Name: development of a quantitative recombinase polymerase amplification assay with an internal positive control
Uploaded: 2015-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control at JoVE.com

Bu araştırma Küresel Sağlık Girişimi Grand Zorluklar ile Bill &amp; Melinda Gates Vakfı hibe ile finanse edildi.

<ol>
	<li>Yoon, J. -. Y., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-Chip+Pathogen+Sensors+for+Food+Safety.">Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety.</a> Sensors. 12 (8), 10713-10741 (2012).</li><li>Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptosporidium+parvum+and+Cyclospora+cayetanensis:+A+review+of+laboratory+methods+for+detection+of+these+waterborne+parasites.">Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (3), 209-224 (2002).</li><li>Sedlak, R. H., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+diagnostics+in+the+era+of+digital+polymerase+chain+reaction.">Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).</li><li>Asiello, P. J., Baeumner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+isothermal+nucleic+acid+amplification,+a+review.">Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review.</a> Lab on a Chip. 11 (8), 1420-1430 (2011).</li><li>Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+detection+using+recombination+proteins.">DNA detection using recombination proteins.</a> PLoS Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).</li><li>Kr&#245;lov, K., Frolova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+Rapid+Detection+of+Chlamydia+trachomatis+by+Recombinase+Polymerase+Amplification+Directly+from+Urine+Samples.">Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples.</a> The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16 (1), 127-135 (2014).</li><li>Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a., Puchades, R., Maquieira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinase+polymerase+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay+as+a+DNA+amplification-detection+strategy+for+food+analysis.">Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis.</a> Analytica Chimica Acta. 811 (1), 81-87 (2014).</li><li>Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Plasmodium+falciparum+with+isothermal+recombinase+polymerase+amplification+and+lateral+flow+analysis.">Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis.</a> Malaria Journal. 13 (1), 99 (2014).</li><li>Crannell, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+test+to+diagnose+cryptosporidiosis:+lab+assessment+in+animal+and+patient+specimens.">Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2565-2571 (2014).</li><li>Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paper+and+plastic+device+for+performing+recombinase+polymerase+amplification+of+HIV+DNA.">A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA.</a> Lab on a Chip. 12 (17), 3082 (2012).</li><li>Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+aptamer-based+bio-barcode+assay+with+isothermal+recombinase+polymerase+amplification+for+cytochrome-c+detection+and+anti-cancer+drug+screening.">An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening.</a> Talanta. 115 (1), 159-165 (2013).</li><li>Euler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+panel+of+recombinase+polymerase+amplification+assays+for+detection+of+biothreat+agents.">Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1110-1117 (2013).</li><li>Abd El Wahed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portable+reverse+transcription+recombinase+polymerase+amplification+assay+for+rapid+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus.">A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus.</a> PloS One. 8 (8), e71642 (2013).</li><li>Escadafal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Molecular+Assays+for+the+Detection+of+Yellow+Fever+Virus+in+Low-Resource+Settings.">Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (3), e2730 (2014).</li><li>Hutson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T.+gondii+RP+Promoters+&amp;+Knockdown+Reveal+Molecular+Pathways+Associated+with+Proliferation+and+Cell-Cycle+Arrest.">T. gondii RP Promoters &amp; Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest.</a> PLoS ONE. 5 (11), 15 (2010).</li><li>Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+detection+of+artificial+replication-competent+lentivirus+of+altered+host+range.">Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 118-129 (2003).</li><li>Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+HIV-1+DNA+using+Real-Time+Recombinase+Polymerase+Amplification.">Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), (2014).</li><li>Sollis, K. a., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review+of+the+performance+of+HIV+viral+load+technologies+on+plasma+samples.">Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples.</a> PloS one. 9 (2), e85869 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. , 1-166 (2011).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

İstendiğinde MATLAB algoritması kullanarak anlamlı ölçüm verileri elde etmek için, kullanıcı uygun giriş değerlerini seçmeniz gerekir. Bölüm 5 ve 6 her komut başlatılması sonra, tüm giriş değişkenleri otomatik olarak komut penceresinde İstenen ve çıkışlar otomatik olarak oluşturulur. Bölüm 5.7 kullanıcı bir yamaç eşiğini seçmesi istenir. yamaç eşik değeri uyum korelasyon katsayısı (r 2) karesini etkiler. Bir termal döngü ihraç ham floresan verileri kullanırken, 2.0 ve 5.0 arasındaki değerler yüksek r 2 katsayısı elde etmek eğilimindedir. Bölüm 5.8 kullanıcı pozitif eşiğini ayarlamak için arka plan üzerinde standart sapma sayısını belirlemeniz gerekir. Pozitif veya negatif bir örnek puan için, komut otomatik olarak TES ihraç ham floresan verilerini kullanarak her bir numune için maksimum ve minimum floresan arasındaki fark Δ örneği belirlerl cycler. Tüm hedefsiz kontrol örnekleri için ortalama fark Δ arka plan ve standart sapma σ arka plan hesaplar. Δ Δ örnek arka plan üzerinde σ arka × z daha fazla ise bir numune pozitif kabul edilir. Bölüm 5.10 varsayılan kullanıcı eşiği kullanabilir veya yeni bir eşiği belirlemek için karar verir. Kullanıcı yeni eşiğini ayarlamak istediğinde, deneysel olarak bir HİV-1, DNA mevcut olmadan 3 deneyler, her biri 12 RPA reaksiyonları yapılarak yeni eşiği belirlenir. Bu deneylerde, artı 3 standart sapma ile ilgili floresan yoğunluğu ortalama artışa eşik ayarlayın. Bölüm 6 tamamladıktan sonra, komut JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m otomatik (log10 kopya olarak) her qRPA reaksiyonu için tahmini DNA konsantrasyonu döndürür. Komut herhangi bir HIV-1 DNA örneğinde mevcut olduğunu belirlerse, tahmin edilen konsantrasyon ya da &quot;Ne olarak listelenirİç pozitif kontrol için floresan sinyal bağlı olarak geçersiz HIV gatif &quot;veya&quot;, &quot;(σ arka + Δ arka × z) eşiği aştı. Kullanıcı bilinen örnek konsantrasyonları standart eğri doğrulama ise, komut dosyası da Tablo 1 benzer bir ek tablo dönecektir. Doğru ölçümünü sağlayan bir gerçek zamanlı RPA test geliştirmek için, deneysel tutarlılık önemlidir. Örneğin, standart eğrinin ve doğrulama deneyleri için aynı primer ve prob alikotları kullanır. Ayrıca deneyler arasında, 4 ° C &#39;de, primer ve prob alikotları depolamak yerine -20 ° C ile donma-erime döngülerinden kaçınmak. Standart eğri ve doğrulama deneyleri için kullanılan şablon alikotları aynı şekilde saklanır. Aynı partiden RPA enzim pelet ve reaktifler üretici tavsiyelerine göre kullanılır. Son olarak, becaRPA tam büyütme oranını kontrol etmek gerçek &#39;döngüleri&#39; yoksun kullanmak, kullanıcı adımlar standardizasyon kesinlikle şarttır. Reaksiyonları montaj, kullanıcı her zaman her adımda yaklaşık aynı süreyi harcama, aynı sırayla, aynı adımları izlemeniz gerekir. Reaksiyonlar her zaman yeni bir pipet ucu ile hafifçe karıştırılmış olması ve kabarcıklar her zaman giderilmelidir. Amplifikasyon önce reaksiyonlar tutarlı bir sıcaklıkta tutulmalıdır, ve termal döngü veya mikroskop yazılımı her zaman ölçümü etkileyebilecek sub-optimal sıcaklıklarda herhangi yükselmesini önlemek tepkileri yüklemeden önce hazırlanmış olmalıdır. İlk reaksiyon koşullarında herhangi bir değişiklik deneysel sonuçlarda tutarsızlık yol açabilir. Veri toplamak için bir mikroskop kullanılarak, ilave değişkenler, flüoresan yoğunluğundaki varyasyonu en aza indirmek için kontrol edilmelidir. Bütün reaksiyonlar aşama ısıtıcıda, aynı bölgede yerleştirilmiş ve microsco olmalıdırpe her numune için kuyunun aynı bölgede odaklanmış olması gerekir. Bu uygulamalar takip bile, bir mikroskop toplanan floresan verileri nedeniyle doğal uyarma ışık tekrarlanan maruz kalma sonucu RPA reaksiyonlar, reaksiyon odaları içinde kabarcık oluşumu, ya photobleaching sırasında oluşturan yerel parlak noktalar değişkenlik gösterebilir. Bu değişkenlerin etkileri temel değişkenliği, tepe ve düşük değerleri göstermektedir mikroskobu (Şekil 4A ve 4B) üzerinde toplanan floresan verileri belirgindir. Bu özellikler, termal döngü (Şekil 3A ve 3B) üzerinde toplanır floresan verilerinden yoktur. Sonuçta, mikroskop veri toplama, sadece proof-of-prensibi amaçlıdır ve son tahlil daha hassas geometri ve bu değişkenleri en aza indirir yazılım kontrolü ile alan çalıştırılabilen floresan okuyucu uygulanacaktır. Bir başka önemliqRPA tahlil geliştirme sürecinin yönü veri işleme tutarlılık olduğunu. yöntemler bölümünde tarif edilen protokol, bir termal döngü cihazı ve mikroskop toplanan (bir tablo dosyası halinde) ham floresans verilerini işlemek için komut kullanır. Standart eğri oluşturmak için kullanılan tüm deneyler aynı biçimlendirilmiş olması gerekir. Veri toplamak için bir termal döngü kullanırken, aynı plaka düzeni kullanılmalıdır, ve RPA reaksiyonları içermeyen kuyulardan elde edilen veriler ihraç olmamalıdır. Veri toplamak için bir mikroskop kullanılarak zaman, veri formatı otomatik termal döngü ihraç verilerin biçimini eşleşmelidir. D61, E2: hücrelerinde D2 olmalıdır şablon konsantrasyonları artırmak için C61 ve veri Örneğin, hedefsiz kontrol veri hücreleri C2 olması gereken bir deneyde her bir konsantrasyonu birden fazla kez tekrar varsa E61, vb 2. çoğaltma seyreltme serisi yüksek konsantrasyona kadar bir hedef kontrolü (NTC) soldan sağa doğru sipariş edilir ve1 st hemen sağındaki sütunlarda kayıtlı seyreltme serisi çoğaltmak. Örneğin, 2 ile Bölüm 1.2&#39;de kullanılan plaka taslağına seyreltme serisi, her numunenin 1 deney için floresan veri hücreleri C2 kaydedilmelidir, her bir örnek için çoğaltır: H61 ve floresan verileri her bir numune 2 suret halinde için seyreltme serisi hücreleri I2 kaydedilmiş olması gerekir: N61. Bölüm 1.2&#39;de kullanılan plaka düzeni için, bu bir elektronik tabloya termal döngü yazılımı veri dışa aktarırken biçimlendirme varsayılan. HIV-1 qRPA deneyler sağlanan Temsilcisi veriler RPA bilinmeyen örneklerde nükleik asit konsantrasyonunun ölçümü için kullanılan olabilir kanıtı-of-concept desteğini göstermektedir. Klinik yararlı HIV-1 viral yük testleri büyüklüğü en az 4 siparişler bir klinik yelpazede, 0.5 log10 kopya hassasiyet ve en az 200 kopya 19,20 sınırı-of-algılama var. Tanımlanan HIV-1 DNA testi, bu cr uyguniteria ve Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi, düşük konsantrasyonlarda, en doğrudur. Bu nedenle, bir ters transkriptaz aşamasının dahil edilmesi ile, bu sonuçlar, bir HIV-1 RT-RPA deney HIV-1 virüs yükünü ölçmek için bir potansiyele sahip olabileceğini düşündürmektedir Klinik örnekler. Algoritma parametreleri ayarlayarak, bir qRPA tahlili geliştirirken ayar klinik ihtiyaçlara bağlı olarak hassasiyet ve lineer dinamik aralık olabilir. 6 (pozitif örnekler için eşiğini belirleyen bir parametre) z ayar düşük ve yüksek duyarlılık ve doğruluk etkileyebilir ki göstermektedir Hedef konsantrasyonları. Bundan başka, bu şekilde amplifikasyonun hızının düşürülmesi, daha düşük bir sıcaklıkta kuluçkaya tepkileri ya da daha az magnezyum asetat kullanılarak miktar çözünürlük ve doğruluğunu arttırmak mümkün olabilir. Kavram qRPA Analizin bu kanıtı, HIV-1 DNA ihtiva eden örneklerinin konsantrasyonunu ölçmek için kullanılabilir. Bu ma tarif qRPA deneyinuscript, gerçek zamanlı RPA reaksiyonları araya geliştirmek ve bir IPC ekran ve bilinmeyen örnekleri ölçmek için kullanılan bir standart eğri oluşturmak için ham floresan verilerin nasıl işleneceğini ayrıntılı talimatlar içerir. Ayrıntılı talimatlar birlikte bu protokol örnekleri, çok çeşitli DNA konsantrasyonu ölçmek için adapte edilmiş olabilir.

Kantitatif nükleik asit amplifikasyon çevre, gıda kaynaklı ve su patojenlere tespiti için hem de klinik teşhis için önemli bir tekniktir. Gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), HİV-1 virüs yük testi, bakteriyel patojenlerin saptanması, ve bir çok diğer organizmalar 1 taranması için, örneğin nükleik asitlerin, duyarlı, spesifik, ve nicel tespiti için altın standart yöntemdir - 3. Gerçek zamanlı qPCR sırasında primerler döngülerinde patojen DNA&#39;yı çoğaltmak ve bir flüoresan sinyal her bir döngüde numunede büyütülmüş DNA miktarı ile orantılı olduğundan oluşturulur. Patojen DNA&#39;ya ait, bilinmeyen bir konsantrasyonunu ihtiva eden bir numune standart örneklerinin ilk DNA konsantrasyonuna ve flüoresan sinyal belirli bir eşiğe ulaştığı zaman (yani, çevrim eşiği, veya C, T) ile ilgilidir, bir standart eğri kullanılarak ölçülebilir. <p class=Gerçek zamanlı qPCR bu rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (ECP) olarak sonuçlar, alternatif izotermal amplifikasyon teknikleri almak için pahalı termal döngü cihaz ve birkaç saat gerektirirken, çünkü &quot;jove_content&quot;&gt; 4 geliştirilmiştir. Bu platformlar genellikle daha hızlı sonuç sağlar ve daha az pahalı, basit ekipmanla gerçekleştirilebilir bir alt, bir sıcaklık, bir nükleik asitleri amplifiye. Nokta-bakım uygulamaları için özellikle çekici dakika içinde DNA güçlendirir RPA, düşük büyütme sıcaklığı (37 ° C) gerektirir, ve kirliliklerin 5,6 varlığında aktif kalır. 12 - RPA tahlilleri biothreat maddeler 7&#39;nin gıda maddesi analizi, patojenin tespit edilmesi, kanser ilaç tarama ve saptama da dahil olmak üzere, geniş bir uygulama yelpazesi için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, nükleik asitlerin ölçümü için RPA kullanımı 13,14 sınırlıdır. Bir önceki çalışmada, bu sho olduwn gerçek-zamanlı kantitatif RPA (qRPA) 15 mümkündür. Burada daha ayrıntılı bir protokol bir standart eğri, QPCR kullanılarak miktar tayini için benzer bir yöntemi kullanarak bilinmeyen örnekleri ölçmek için gerçek zamanlı kantitatif RPA ile sağlanır. Bu protokol düzgün çalışıp sistemi sağlamak için bir iç pozitif kontrol (IPC) geliştirmek için nasıl yanı sıra, bir proof-of-concept olarak, HIV-1 DNA tespiti için termal döngü bir RPA reaksiyonu gerçekleştirmek açıklamaktadır. Eğitim verileri kullanarak standart bir eğri oluşturmak için bir termal döngü veya mikroskop ve veri analizi kullanılarak veri toplama da ayrıntılı. Son olarak, özel bir komut dosyası ile standart eğri kullanılarak bilinmeyen örnekleri ölçülmesi için bir yöntem gösterilmiştir. Bu qRPA tekniği bilinmeyen konsantrasyonları ile numunelerin miktarının sağlayan ve geleneksel gerçek zamanlı qPCR üzerinden pek çok avantajı vardır.

<table><tbody><tr><td>qRPA Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 forward primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom DNA oligos</td><td>5&amp;rsquo;-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HIV-1 reverse primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom DNA oligos</td><td>5&amp;rsquo;-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HIV-1 probe</td><td>BioSearch Technologies&amp;nbsp;</td><td>custom DNA oligos</td><td>5&amp;rsquo;- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>IPC probe</td><td>BioSearch Technologies&amp;nbsp;</td><td>custom DNA oligos</td><td>5&amp;rsquo;-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate</td><td>TwistDx</td><td>TwistAmp exo</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube strips</td><td>BioRad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>PCR flat cap tube strips</td><td>BioRad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>Micro-seal adhesive</td><td>BioRad</td><td>558/MJ&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFP&amp;Delta;Env&amp;Delta;Vif&amp;Delta;Vpr)</td><td></td><td></td><td>custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. &amp;amp; Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118&amp;ndash;129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).</td></tr><tr><td>Human male genomic DNA</td><td>Applied Biosystems</td><td>360486</td><td></td></tr><tr><td>96 well cold-block</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-36700-48</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>MiniFuge</td><td>VWR</td><td>93000-196</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer 1.0 M, pH 8.0</td><td>EMD Millipore</td><td>648314</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td><td>Promega</td><td>V4321</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>IPC Development</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryptosporidium parvum IPC template</td><td>Waterborne Inc</td><td>P102C</td><td>It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1</td></tr><tr><td>PCR long forward primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom DNA oligos</td><td>5&amp;rsquo;-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>PCR long reverse primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom DNA oligos</td><td>5&amp;rsquo;- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelty DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X buffer</td><td>EMD Millipore</td><td>574797</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Experiments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upright fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Imager.J1</td><td></td></tr><tr><td>Stage heater</td><td>Bioscience Tools</td><td>TC-GSH</td><td></td></tr><tr><td>1-Channel Precision High Stability Temperature Controller</td><td>Bioscience Tools</td><td>TC-1100S</td><td></td></tr><tr><td>FAM/GFP filter cube</td><td>Zeiss</td><td>filter set 38 (000000-1031-346)</td><td>excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm</td></tr><tr><td>HEX filter cube</td><td>Chroma</td><td>49014</td><td>excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm</td></tr><tr><td>Laser cutter</td><td>Engraver&#039;s Network</td><td>VLS3.60</td><td></td></tr><tr><td>1/8&quot; black acrylic</td><td>McMaster Carr</td><td>8505K113</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm clear acrylic</td><td>McMaster Carr</td><td>PD-72268940&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Office Depot</td><td>Duro super glue&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PCR grade mineral oil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8662-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Data Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATLAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB script: &quot;JoVE_qRPA_standard_curve.m&amp;rdquo;</td><td>Included in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB script: &quot;JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m&amp;rdquo;</td><td>Included in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB script: &quot;JoVE_real_time_intensity_to_excel.m&amp;rdquo;</td><td>Included in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_well.ai</td><td>Included in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_base.ai</td><td>Included in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioVision software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_AxioVision_Script.ziscript</td><td>Included in SI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

development of a quantitative recombinase polymerase amplification assay with an internal positive control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Hedefle qRPA deneylerde IPC olarak hizmet etmek üzere bir dizi seçmeden önce (HIV-1), DNA, dahili pozitif kontrol (IPC) adayları yukarıda anlatıldığı ve HIV-1 DNA mevcut olmadan qRPA reaksiyonlarda amplifiye etme kabiliyetleri açısından tarandı. IPC aday hedef (HİV-1) üzerinden rekabet eden HIV-1 amplikon oluşumunu IPC oluşumunu önlemek için, DNA daha uzundur. Şekil 2A, iki C nesil gösterildiği gibi Parvum IPC aday jel elektroforezi kullanılarak 415 ve 435 bp&#39;lik bantların mevcudiyeti ile teyit edilmiştir. 10. 4 ile 10 5 kopya toplam (Şekil 2C), mevcut olduğu zaman daha fazla aday sürekli büyütülmüş ise qRPA reaksiyonlarda, kısa IPC aday küçük amplifikasyon (Şekil 2B) sergilemiştir. Bu nedenle, daha fazla aday, HIV-1 qRPA deneyler IPC olarak seçilmiştir. Gerçek zamanlı qRPA tek başına ilgi hedef kullanarak veya kullanılarak gerçekleştirilebilirHedef ve IPC hem. Şekil 3, HIV-1 DNA ve C ikisini de kullanarak termal döngü bir deney göstermektedir Parvum IPC. Bu deneyde, IPC DNA 2.6 X 10 4 kopya HIV-1 hedef DNA saptama limitini yönde etkilenmekten kaçınmak için, her bir reaksiyon, saptama IPC sınırına yakın bir konsantrasyona kadar ilave edildi. Gerçek zamanlı, HIV-1, DNA üretimi için karşılık gelen bir HEX floresan verilerini gösterir, Şekil 3A&#39;da gösterildiği gibi, saptanabilir amplifikasyon başladığı zaman ilk hedef konsantrasyonu ile ters orantılıdır. Amplifikasyon, HIV-1 DNA &#39;sının düşük konsantrasyonları için daha önce HIV-1 DNA yüksek konsantrasyonlarda ve daha belirgindir. Başlangıç ​​IPC konsantrasyonu bütün örneklerde aynı olduğu için t IPS DNA üretimi için karşılık gelen FAM floresan verilerini gösterir Şekil 3B&#39;de gösterildiği gibi tersine, IPC DNA tespit amplifikasyonu, yaklaşık aynı zamanda başlarAynı deneyi diye. IPC floresan üretme oranı nedeniyle, amplifikasyon sırasında rekabeti, HIV-1 DNA konsantrasyonu ile ters orantılıdır. QRPA reaksiyonları bir alan çalıştırılabilen floresan okuyucu geliştirilmesi amacı ile, qRPA deneyleri, bir sahne ısıtıcı ve 1-Kanal Precision Yüksek Kararlılık sıcaklık denetleyicisi ile dik bir floresan mikroskop üzerinde gerçekleştirilebilir. Şekil 4A ve 4B, görüntüleme HEX ve FAM florasan verileri toplanır Bir mikroskop. Lazer kesim yongaları kullanarak mikroskop toplanan veriler temel floresan ve photobleaching bağlı olabilir tepe ve çukurların hafif değişkenlik göstermektedir. Ancak, komut dosyası ilk amplifikasyon meydana geldikten sonra floresan taban floresans veya farklılık etkilenmez ilk amplifikasyon dönemi boyunca floresans değişimin hızı kullanılarak çevrim eşiğini tayin eder. Fi görüldüğü gibi,saat&#39;in 4C, bu deneyden elde edilen dahili standart bir eğri 0.990 bir r&#39;nin 2 katsayısına sahiptir. Özellikle, IPC, HIV-1 DNA &#39;sının düşük konsantrasyonları için yükseltilir. Bu davranış, termal döngü üzerinde yapılan deneylerden farklı olsa da, tüm numuneler yine de bu yöntemi kullanarak geçerli olarak sınıflandırılır. Bilinen bir hedef konsantrasyonu kullanılarak çoklu deneylerden elde edilen veriler daha sonra analiz performansını değerlendirmek veya bilinmeyen konsantrasyonlarda örnekler ölçmek için kullanılabilecek bir standart eğri, oluşturmak için derlenebilir. 5 komut kullanılarak oluşturulan beş deney ve üstel standart eğrinin verileri göstermektedir saptanabilir amplifikasyon başladığı hangi zaman ilk HIV-1 hedef konsantrasyonu ile ilgili &quot;JoVE_qRPA_standard_curve.m&quot;. 5 Şekil standart bir eğri oluşturmak için 5 ayrı deneyler, her şablon konsantrasyonda içeren her 2 qRPA reaksiyonları kullanılır. Üslü Notuygun 0,959 yüksek r2 katsayısına sahiptir. Standart eğri, sonra komut &quot;JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m&quot; yazısı. Tablo 1, Şekil 5&#39;in standart eğri kullanılarak 5 ek deneyler için ölçüm sonuçlarını göstermektedir kullanılarak deney doğrulama için konsantrasyonu bilinen Ek örnekler konsantrasyonunu tahmin etmek için kullanıldı. Not algoritması doğru olarak olumsuz hiçbir hedef kontrol numunelerinin 10 üzerinden olumlu ve 9 HIV-1 DNA içeren tüm örnekleri sınıflandırılmış. Buna ek olarak, ortalama öngörülen konsantrasyon doğru konsantrasyon seviyesi ve tahmin edilen konsantrasyonları için standart sapmanın bir sipariş az 0,5 log 10 (reaksiyon başına kopya) oldu içinde oldu. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52620/52620fig1highres.jpg" /> Şekil 1:. Kantitatif RPA DNA hedeflerinin blok şeması qrpBir deney, (&quot;RPA ileri&quot; ve &quot;RPA geri&quot;) bağlama primerleri özdeş dizilerin yer aldığı, iki DNA dizilerini amplifiye eder. Amplifiye edilmiş diziler &quot;, HIV-1 prob&quot;, 2) bir iç pozitif kontrol dizisine (&quot;IPC (C. Parvum)&quot;) ile tespit edilir 1), HIV-1 geninin (&quot;HIV-1&quot; içinde bir sekansı) olarak &quot;. IPC prob&quot; ile tespit edilir, her reaksiyonda yer IPC C&#39;ye tamamlayıcı bir bölgeyi ihtiva şablon ve primerler (&quot;ileri PCR&quot; ve &quot;PCR ters&quot;) olarak Cryptosporidium parvum genomunu kullanarak PCR ile üretildi parvum (mor) ve HIV-1 (mavi) tamamlayıcı bir bölge. Başlangıçta Analitik Kimya 2014 yılında yayınlanan figür, izni 9 ile burada yeniden. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52620/52620fig2.jpg" /> Şekil 2: <strong&gt; IPC adaylarının taranması. (A), iki IPC aday (&#39;ileri Kısa&#39; ve &#39;ileri uzun&#39;) ve bilinen bir PCR pozitif kontrol sekansı PCR kullanılarak üretilir ve 415 bp ve 435 bp bandı görünmüştür bir agaroz jeli üzerinde görselleştirilmiştir . 10 4 10 5 kopya toplam mevcut iken (C) uzun IPC adayı sürekli güçlendirilmiş ise (B) kısa IPC adayı, gerçek zamanlı RPA sırasında küçük amplifikasyon sergiledi. Aslında burada izni 9 ile yeniden basıldı Analitik Kimya 2014, yayınlanan figür. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52620/52620fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52620/52620fig3highres.jpg" /> Şekil 3: ko-amp sırasında oluşan tipik ham floresan verileribir termal döngü cihazı, HIV-1 DNA ve IPC lification. HIV-1, tespit amplifikasyon başlangıcı için, (A), HEX floresan belirgin bir artış ile gösterilen, HİV-1 DNA&#39;nın yüksek konsantrasyonları için daha önce ortaya çıkar. IPC FAM floresan belirgin bir artış ile gösterilen tespit büyütme, başlangıç ​​için (B) bağımsız olarak, HIV-1, DNA konsantrasyonunun yaklaşık aynı zamanda meydana gelir. Bununla birlikte, FAM floresan üretme oranı rekabet nedeniyle, HIV-1 DNA mevcut miktarı ile ters orantılıdır. Başlangıçta Analitik Kimya 2014 yılında yayınlanan figür, izni 9 ile burada yeniden. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52620/52620fig4highres.jpg" /> Şekil 4: Bir mikroskop HİV-1 DNA ve IPC amplifikasyonuna sırasında üretilen tipik ham flüoresans verileri, (A) t üretilen veriler benzer.O termal döngü, HEX floresan belirgin bir artış ile gösterilen tespit HİV-1 amplifikasyon başlangıcı, HIV-1 DNA yüksek konsantrasyonları için daha önce ortaya çıkar. FAM floresan gösterilen mikroskop (B) IPC büyütme, yüksek HIV-1 DNA konsantrasyonları ile örneklerinde düşük HIV-1 DNA konsantrasyonları için belirgin ama her zaman açıktır. (C) standart bir eğri yüksek r 2 katsayısı verir JoVE_standard_curve.m komut kullanılarak inşa edilebilir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52620/52620fig5highres.jpg" /> Şekil 5:., HIV-1 için tipik bir standart eğri JoVE_standard_curve.m komut kullanılarak, ham HEX flüoresans verileri, HIV-1 ile genişletilmesi sırasında üretilen bilinmeyen HIV-1 DNA konsantrasyonu tahmin etmek için kullanılabilecek standart bir eğri oluşturmak için işlenir örnekler. Bu standart eğri (z = 1) 5 experim verileri kullanılarak oluşturulanhastalar, burada 6 konsantrasyonları, her bir konsantrasyonda 2 tekrarı kullanılarak test edilmiştir. Tüm konsantrasyonlar log10 kopya verilmiştir. Başlangıçta Analitik Kimya 2014 yılında yayınlanan figür, izni 9 ile burada yeniden. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52620/52620fig6highres.jpg" /> Şekil 6:. Algoritma ayarlanabilirliği algoritması parametreleri ayarlama bilinmeyen numunelerin konsantrasyonunu tahmin için kullanılan standart eğri değiştirir. JoVE_validation_and_quantification.m komut z = 1 (kırmızı) ve z, = 5 (mavi) ile bilinmeyen numune konsantrasyonunu tahmin etmek için kullanıldı. Tüm konsantrasyonlar log10 kopya verilmiştir. Tahminler düşük DNA konsantrasyonları için daha doğru z = 1; tahminler algoritma parametreleri ayarlayarak z = 5., qRPA standart eğri klinik ihtiyaçlarına göre ayarlanmış olabilir yüksek DNA konsantrasyonları için daha doğru. ŞekilBaşlangıçta, Analitik Kimya 2014 yılında yayınlanan izni 9 ile burada yeniden. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Örnek Konsantrasyonu </td><td> Ortalama Öngörülen Konsantrasyon </td><td> Standart Sapma </td><td> Pozitif olarak Belirlenen Örneklerin Yüzde </td></tr><tr><td> Hiçbir hedef kontrolleri </td><td> 0.1 </td><td> 0.3 </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.9 </td><td> 0.1 </td><td> % 100 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 2.2 </td><td> 0.5 </td><td> % 100 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 0.1 </td><td> % 100 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 3.7 </td><td> 0.1 </td><td> % 100 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4.2 </td><td> 0.2 </td><td> % 100 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: HIV-1 qRPA tahlil doğrulama standa kullanma.Şekil 4&#39;te üçüncü eğrisi JoVE_validation_and_quantification.m komut 5 ek deneyler için numunelerin (log 10 kopya) konsantrasyonları tahmin etmek için kullanıldı. Başlangıçta Analitik Kimya 2014 yılında yayınlanan Tablo, izin 9 ile burada yeniden.

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control at JoVE.com

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

development-quantitative-recombinase-polymerase-amplification-assay

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

13.5K Görüntüleme.  Rice University. Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Video: Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Genetik

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

Özgül İnsan ve Hayvan Virüsler Mikrobiyal Kaynak Takip için maliyet-etkin Yöntemi

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications

New, non-invasive methods for detecting and monitoring species presence are being developed to aid in fisheries and wildlife conservation management. The use of environmental DNA (eDNA) samples for detecting macrobiota is one such group of methods that is rapidly becoming popular and being implemented in national management programs. Here we focus on the development of species-specific targeted assays for probe-based quantitative PCR (qPCR) applications. Using probe-based qPCR offers greater specificity than is possible with primers alone. Furthermore, the ability to quantify the amount of DNA in a sample can be useful in our understanding of the ecology of eDNA and the interpretation of eDNA detection patterns in the field. Careful consideration is needed in the development and testing of these assays to ensure the sensitivity and specificity of detecting the target species from an environmental sample. In this protocol we will delineate the steps needed to design and test probe-based assays for the detection of a target species; including creation of sequence databases, assay design, assay selection and optimization, testing assay performance, and field validation. Following these steps will help achieve an efficient, sensitive, and specific assay that can be used with confidence. We demonstrate this process with our assay designed for populations of the mucket (Actinonaias ligamentina), a freshwater mussel species found in the Clinch River, USA.

Environmental DNA assays require rigorous design, testing, optimization and validation before the collection of field data can begin. Here, we present a protocol to take users through each step of designing a species-specific, probe-based qPCR assay for the detection and quantification of a target species DNA from environmental samples.

ÇevreSEL DNA Uygulamaları için Türlere Özgü Nicel PCR Testlerinin Geliştirilmesi ve Testi

New, non-invasive methods for detecting and monitoring species presence are being developed to aid in fisheries and wildlife conservation management. The ...

Çevre

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

T-hücre reseptörleri Eksizyon Circles Eşzamanlı Niceleme (TREC) ve K-silme Rekombinasyon Eksizyon Circles (KRECs) Gerçek zamanlı PCR ile

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis. 
Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories. 
This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.

Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.

Solunum Sıvılarda equid Herpes-2 Teşhis için bir Nicel PCR Yöntemi Geliştirilmesi ve Validasyonu

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction followed by probe hybridization on a nylon membrane, which is re-usable. Probes are 5' amine modified to allow fixation to the membrane. Primers are 5' biotin modified which allows detection of hybridized PCR products using streptavidin-peroxidase and a chemiluminescent substrate via photosensitive film. With low setup and consumable costs, this technique is inexpensive (approximately US$2 per sample), high throughput (multiple membranes can be processed simultaneously) and has a short turnaround time (approximately 10 hours). 
The technique can be utilized in a number of ways. Multiple probes can be designed to detect sequence variation within a single amplified product, or multiple products can be amplified
simultaneously, with one (or more) probes used for subsequent detection. A combination of both approaches can also be used within a single assay. The ability to include multiple probes for a single target sequence makes the assay highly specific.
Published applications of mPCR/RLB include detection of antibiotic resistance genes1,2, typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus3-5 and Salmonella sp6, molecular serotyping of Streptococcus pneumoniae7,8, Streptococcus agalactiae9 and enteroviruses10,11, identification of Mycobacterium sp12, detection of genital13-15 and respiratory tract16 and other17 pathogens and detection and identification of mollicutes18. However, the versatility of the technique means the applications are virtually limitless and not restricted to molecular analysis of micro-organisms.
The five steps in mPCR/RLB are a) Primer and Probe design, b) DNA extraction and PCR amplification c) Preparation of the membrane, d) Hybridization and detection, and e) Regeneration of the Membrane.

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

An inexpensive, high throughput method for simultaneous detection of up to 43 molecular targets is described. Applications of mPCR/RLB include microbial typing and detection of multiple pathogens from clinical samples.

Multiplex PCR ve Reverse Line Blot Hibridizasyon Testi (mPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

Biyoloji

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

Tıp

Open-Source Miniature Fluorimeter to Monitor Real-Time Isothermal Nucleic Acid Amplification Reactions in Resource-Limited Settings

Traditional methods to detect and quantify nucleic acids rely on polymerase chain reaction (PCR) and require the use of expensive thermocyclers with integrated fluorescence detection of amplicons. Isothermal nucleic acid amplification technologies eliminate the need for thermal cycling; however, fluorescence-based detection of products is still required for real-time, quantitative results. Several portable isothermal heaters with integrated fluorescence detection are now commercially available; however, the cost of these devices remains a significant barrier to widespread adoption in resource-limited settings. Described here is a protocol for the design and assembly of a modular, low-cost fluorimeter constructed from off-the-shelf components. Enclosed in a compact 3D printed housing, the fluorimeter is designed to be placed atop a commercially available heat block holding a PCR tube. The fluorimeter described here was optimized to detect fluorescein isothiocyanate (FITC) dye, but the system can be modified for use with dyes commonly used as reporters in real-time nucleic acid amplification reactions. Clinical applicability of the system is demonstrated by performing real-time nucleic acid detection with two isothermal amplification technologies: recombinase polymerase amplification (RPA) for detection of positive control DNA provided in a commercial kit and reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for detection of clinically meaningful levels of SARS-CoV-2 RNA.

Detailed instructions are provided to build an open-source, modular fluorimeter that is compatible with many low-cost heaters to perform real-time, quantitative isothermal nucleic acid amplification.

Kaynak Sınırlı Ortamlarda Gerçek Zamanlı İzotermal Nükleik Asit Amplifikasyon Reaksiyonlarını İzlemek için Açık Kaynaklı Minyatür Florometre

Traditional methods to detect and quantify nucleic acids rely on polymerase chain reaction (PCR) and require the use of expensive thermocyclers with ...

Biyomühendislik

Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System

Acinetobacter baumannii, a gram-negative bacterium, is notorious for causing severe infections with high mortality rates. Rapid and accurate detection of A. baumannii is crucial for prompt treatment, effective infection control, and curbing antibiotic resistance. However, there is no suitable method for rapid and easy on-site detection of A. baumannii. The DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR) system offers a rapid, precise, and sensitive approach to A. baumannii detection by integrating the target-specific recognition capabilities of Cas12a with the isothermal amplification efficiency of Recombinase Polymerase Amplification (RPA). This protocol details the detection of A. baumannii using RPA combined with LbaCas12a endonuclease. The following steps are described in this article: extraction of DNA, selection of a specific DNA sequence, design of primer and CRISPR RNA (crRNA), construction of positive recombinant plasmid, setup of Cas12a-RPA assay, optimization of the RPA amplification system, visualization of the RPA-CRISPR/Cas12a assay using a fluorescence detection tool such as a real-time PCR instrument, and evaluation of sensitivity and specificity evaluation.

To facilitate the rapid and precise detection of Acinetobacter baumannii, we present a protocol that employs Recombinase Polymerase Amplification (RPA) in conjunction with LbaCas12a endonuclease for identifying A. baumannii infections.

Acinetobacter baumannii, a gram-negative bacterium, is notorious for causing severe infections with high mortality rates. Rapid and accurate detection of ...