This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre th&#233;matique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Sant&#233; du Qu&#233;bec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.

NOT: Deneyler Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kanada Kılavuzu&#39;na uygun olarak yapıldı ve Université Laval Hayvanları Koruma Komitesi tarafından kabul edildi. 1. Numune Hazırlama NOT: Bu örnekte, doğum sonrası 1. günde, fare beyni kullanılır. <ol><li> 3 yavrular için en az 4 için ezilmiş buz hipotermi anestezi kullanın, sonra buz gibi soğuk L15 ortamında mümkün olduğunca çabuk beyinleri teşrih. 2 dakika içinde bu adımı gerçekleştirin. </li><li> Aktarım disseke kalıp (materyalininin cf. Liste) gömme beyinleri ve istenilen konumda numune yönlendirmek için özen dondurulmuş doku gömme medya ile doldurun. -80 ° C&#39;de, sıvı azotun ve mağaza hemen örnekleri dondurun. 30 saniye içinde bu adımı gerçekleştirin. NOT: Örnekler RNA kalitesinden ödün vermeden birkaç ay saklanabilir. </li></ol> 2. Kesit <ol><li> Sağlıgı membran coated cam slaytlar (cf. malzemenin listesi) yüzey RNAz dekontaminasyon solüsyonu ile RNases herhangi bir iz ortadan kaldırmak için. DEPC su slaytlar yıkayın ve kurumaya bırakın. Alternatif olarak, bir gecede 200 ° C&#39;de fırında slaytlar. </li><li> Daha önce bir yüzey RNAz dekontaminasyon solüsyonu ile temizlenmelidir bir kriostat dondurulmuş örnekleri aktarın. 10 mikron kalınlığında -20 ° C ve dilim örneklerinde Set kriyostat odası sıcaklığı. Membran kaplı slaytlar üzerinde doku bölümleri toplayın ve boyama önce onlara kuru 10 dakika sürdü. Alternatif olarak, mağaza boyama kadar -80 ° C&#39;de slaytlar. </li></ol> Boyama Çözümleri 3. Hazırlık <ol><li> Sadece deney başlamadan önce tüm çözelti hazırlayın, ve RNA bozulmasını önlemek için (yıkama çözeltileri için hariç) boyama Çözeltilerin RNaz inhibitörü kullanımı. </li><li> Tampon çözeltisi hazırlayın. % 1 BSA ilave RNAse içermeyen fosfat tamponlu tuzlu su (PBS oluşan tüm çözümler aynı tampon () kullanarak% 0.2 Triton ve% 2 RNaz inhibitörü). Her bir slayt için, tampon çözelti içinde 400 ul (primer, 200 ul ve ikincil antikorlar için 200 ul) hazırlayın. </li><li> Sabitleyici çözeltisi hazırlandı:% 70 etanol kullanmak -20 ° C&#39;de tutuldu. RNA ekstraksiyon veriminde ciddi bir azalma önlemek için minimal doku tespit prosedürü tutun. Not: Alternatif olarak, -20 ° C&#39;de tutuldu ve% 5 asetik asit ilave% 95 etanol solüsyonu kullanın. </li><li> Tampon çözeltisi içinde birincil antikor seyreltilmesiyle primer antikor çözeltisi hazırlayın. Dopaminerjik nöronlar etiketleme için, tirozin hidroksilaz (TH, oran dopamin üretimi için enzim sınırlayıcı) hedefleyen bir antikor kullanın. Pratik inkübasyon süresi telafi etmek için antikorun daha yüksek bir konsantrasyon kullanın. 01:25 bir seyreltme TH antikoru kullanın. NOT: 1.000: Normal immünofloresan protokolü, bu antikor, bir 1 seyreltme gece boyunca kuluçkalanmıştır güçlü bir sinyal verir. Bu protokolde, bu 40X daha konsantreler kullanılırKısa inkübasyon süresi nedeniyle ed. Bu nedenle yöntem için kullanılan yüksek antikor konsantrasyonu için spesifik olmayan etiketleme herhangi bir artış kontrol etmek için paralel olarak standart bir immün gerçekleştirin. </li><li> Tampon çözeltisi içinde sekonder antikor seyreltilmesiyle ikincil antikor çözeltisi hazırlayın. 100: 1 bir konsantrasyonda biyotinile edilmiş ikincil antikor kullanın. NOT: Bu örnekte, bir anti-tavşan biyotinile antikor kullanılır. </li><li> Biyotinlenmiş sekonder antikor tespiti için avidin-biyotin kompleksi (ABC) çözeltisi hazırlayın. 1 arasında bir konsantrasyonda bileşik A ve bileşik B eklenerek ABC çözeltisi oluşturunuz: DEPC PBS içinde seyreltilmiş 100 uL% 2 RNaz inhibitörü ile takviye edilmiştir. Slaytlar eklemeden önce Avidin-Biotin kompleksi 30 dakika hazırlayın. </li></ol> 4. Boyama <ol><li> Hızla havada onları iterek ° C -80 zaman bir ya da iki slaytlar çözülme (ya da bir hava üfleyici kullanın). Hidrofobik ile Surround bölümlerbariyer kalem ve bir kaç saniye kurumaya bırakın. <ol><li> -20 ° C &#39;de en fazla 5 dakika boyunca soğuk halde sabitleyici çözeltisi slaytlar koyun. Çamaşır yıkama için DEPC PBS 6-8 kez slaytlar hızlı, daha sonra fiksatif çözüm fazlasının ayrılması daldırma havada kez çalkalayın. </li><li> DEPC PBS fazlasının kaldırmak için slaytlar Flick. Adımı Defrost slaytlar 5 dk geçmemesi emin olun. </li></ol></li><li> Temiz bir tepsiye yerleştirin kayar (bir yüzey RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile önceden tedavi edilen RNaz&#39;larına herhangi bir izi ortadan kaldırmak için) ve oda sıcaklığında 10 dakika için her bir sürgü (tavşan anti-TH) birincil antikor çözeltisi 200 ul koyun. Dip DEPC PBS hızlı yıkama için 3 kez slaytlar ve DEPC PBS aşırı kaldırmak için bir kez slaytlar fiske. </li><li> Oda sıcaklığında 6 dakika boyunca Her bir slayt, ikincil antikor çözeltisinin 200 ul koyun. Dip hızlı yıkama için DEPC PBS içinde 3 kez slaytlar ve DEPC PBS fazlasının kaldırmak için slaytlar fiske. </li><li> ABC Solu 200 ul koyunoda sıcaklığında 4 dakika boyunca Her bir slayt yon. Dip DEPC PBS hızlı yıkama için 3 kez slaytlar ve aşırı DEPC PBS kaldırmak için slaytlar fiske. </li><li> DAB (3,3 &#39;diaminobenzidin) ABC çözeltisi içinde inkübasyon 4 dakika boyunca çözelti hazırlayın. Kit (DAB Peroksidaz Yüzey Kiti) sağlanan reaktifler kullanın. Sağlanan tampon 1 damla, DAB solüsyonu 1 damla ve DEPC su 2.5ml% 30 H 2 O 2 1 damla karıştırın. Ters çevrilerek çözüm karıştırın. </li><li> DAB çözeltisi 196 ul al ve slaytlar üzerinde yayılan önce RNaz inhibitör çözeltisinin 4 ul (% 2) ilave edin. Talep (bir yüzey RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile ön muamele edilmiş), temiz bir tepsi üzerine kayar ve slaytlar üzerinde DAB çözeltisi 200 ul koyun. NOT: DAB çözümü within1 veya 2 dakika tepki gerekmektedir. </li><li> Dip DEPC PBS hızlı yıkama için 3 kez slaytlar ve mutlak etanol birkaç saniye slaytlar koydu. Havada onları iterek slaytlar kurulayın (ya da bir hava üfleyici kullanın). &lt;Br /&gt; Not: Slaytlar gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de saklandı veya LCM işlenebilir. </li></ol> 5. Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon <ol><li> Havada onları iterek hızla slaytlar defrost (ya da bir hava üfleyici kullanın). Adımı Defrost slaytlar 5 dk geçmemesi emin olun. </li><li> LCM geçin. Toplama tüp kapağı bakacak örnek tarafı mikroskop altında slayt yerleştirin. Numune için en iyi büyütmeyi seçin. Ilgi hücreleri görmek için odağı ayarlayın. <ol><li> Kesim alanı tanımlayın ve lazer ile kesim başlar. Parçalara hücreleri ya da (RNA ekstraksiyon kiti) liziz tamponunda 50 ul ile dolu toplama borusu kapağın doku parçası toplayın. LCM adım 30 dakika aşmadığı emin olun. </li></ol></li><li> Bir RNA özütleme kiti (cf.. Malzeme listesi) kullanılarak izole hücrelerden toplam RNA ekstrakte edin. Üreticinin protokolünü takip ediniz. <ol><li> 42 ° C&#39;de 30 dakika boyunca toplanan hücreleri inkübehücreler lize edildi. Ön koşul klima tampon 250 ul ekleyerek RNA saflaştırma sütun. Yük tabii tutulan parçalanmış hücrelerin etanol 50 ul. Önceden koşullandırılmış bir arıtma kolonuna lize hücreler 100 ul yerleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında, 2 dakika için 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin sütunu. Yıkama tampon ile iki kez kolon yıkayın. RNAse içermeyen su minimal önerilen hacmi (11 ul) Zehir (bu BioAnalyser engel olabilir gibi muamele DEPC değil). Test kalitesine 2 ul tutun. Not: Bütün çözeltiler ve reaktifler kit sağlanmaktadır. </li></ol></li></ol> 6. cDNA Sentezi ve Nicel RT-PCR <ol><li> -Ters transkribe ters transkriptaz ve oligo (dT) kullanılarak tamamlayıcı DNA&#39;ya lazer yakalanan dopaminerjik hücrelerinden RNA örnekleri. Üreticinin protokolü (bkz. Malzemenin listesi) izleyin. </li><li> Gen spesifik primerler ile QRT-PCR için cDNA 1 ul kullanın. Set up PCR reaNicel PCR için bir tek bileşenli sıcak başlangıç ​​reaksiyon karışımı ile 20 ul hacim içinde seksiyonlar, üretici tarafından tavsiye edildiği gibi. Her biri üçlü halde reaksiyona yürütmek. <ol><li> Burada tarif edilen deneyler için, aşağıdaki primer çiftler kullanılarak: GAPDH-F (5&#39;-CCA AGA CCC AGA CTG TGG AT-3 &#39;), / GAPDH-R (5&#39;-GGA TGC AGG GAT GTT GAT CT-3&#39;); Rpl13a-F (5&#39;-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 &#39;) / Rpl13a-R (5&#39;-CTG CCT GTT TCC ACC GTA TC-3&#39;); Th-F (5&#39;-CAG TGG AGG ATG TGT CTC-3 &#39;) / Th-R (5&#39;-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3&#39;); AADC&#39;si-F (5&#39;CAT GAG AGC TTC TGC SKK TC -3 &#39;) / AADC&#39;si-R (5&#39;GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3&#39;). </li></ol></li><li> Ardından hızlı döngü parametreleri kullanılarak kantitatif RT-PCR amplifikasyonu yapın: 95 ° C, 10 saniye 45 döngü, 95 ° C, 60 ° C &#39;de 10 saniye ve 72 ° C&#39;de 10 saniye, ardından 5 dakika karıştırıldı. Belirlenme aracın varsayılan ayarı kullanarak erime eğrisi analizi yapınne homojen ürün oluşumu. </li><li> Yerleşik yazılım kullanarak verileri analiz edin. <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi 14 nispi ekspresyon seviyelerini elde etmek için, iki referans gen, GAPDH ve Rpl13a sentezlenmesi DA markör genleri Th ve AADC ifade değerleri normalize. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+orthodenticle+homeobox+2+influences+axonal+projections+and+vulnerability+of+midbrain+dopaminergic+neurons.">The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons.</a> Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+in+translational+research:+theory,+technical+considerations,+and+future+applications.">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).</li><li>Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+methods+and+applications.">Laser capture microdissection: methods and applications.</a> Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).</li><li>Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+technology.">Laser capture microdissection technology.</a> Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).</li><li>Fend, F., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+pathology.">Laser capture microdissection in pathology.</a> Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).</li><li>Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+molecular+histology+to+study+glial+influence+on+neurodegenerative+disorders.+Focus+on+recent+developed+single+cell+laser+microdissection.">The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection.</a> Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).</li><li>Liu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+the+tissue+biorepository.">Laser capture microdissection in the tissue biorepository.</a> Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).</li><li>Baskin, D. G., Bastian, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-laser+capture+microdissection+of+rat+brain+neurons+for+real+time+quantitative+PCR.">Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR.</a> Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).</li><li>Brown, A. L., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+RNA+preservation+for+immunolabeling+and+laser+microdissection.">Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection.</a> RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).</li><li>Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purity+and+enrichment+of+laser-microdissected+midbrain+dopamine+neurons.">Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons.</a> BioMed research international. 2013, 747938 (2013).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+rat+midbrain+dopamine+neurons:+implications+for+selective+vulnerability+in+parkinsonism.">Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism.</a> Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).</li><li>Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Endogenous+Serine/Threonine+Protein+Phosphatase+Inhibitor,+G-Substrate,+Reduces+Vulnerability+in+Models+of+Parkinson's+Disease.">An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson's Disease.</a> Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).</li><li>Pfaffl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Quantification+strategies+in+real-time.">Chapter 3, Quantification strategies in real-time.</a> AZ of quantitative PCR. , (2004).</li><li>Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+novel+ultra-short+immunolabeling+method+for+high-quality+mRNA+preservation+in+laser+microdissection+and+real-time+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction).">Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction).</a> The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).</li><li>Podgorny&#301;, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+for+biology+and+medicine.">Laser microdissection for biology and medicine.</a> Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).</li><li>Vandewoestyne, M., ewoestyne &amp; Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+forensic+research:+a+review.">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).</li><li>Shapiro, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+proteomic+workflow+for+characterization+of+frozen+clinical+biopsies:+laser+capture+microdissection+coupled+with+label-free+mass+spectrometry.">A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry.</a> Journal of. 77, 433-4340 (2012).</li><li>Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+the+genomic+and+proteomic+era:+targeting+the+genetic+basis+of+cancer.">Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer.</a> International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yöntemin en kritik nokta RNA bozulmasını önlerken ilgi hücreleri etiketleme oluşur. RNases sulu çözeltilerde aktif olarak kuluçka süreleri azalan RNA koruma 11,15 geliştirir. Kullanılan tüm çözümler RNases inaktive DEPC ile tedavi edilmelidir. Tüm malzemeler ve yüzeyler RNaz&#39;larına kirlenmeyi önlemek için bir yüzey RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile muamele edilmesi gerekir. Son olarak, bu koşullar altında, her Çözeltilerin RNaz inhibitörü ilave bozunmadan RNA koruma etkilidir. Antikor inkübasyon sırasında uygulanan yüksek tuz koşullarının kullanılması, daha önce RNA, 9,10 korunmasında etkili olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntem, sağlam antikorlar kullanılarak hızlı boyama için sınırlı kalmıştır. bölümlerin kalınlığının bir başka önemli noktayı temsil eder ve söz konusu hücre boyutuna bağlıdır. Dopaminerjik nöron hücre gövdesi ortalama büyüklüğü yaklaşık 10 olduğu81, m, bu hücrelerin bir tabaka elde etmek için bu bölüm kalınlığı seçin. FACS göre bu tekniğin en önemli sınırlama microdissected edilebilir hücrelerin sayısının az olduğunu. RNA amplifikasyonu kitinin kullanımı RNA sekanslama ya da bir mikro 16 kullanılarak gen profil deneyleri için gereklidir. Bununla birlikte, QRT-PCR amplifikasyonu, aşama (Şekil 2c) doğrudan gerçekleştirilebilir. Hızlı immün protokolü ile elde edilen boyama kalitatif değerlendirme daima yapılmalıdır ve normal immün protokolü kullanılarak elde edilen boyama farklı olmamalıdır. Şimdiye kadar, lazer yakalama çalışmalar çoğunlukla GFP gibi işaretleri ifade eden ya da örneğin Nissl boyama gibi pratik histolojik renklerin, transjenik hayvanlardan elde edilen hücre popülasyonlarının izole edilmesi için kullanılmıştır. Burada sunulan yöntem immunhistokimya ile ilgi hücrelerin görselleştirme sağlar. İzolasyon ve gen ifade sözcüğünü eldeHücrelerin kimyasal tespit popülasyonlarının salgılamanın ardından profili şimdi 17 mümkündür. Burada açıklanan protokol herhangi dokulara uygulanır ve herhangi bir uygun antikorlar ile kullanılabilir. Beyinde, nöronlar kendi coğrafi lokalizasyon bölü ama en beyin bölgeleri kimyasal kimliğine dayalı farklı alt popülasyonlar çeşitli ihtiva edilebilir. nöronların belirli tipte gen ekspresyon paterni aynı serebral bölgede başka bir hücre tipinde büyük ölçüde farklı olabilir. Biyolojik veya patolojik bağlama göre, belirli bir hücre popülasyonun gen ekspresyon profili, aynı zamanda önemli ölçüde değişebilir. Burada anlatılan prosedürü kullanarak, yeni keşifler 8,18,19 yol açan, bu değişiklikleri izlemek mümkündür.

Beyin, karmaşık ağlar oluşturan farklı nöron tiplerinin çok çeşitli oluşmaktadır. Bu nöronlar kendi morfolojisi, bağlantı ve gen ifadesi desen 1&#39;e göre farklı gruplar ve alt organize edilmektedir. mikrodizileri gelişimi, yeni nesil dizileme ve Mah-PCR, farklı biyolojik bağlamlarda 1,2 nöronal nüfus gen ekspresyon profillerini karşılaştırma olanağı sundu. Bu hassas analizler RNA bütünlüğü 2-4 tutarken ilgi hücre tiplerinin kesin belirlenmesi ve izolasyon gerektirir. Floresan etkinleştirilmiş hücre tasnif (FACS) tekniği çok hücre yüzeyi işaretleri ve / veya morfolojiye göre özel hücre tiplerini izole etmek için kullanılmıştır. FACS uzamsal çözünürlük 5 tam bir kayıp ile sonuçlanır önce sıralama, bir hücre ayırma aşamasını gerektirir. Bir çok alt-popülasyonları bulunduğunu nöronal th anatomik dağılıma göre birbirlerinden ayırt edilirlerE beyin. İnce beyin bölümlerinde uygulanan lazer yakalama mikrodiseksiyon yüksek uzaysal çözünürlüğü 6-8 ile hücrelerin spesifik izolasyonu için uygun bir seçenek sunar. LCM önemli bir sınırlama, morfolojik kriterlere ya da genetik olarak hayvan modellerinde tasarlanmış floresan protein muhabir göre ilgi hücreleri belirlemek için bir ihtiyaç olmuştur. LCM ile kombinasyon halinde, bir RNA bütünlüğü korunur pratik immün yöntemleri gerçekleştirmek için yeni tekniklerin geliştirilmesi, hemen gen profil deney devam etmek için hücre alt izolasyonunu sağlar. Bu yaklaşım, daha önce gerçekleştirilen ve kısa bir süre az sayıda yayın 1,9-13 tarif edilmiştir. Burada, biz LCM ile hızlı immün birleştirerek karmaşık bir doku yapısında belirli bir hücre alt kümesi yüksek kaliteli RNA elde etmek için detaylı bir prosedür ortaya koymaktadır. Biz maksimum RNA kurtarma elde etmek için anahtar kritik adımları uygulayın ve sig olabilir RNA bozulmasını önlemek için nasıl göstermekanlamlı ölçüde etki gen ekspresyon profili. Bu protokolün gösteri için, bir günlük fare orta beyin dopaminerjik nöronlar hedef alındı. Dopaminerjik nöronlar, tirosin hidroksilaz (TH) karşı yönlendirilmiş bir antikor, dopamin sentezi için oran-sınırlayıcı enzim kullanılarak imüno edilebilir. TH immun boyama sonra, tek tek ya da dopaminerjik nöronların grupları daha sonra LCM kullanılarak izole edilebilir. Microdissected hücreler lizis tamponu içinde toplanır ve RNA, RNA izolasyon kiti kullanılarak ekstre edilir. Kalite ve çıkarılan RNA miktarı Bioanalyzer 5 kullanılarak ölçülmektedir. Kullanılarak gen tanımının diğer analizleri: RNA sıralanması, mikrodizi veya qRT-PCR, daha sonra 2,4,6 gerçekleştirilebilir. Bir örnek olarak, bir iki-aşamalı QRT-PCR lazer yakalanan izole dopaminerjik etki ile gösterilmiştir. Iki dopaminerjik nöron marker genlerinin ekspresyon seviyeleri rölatif ölçümü, bu protokol seçicilik göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Membrane coated slides&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosystems</td><td>11505158</td><td>MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 &amp;micro;m; 50 pcs</td></tr><tr><td>Surface RNAse decontamination solution</td><td>Life technologies</td><td>AM9780</td><td>RNaseZap</td></tr><tr><td>Fixative</td><td></td><td></td><td>70% Ethanol kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Anti-TH&amp;nbsp;</td><td>Pel-Freez</td><td>P40101</td><td>&amp;nbsp;1:25</td></tr><tr><td>RNAse free buffer</td><td></td><td></td><td>DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton</td></tr><tr><td>RNAse inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)</td></tr><tr><td>Anti-rabbit biotinylated</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC kit Standard</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>8&amp;micro;l/ml</td></tr><tr><td>DAB Peroxidase Substrate Kit&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>RNA isolation kit</td><td>Life technologies</td><td>KIT0204</td><td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 30%</td><td>Sigma</td><td>HC4060</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser microdissection system</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>Model AS-LMD</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22753-14</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Embedding mold&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosystems</td><td>14702218311</td><td>6x8mm</td></tr><tr><td>Hydrophobic barrier pen&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Frozen tissue embedding media</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer chip</td><td>Aligent Technologies</td><td>5067-1513</td><td>RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Hot start reaction mix for quantitative PCR</td><td>Roche</td><td>6402712001</td><td>Fast Start Essential DNA Green Master</td></tr><tr><td>Reverse transcriptase</td><td>Life technologies</td><td>11752-050</td><td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR</td></tr></tbody></table>

rna isolation from cell specific subpopulations using laser-capture microdissection combined with rapid immunolabeling

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) yüksek uzaysal çözünürlüğü ile ince doku bölümleri belirli hücrelerin izolasyonu sağlar. Etkili LCM heterojen doku hücreleri alt popülasyonlar hassas tanımlanmasını gerektirir. LCM ilgi hücrelerin tanımlanması, genellikle morfolojik kriterlere veya flöresanlı proteinin, muhabir dayanmaktadır. LCM ve hızlı immunolabeling kombinasyonu alternatif ve etkili bir araç özel hücre tiplerini görselleştirmek ve çevresindeki doku onları izole etmek için sunuyor. Kaliteli RNA daha sonra saf hücre popülasyonu elde edilmesi ve daha RNA dizileme, mikrotertibin veya Mah-PCR olmak üzere mansap uygulamalar için işlenmiş olabilir. Bu yaklaşım, daha önce gerçekleştirilen ve kısa bir süre az yayınlarda tarif edilmiştir. Bu makalenin amacı nasıl LCM kullanarak bu özel hücrelerin izole RNA bütünlüğünü tutarak, ve sırasında hücre popülasyonu hızla immün gerçekleştirmek için nasıl göstermek için. Burada, biz göstermekd immün ve bir günlük farelerden elde edilen beyin dokusu dopaminerjik hücrelerin yakalamak için bu çok aşamalı bir prosedür. Biz özel dikkat hak anahtar kritik adımlar vurgulayın. Bu protokol, doku ve ilgi çeşitli hücreler için adapte edilebilir. Farklı alanlardan gelen araştırmacılar büyük olasılıkla bu yaklaşımın gösterilmesi yararlanacaktır.

Bu hızlı immün prosedürü RNA bütünlüğünü koruyarak ilgi hücrelerin görselleştirme sağlar. 1 RNA ekstraksiyon öncesi doku hazırlık aşamaları göstermektedir Şekil. Cryosectioning sonra, dopaminerjik nöronların tirosin hidroksilaz karşı yönelik bir antikor (işaretlenmiş nöronlar kahverengi görünür) ile etiketlenmiştir. Deney Söz bağlı olarak, tek bir hücre ya da ilgi daha büyük bölge LCM kullanılarak izole edilebilir (Şekil 1D - E). Bu bozulmuş RNA aşağıdaki analiz kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olacak gibi, çıkarılan RNA kalitesini değerlendirmek için önemlidir. Her numune böylece ölçümü için ve RNA bütünlüğünü kontrol etmek için bir Mikroakiskan-tabanlı platform BioAnalyser işlenir. 2 bozulmuş ve iyi-kaliteli örneklerinin tipik BioAnalyser sonuçlarını göstermektedir. Dijital jel ve elektroferogramlar Hem her sol içinde RNAz inhibitörü kullanmanın önemini göstermektedirKatkı RNA korumak için. 500 nöronların çıkarılan RNA beklenen miktarı yaklaşık 1-2 ng. Birkaç doku kesitlerinden microdissected hücreler RNA miktarını artırmak için aynı tüp içinde toplanmış olabilir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52510/52510fig1.jpg" /> Şekil 1: Hızlı immün ve lazer yakalama mikrodiseksiyon prosedürü. (A) şematik embriyonik günde 15.5 bir fare beyninin sagital görünümü gösteren. Siyah çizgi orta beyin dopamin nöronları bulunduğu ön-arka bölgelerde yerini gösterir. Ince kesitler bir kriyostat kullanarak yapılır ve zar ile kaplı cam lam üzerine toplanır. Immunolabeling sonra, orta beyin dopaminerjik nöronları kahverengi (B) &#39;de görebilir. Lazer microdissected örnekleri liziz tamponu (C) ile doldurulmuş bir boru kap içinde toplanır. Çevrede Bölgesi (D mavi çizgi)ya da tek hücreli (e) ayrılmış ve tüp kapağa alınabilir. Ölçek çubukları: (D) 250μm, (E) 50um. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52510/52510fig2.jpg" /> Şekil 2: Bir Bioanalyzer çip setini kullanarak lazer yakalama mikro-kesim sonrası izole edilen toplam RNA numunesinin kalite kontrolü (A), Bioanalyzer olan (L, merdiven ile elde edilen sayısal jeli; 1, örnek 1 RNAsine ile RNaz inhibitör (RNAsine), örnek 2 yoktur. ). Kısmen bozulmuş RNA ve iyi kalitede RNA tipik örneği 2 (alt panel) gösteren numune 1 (üst panel) (B) elektroferogramlarda hangi 18S / 28S rRNA zirveleri açıkça görülebilir (RIN&gt; 8 çalışarak iyidir). (C), Çevre lekesiz t arasında iki DA işaretleyici genlerin (TH ve AADC) için katlama değişim temsil Normalize nispi ifade seviyeleriSorun ve DA etki. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52510/52510fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling at JoVE.com

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Belirli bir doku hücrelerinin bir alt kümesi gen ifade analizi büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bu makalede, lazer yakalama mikrodiseksiyon ile hızlı bir immün yöntemi birleştirerek belirli bir hücre popülasyonu yüksek kaliteli toplam RNA izole açıklamaktadır.

Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

rna-isolation-from-cell-specific-subpopulations-using-laser-capture

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K Görüntüleme.  Université Laval.  Belirli bir doku hücrelerinin bir alt kümesi gen ifade analizi büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bu makalede, lazer yakalama mikrodiseksiyon ile hızlı bir immün yöntemi birleştirerek belirli bir hücre popülasyonu yüksek kaliteli toplam RNA izole açıklamaktadır. 

Video: RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

Multiplex RT-qPCR kullanarak tek hücreli Gen İfadesi Nadir Lenfoid Populasyonlarının Farklılıkları karakterize etmek

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Genetik

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Nörobilim

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Memeli Doku Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Biyoloji

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Kültür farklılaştırılmış insan Neuroprogenitor Hücreler Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon - Bireysel Dopamin Nöronlar İzolasyonu ve Tüm ventral tegmental Area bir Gösteri

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, microvascular proliferation, mesenchymal transformation and necrosis characterize the histological heterogeneity of high-grade gliomas. Our laboratory has demonstrated that the presence of high densities of mesenchymal cells, named oncostreams, correlate with tumor malignancy. We have developed a unique approach to understand the mechanisms that underlie glioma&#39;s growth and invasion. Here, we describe a comprehensive protocol that utilizes laser capture microdissection (LMD) and RNA sequencing to analyze differential mRNA expression of intra-tumoral heterogeneous multicellular structures (i.e., mesenchymal areas or areas of tumor invasion). This method maintains good tissue histology and RNA integrity. Perfusion, freezing, embedding, sectioning, and staining were optimized to preserve morphology and obtain high-quality laser microdissection samples. The results indicate that perfusion of glioma bearing mice using 30% sucrose provides good morphology and RNA quality. In addition, staining tumor sections with 4% Cresyl violet and 0.5% eosin results in good nuclear and cellular staining, while preserving RNA integrity. The method described is sensitive and highly reproducible and it can be utilized to study tumor morphology in various tumor models. In summary, we describe a complete method to perform LMD that preserves morphology and RNA quality for sequencing to study the molecular features of heterogeneous multicellular structures within solid tumors.

Laser microdissection (LMD) is a sensitive and highly reproducible technique that can be used to uncover pathways that mediate glioma heterogeneity and invasion. Here, we describe an optimized protocol to isolate discrete areas from glioma tissue using laser LMD followed by transcriptomic analysis.

İntratümöral Heterojenite, Oncostreams ve Invasion'ın Mekansal ve Moleküler Karakterizasyonu için Glioma Alt Bölgelerinin Lazer Yakalama Mikrodizması

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım<em&gt; Drosophila</emGen ekspresyon analizi için&gt; Dokular

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Mekansal-omik analiz için oral submukoz fibrozis doku örneklerinin alınması

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina propria and the submucosa are often found on histopathological slides. Epithelial dysplasia, epithelial atrophy, and senescent fibroblasts have been proposed to be associated with the malignant transformation of OSF. However, because of the heterogeneity of potentially malignant oral disorders and oral squamous cell carcinoma, it is difficult to identify the specific molecular mechanisms of malignant transformation in OSF. Here, we present a method to obtain a small number of epithelial or mesenchymal cells carrying morphological data and spatial information by laser capture microdissection on formalin-fixed paraffin-embedded tissue slides. Using a microscope, we can precisely capture microscale (~500 cells) dysplastic or atrophic epithelial tissue and fibrotic subepithelial tissue. The extracted cells can be evaluated by genome or transcriptome sequencing to acquire genomic and transcriptomic data with morphological and spatial information. This approach removes the heterogeneity of bulk OSF tissue sequencing and the interference caused by cells in non-lesioned areas, allowing for precise spatial-omics analysis of OSF tissue.

Yazar Spotlight: Oral Potansiyel Malignitelerin Gizemlerini Çözmek 

Laser capture microdissection of oral submucous fibrosis tissues allows for precise extraction of cells from histological regions of interest for the analysis of multi-omics data with morphological and spatial information.

Lazer Yakalama Mikrodiseksiyonu ile Oral Submukoz Fibrozis Örneklerinden Morfolojik ve Mekansal Bilgilerle Hücrelerin İzolasyonu

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...

Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Multiplex RT-qPCR kullanarak tek hücreli Gen İfadesi Nadir Lenfoid Populasyonlarının Farklılıkları karakterize etmek

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar

Memeli Doku Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Kültür farklılaştırılmış insan Neuroprogenitor Hücreler Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon - Bireysel Dopamin Nöronlar İzolasyonu ve Tüm ventral tegmental Area bir Gösteri

İntratümöral Heterojenite, Oncostreams ve Invasion'ın Mekansal ve Moleküler Karakterizasyonu için Glioma Alt Bölgelerinin Lazer Yakalama Mikrodizması

Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım

Lazer Yakalama Mikrodiseksiyonu ile Oral Submukoz Fibrozis Örneklerinden Morfolojik ve Mekansal Bilgilerle Hücrelerin İzolasyonu

Lazer Yakalama Mikrodiseksiyonu ile Oral Submukoz Fibrozis Örneklerinden Morfolojik ve Mekansal Bilgilerle Hücrelerin İzolasyonu