamine. We have generated a fluorescently labeled dimer of the prototypical cell-penetrating peptide (CPP) TAT, dfTAT, which penetrates live cells and reaches the cytosolic space of cells with a particularly high efficiency. Cytosolic delivery of dfTAT is achieved in multiple cell lines, including primary cells. Moreover, delivery does not noticeably impact cell viability, proliferation or gene expression. dfTAT can deliver small molecules, peptides, antibodies, biologically active enzymes and a transcription factor. In this report, we describe the protocols involved in dfTAT synthesis and cellular delivery. The manuscript describes how to control the amount of protein delivered to the cytosolic space of cells by varying the amount of protein administered extracellularly. Finally, the current limitations of this new technology and steps involved in validating delivery are discussed. The described protocols should be extremely useful for cell-based assays as well as for the ex vivo manipulation and reprogramming of cells.

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Endosomolitik Reaktif dfTAT ile kuluçkaya yatırılması ile Canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

Mühendislik Hücre geçirgen Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

Biyoloji

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.

We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.

Memeli hücrelerinde İnsan Granzymes bir Yüksek Verimli ve Maliyet-etkin İfade Sistemi

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Peptit kaynaklı Yöntem Bitkiler Genler ve Proteinler Hücresel karşısında ve Organel Engeller Transport

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

Memeli Hücrelerinde Hücre İçi Protein Sensörlerinin Mühendisliği

Memeli Hücrelerinde Hücre İçi Protein Sensörlerinin Mühendisliği

Endosomolitik Reaktif dfTAT ile kuluçkaya yatırılması ile Canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi

Mühendislik Hücre geçirgen Protein

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

Memeli hücrelerinde İnsan Granzymes bir Yüksek Verimli ve Maliyet-etkin İfade Sistemi