Name: deriving retinal pigment epithelium (rpe) from induced pluripotent stem (ips) cells by different sizes of embryoid bodies
Uploaded: 2015-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies at JoVE.com

The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Mu&#241;iz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).

Kültür Reaktifler ve Kültür Plakaların hazırlanması 1. <ol><li> Kök hücre bazal ortamı, 400 ml 5x serumsuz ek 100 ml ilave etmek suretiyle besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamı hazırlayın. Orta 2 haftaya kadar 4 ° C &#39;de 6 ay boyunca -20 ° C&#39; de stabildir. </li><li> Rho-bağlantılı sarmal bobin ihtiva eden bir protein kinaz (Rock) inhibitörü (Y-27362) için ticari olarak temin edilebilen embriyoit gövdesi (EB) oluşumu ortamı içinde 10 uM çözeltisi ekleyin. </li><li> (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı / Besin Karışımı, F-12, 0.1 mM β-merkaptoetanol, 0.1 mM esas olmayan amino asitleri, 2 mM L-glutamin,% 10 nakavt serum yerine (KSR) ve 10 ug / ml gentamisin ilave edilerek DMEM farklılaşma ortamı hazırlayın / F12). </li><li> 1x N1 takviyesi, 0.1 mM esas olmayan amino asitleri, 250 ug / ml taurin, 13 ng / ml triiyodo-L-tironin sodyum tuzu, 20 ng / ml hidrokortizon, 5 ug / ml gentamisin ve% 15 eklenmesi ile iPS RPE orta hazırlayın fetal sığır serumu (FBS) &lt;sup&gt; Minimum Essential Orta Kartalı (MEM) 21. PH&#39;ı 7.4&#39;e ayarlayın. </li><li> Triiyodo-L-tironin sodyum tuzu stok çözeltisi hazırlayın. Hafifçe dönen 1 N sodyum hidroksit içinde triiyodo-L-tironin sodyum tuzu, 1 mg eritin. MEM 49 mi triiyodo-L-tironin sodyum tuzu ve 50 ml 20 ug / ml yapmak için ekleyin. Alikotları hazırlayın ve gerektiği kadar -20 ° C&#39;de donar. Son kültür ortamı içinde arzu edilen konsantrasyon elde etmek için uygun bir hacim kullanın. </li><li> Hidrokortizon stok çözeltisi hazırlayın. Hafif çalkalama ile% 100 etanol içinde 1 ml hidrokortizon, 1 mg çözünürleştirilir. MEM 19 mi, 20 ml hidrokortizon stok çözeltisi ug / ml 50 yapmak için ekleyin. -20 ° C&#39;de kısım ve donma kadar gerekli. Son kültür ortamı içinde arzu edilen konsantrasyon elde etmek için uygun bir hacim kullanın. </li><li> DMEM / F12 içinde 1 mg / ml dispase bir çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> Matris kaplı plakaların hazırlanması <ol><li> Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) çıkarılan protein matrisi mou hazırlayın0.08 mg / ml DMEM / F12 içinde se sarkoma hücreleri. Kat matris solüsyon içerisinde 1 ml, 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğa. 1 saat boyunca oda sıcaklığında kaplanmış inkübe edin. </li><li> 1 saat inkübe edildikten sonra, fazla DMEM / F12 aspire. Kuyular kurumasını önlemek için besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamı, 0.5 ml ilave edilir. matris kaplı plakalar kullanıma hazırdır. </li></ol></li><li> DMEM / F12 içinde 2 ml her bir durulanarak, mikro plakalar hazırlayın. DMEM / F12 çıkarın ve her bir Rock inhibitörü ile takviye edilmiş EB formasyonu sıvısının 0.5 ml ilave ediniz. 5 dk herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için 2.000 xg&#39;de plaka santrifüjleyin. </li><li> Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde bir sodyum azid% 2 FBS karıştırılarak FACS boyama tamponu hazırlayın ve% 0.09. PH 7.4 tampon ayarlayın. </li><li> DMEM / F12,% 10 FBS eklenerek tripsin nötralize çözelti hazırlayın. </li></ol> 2. iPS Kültür <ol><li> IPS hücre tohumlama öncesinde, sıcak besleyici içermeyen kök hücre kültürü 37 ° C, orta, ve ma vartrix plakaları hazır kaplı. </li><li> Hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu içinde IMR90-1 iPS hücrelerini eritin. Daha sonra su banyosundan cryo-flakon çıkarın ve% 70 etanol ile şişeyi silin. Hücre kümeleri kırılmasını en aza indirmek için 2 ml&#39;lik bir pipet kullanarak 15 ml konik bir tüp hücre transfer edin. </li><li> Damla damla hücrelere sıcak besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamı 5 ml ekleyin ve hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj hücreler çıkartıldı ve süpernatan. </li><li> Dikkatle besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamının 2 ml hücre kümeleri tekrar süspansiyon ve matris ile kaplanmış bir levhanın gözleri içine hücre kümeleri tohum. % 5 CO2,% 95 nem ile 37 ° C inkübatör içine plaka koyun. </li><li> Günlük iPS hücre kültürü ortamı değiştirin. Tohumlama sonrası farklılaşmamış koloniler 5-7 gün gözlemleyin. Bir ışık mikroskobu altında geçit (yoğun merkezi koloniler) için hazır farklılaşmamış koloniler için kontrol edin. </li></ol> IPS hücrelerinin 3. Pasajlanması <ol><li> Başlangıçta önce geçide iPS hücreleri, su banyosu içinde 37 ° C Dispase çözeltisi, DMEM / F12 ve besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamı ısıtın. </li><li> IPS hücrelerini pasaj önce, bölgeyi kazıma ve orta aspire farklılaşma herhangi alanları kaldırmak. Dikkatle 2 ml DMEM / F12 ile iPS hücrelerini durulayın. </li><li> / Ml dispaz her bir kuyucuğa 1 mg 1 ml ilave edilir ve 7 dakika için 37 ° C&#39;de inkübe edin. Dispaz aspire ve yavaşça DMEM / F12, iki kez 2 ml hücre kolonileri yıkayın. Durulamadan sonra, her bir kuyucuğa besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamının 2 ml ilave ediniz. </li><li> 5 ml&#39;lik bir pipet kullanarak hafifçe hücre kümeleri oluşturmak için plaka koloniler kazımak. 15 ml konik tüp müstakil hücre kümeleri aktarın. Hücrelerin sonraki geçişini tohum yeterli besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamı ekleyin. </li></ol> Microwell Plakaları kullanma EBS 4. Nesil <ol><li> IPS hücrelerinin tek bir hücre süspansiyonu hazırlanması <ol><li> Mediu&#39;yu kaldıriPS hücrelerinden m DMEM / F12 içinde 2 ml iPS hücrelerini yıkayın. 6 gözlü bir plakanın her bir de iPS hücreleri Accutase 750 ul ekle. Hücreler plakasına (yaklaşık 5-10 dakika) ayrılmasını sağlamak için izin vermek için 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 ile inkübe hücreleri. </li><li> Yavaşça kalan hücreleri ayırmak için bir pipet kullanın ve plaka yüzeyinde kalan hücreleri ayırmak için. 50 ml&#39;lik bir konik tüp hücreleri aktarın. DMEM / F12, 5 ml plaka durulayın ve konik bir tüp içinde hücreler ile yıkandı, DMEM / F12 birleştirir. Olası kalıntı hücre kümeleri kaldırmak için bir 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçirin. </li><li> Accutase çıkarmak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de hücreleri santrifüjleyin. Hücre yoğunluğu yaklaşık 0.5-1.0 x 10 7 hücre / ml olacak şekilde EB formasyonu ortamında hücre pelletini. </li><li> Tripan mavi ve bir hemositometre ile hücre sayımı yolu ile yaşayan hücrelerin sayısını belirlemek. </li></ol></li><li> Adjustinmikro g hücre yoğunluğu boyutu kontrollü EBS oluşturmak üzere <ol><li> İstenen EB boyutları oluşturmak için bir mikro tablanın her bir çukuruna hücre sayısını ayarlar. Eşit hafifçe hücreler birkaç kez pipetleme hücreleri dağıtmak, adım 1.9 hazırlanan levhaların mikro hücreleri ekleyin. NOT: kuyu başına mikro EB sayısı x başına hücre kuyu başına gereken hücrelerin sayısı = istenilen sayı. </li><li> 2.0 ml &#39;lik bir son hacme kuyu kaya inhibitörü ile takviye edilmiş EB formasyonu orta ayarlayın. Yavaşça her pipetleme iyi hücreleri yeniden dağıtın. 3 dakika boyunca 100 x g&#39;de mikro plakaları santrifüjleyin. % 5 CO2 ve 24 saat için% 95 nem ile 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde plakaları yerleştirin. </li></ol></li><li> Mikro plakalardan Hasat EBS <ol><li> Iyi EBS çoğunun çıkması için 1 ml mikropipetöre ile yukarı ve aşağı orta pipetleme mikro Hasat EBS. Bir ters 40 mikron hücre yoluyla EB süspansiyon geçmek50 ml&#39;lik konik bir tüp üzerine süzgeç tek hücreler ayıklandı. </li><li> Tüm EBS kaldırmak için DMEM / F12 içinde 1 ml bir mikro oyuk plaka 5 kez yıkayın. Yıkar toplayın ve ters hücre süzgecinden geçmek. Yeni 50 ml konik tüp kadar hücre süzgecinden sağ tarafını çevirin. EB formasyonu ortam ile yıkanarak EBS toplayın. Verimi belirlemek için EBS sayın. </li></ol></li></ol> 5. Kaplama EBS ve başlatılıyor Farklılaşma <ol><li> &lt;1,000 EBS / yoğunluğunda iyi EB formasyonu ortamı artı 10 uM Kaya inhibitörü (adım 1.8.1 gibi), altı gözlü levha üzerinde kaplanmış protein matrisi üzerindeki EBS Plate. % 5 CO2 ve 24 saat için% 95 nem ile 37 ° C&#39;de EBS inkübe edin. </li><li> 24 saat EB sonra kaplama, farklılaşma başlatmak için farklılaşma ortamı ile değiştirin. Hücreler, daha fazla analiz için toplanır kadar her gün farklılaştırma ortamının yarısı değiştirin. </li><li> RT-PCR yapmak için günde 6, 17, 29 ve 60 ° C&#39;de örnekleri toplamak, immunocytochemistry ve FACS karakteristik RPE genlerin ve proteinlerin ifadesini doğrulamak için. </li></ol> 6. RNA ekstraksiyonu ve PCR <ol><li> Piyasada mevcut kit verilen talimatlara göre EB örneklerinden RNA ayıklayın. Bir spektrofotometre kullanılarak RNA konsantrasyonunu belirlemek. </li><li> CDNA ters transkript kiti piyasada mevcut RNA göre toplam RNA 100 ng ters transkripsiyon gerçekleştirin. </li><li> CDNA 10 umol / 10 ng bir konsantrasyonda cDNA 10 ng, aşağıdaki primerler kullanılarak (Tablo 1) ile PCR yapın. Aşağıdaki gibi PCR ayarlayın: 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de DNA&#39;yı denatüre, 72 ° C&#39;de bir son döngü, ardından 30 saniye, 1 dakika için 72 ° C için 15 saniye boyunca 95 ° C&#39; de 35 döngü 60 ° C yükseltmek 10 dakika işleme sokuldu. Bir% 1 agaroz jeli üzerinde PCR ürünü çalıştırın. </li></ol> 7. İmmünositokimya <ol><li> Oda sıcaklığında PBS ile iki kez EBS yıkayın. % 4 paraformald RT EBS saptamak10 dakika boyunca ehyde. Oda sıcaklığında bir kez PBS ile yıkayın. 4 ° C de PBS içinde mağazası örnekleri boyama için kullanılana kadar. </li><li> Boyama gününde, tespit ve permeabilization reaktifler ile sabit hücreler tedavi. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca (permeabilizasyon çözeltisi içinde% 10 keçi serumu) bloke etme çözeltisi ile inkübe edin. </li><li> Belirtilen seyreltmelerde aşağıdaki birincil antikorlar kullanılarak permeabilizasyon çözeltisi içinde% 10 keçi serumu immunokimya yapın: Anti-Pax6 (01:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (01:30), ve anti- ZO1 (1: 100). 4 ° C &#39;de antikor O / N karşılık gelen örnekleri inkübe edin. </li><li> Bir sonraki gün, hücreler birinci antikorları ayıklamak ve PBS ile numuneleri üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile florofor-konjuge sekonder antikor ile inkübe edin. </li><li> Hücrelerinden ikincil antikoru çıkarın ve PBS içinde numuneleri üç kez yıkayın. Kapak montaj ortamı içeren DAPI ile cam slaytlar fişleri monte ve örnekler karanlık odasında O / N ayarlamanıza olanak verir.Lekelenmeye görselleştirmek için bir floresan mikroskop kullanın. </li></ol> FACS Analizi 8. Boyama <ol><li> PBS içinde iki kere kültür EBS yıkayın. Tek bir hücre süspansiyonu yapmak için 5-10 dakika boyunca% 0.25 tripsin, 0.5 ml EBS inkübe edin. Tripsin nötrleştirme çözeltisi ile tripsin (1 ml / çukur) nötralize. </li><li> 10 dakika boyunca 600 x g&#39;de 15 ml konik bir tüp ve santrifüj ile tek bir hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Süpernatantı atın ve tüp hücrelere DMEM / F12 10 ml ekleyin. Yavaşça hücreleri karıştırmak için ters. 600 x g&#39;de santrifüj. Santrifüj işleminden sonra, süpernatan atılır ve FACS lekeleme tampon maddesi içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Hücrelerin toplam sayısını sayın. 10 dakika boyunca 600 x g&#39;de santrifüjleyin. Santrifüj atmak süpernatant sonra. Hemen% 4 paraformaldehid, 0.5 ml ekleyerek hücreleri saptamak. Nazik vorteks ile iyice karıştırın. 20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> 10 dakika için 600 xg&#39;de santrifüj ve kaldırmaksüpernatant. Vortex hafifçe hücre pelet bozacak. Soğutulmuş permeabilizasyon çözeltisi 1 ml ilave etmek suretiyle hücre geçirgenliği. Girdap, yavaşça karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilmeye. </li><li> 10 dakika için 600 xg&#39;de Santrifüj ve süpernatant kaldırmak. FACS tampon boyama ve tekrar süspansiyon 3 ml ekleyin. Bir kez daha bu adımı tekrarlayın. 5 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyonda, FACS lekeleme tampon maddesi içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Her bir mikrofüj tüplerine hücre süspansiyonu (0.5 x 10 6 hücre), 100 ul aktarın ve birincil antikor tavsiye edilen hacim ekleyin. Pax6, hücre süspansiyonu 100 ul PE karşıtı Pax6 5 ul ilave edin. MITF, hücre süspansiyonu 100 ul anti-MITF 5 ul ilave edin. </li><li> Karıştırın ve 60 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. FACS lekeleme tampon maddesi 3 ml ilave edilir. 10 dakika için 600 xg&#39;de karıştırın ve santrifüj. Süpernatantı ve iki ek kez 8,16 tekrarlayın. </li><li> MITF boyama için, ikincil Antibo hücreleri inkübedy, 1 bir seyreltme keçi anti-fare Alexa Fluor 488: 4 ° C &#39;de 1 saat süre ile 2000. Pax6 boyama için, bu adımı kaçının. </li><li> 10 dakika boyunca 600 x g&#39;de, FACS lekeleme tampon maddesi ve santrifüj 5 ml hücreleri yıkayın. Iki kez bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Hücre pelet bozmaya hafifçe FACS boyama tampon ve vorteks 500 ul hücrelerin tekrar. Numuneler akım sitometri analizi için hazırız. </li></ol> 9. IPS-RPE İzolasyon ve Kültür <ol><li> Günün 29 at, dikkatli bir 200 ul pipet kullanarak kültür plaka seçilen pigmentli koloniler etrafında kesti. 15 ml konik tüp yüzen koloniler aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 600 x g&#39;de santrifüj koloniler çıkartıldı ve süpernatan. </li><li> 10 dakika boyunca 600 x g&#39;de DMEM / F12 ve santrifüj 10 ml hücre kolonileri yeniden süspanse. Süpernatantı. </li><li> 7-10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de% 0.25 tripsin ve 2 ml koloniler inkübe edilerek, tek bir hücre süspansiyonunun hazırlanması. Yavaşça koloniler ayırmak için hücre süspansiyonu vorteks. </li><li> IPS-RPE orta 2 ml ekleyerek tripsin nötralize eder. 10 dakika için 600 xg&#39;de Santrifüj ve süpernatant atın. IPS-RPE orta 2 ml bir tekrar süspansiyon hücreleri. 37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem ile bir kuluçka makinesi içinde bir protein matrisi kaplanmış 6-yuvalı plaka ve yeri içine hücreleri aktarın. </li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures.">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li><li>Reubinoff, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+functional+retinal+pigmented+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).</li><li>Ukrohne, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+small+molecules+and+OCT4+reprogrammed+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).</li><li>Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+outside+the+liver:+induced+pluripotent+stem+cells+for+hepatic+applications.">Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications.</a> World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).</li><li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells:+a+source+of+cardiac+regeneration.">iPS cells: a source of cardiac regeneration.</a> J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).</li><li>Mak, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+greatly+improve+conversion+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+to+the+neuronal+lineage.">Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage.</a> Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories.">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Cour la, M., Tezel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Retinal+Pigment+Epithelium.">The Retinal Pigment Epithelium.</a> Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).</li><li>Vaajassari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+defined+and+xeno-free+differentiation+of+functional+human+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells.">Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.</a> Mol Vis. 17, 558-575 (2011).</li><li>Carr, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+human+iPS-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+transplantation+in+the+retinal+dystrophic+rat.">Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat.</a> PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).</li><li>Muniz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid+uptake,+processing,+and+secretion+in+human+iPS-RPE+support+the+visual+cycle.">Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).</li><li>Meyer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+inducing+embryoid+body+formation:+in+vitro+differentiation+system+of+embryonic+stem+cells.">Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells.</a> J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).</li><li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers.">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).</li><li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+aggregation+of+defined+numbers+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+fosters+robust,+reproducible+hematopoietic+differentiation.">Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation.</a> Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hücre tedavisi için pluripotent kök hücrelerin tam söz gerçekleştirilmesi için, tutarlı ve tekrarlanabilir bir şekilde kendi farklılaşma atılması için gereklidir. Bu rapor, mikro plaka teknolojisini kullanarak boyutu kontrollü EBS oluşturan RPE doğru farklılaşma başlatmak ve RPE protein ve gen göstergeleri tanımlamak için protokolleri açıklar. In vitro olarak farklılaşma senkronize etmek için, EBS homojen boyutları zorunlu agregasyonu mikro plakalara santrifüj iPS hücrelerinin bi...

Uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri dış faktörlerin 1 yetişkin hücrelerinin yeniden programlanması türetilen pluripotent kök hücrenin bir türüdür. Bunun aksine, embriyonik kök hücrelerin (EKH), pluripotent kök hücrenin başka bir tip blastosist 2-3 iç hücre kitlesi elde edilmiştir. Farklı kökenlerden rağmen, iPS hücreleri ve EKH in vitro ve herhangi bir hücre tipine 4-5 içine ayırt etme kapasitesinde çoğaltmak için onların sınırsız kapasite karşılaştırılabilir. IPS hücrelerinin bu özellikleri onları kişiselleştirilmiş rejeneratif tıp uygulamaları için ideal bir aday olun. Son araştırma çabaları retina pigment epiteli (RPE), 6-11 dahil olmak üzere özel yetişkin hücreleri üretmek için sağlam farklılaşma protokolleri geliştirmeye odaklandık. IPS türetilen hücrelerin potansiyel klinik uygulamaları için, belirli bir hücre tipi için yönlendirilmiş bir farklılaşma gereklidir. Çeşitli yöntemler vardıronların verimlilik 6-7, 12-16 büyük ölçüde değişir RPE içine hem EKH ve iPS hücrelerinin yönettiği farklılaşması için yayınladı. Biz hala geliştirme veya farklılaşması sırasında hücre / doku kaderi yöneten moleküler olayların pek bilmiyorum. Son yıllarda, çabalar mümkün olduğunca embriyonik gelişimini taklit edebilir farklılaşma protokol geliştirmek için girişimlerde bulunulmuştur. Blastosist aşamasında, kök hücrelerin kaydedilmemiş nüfusu üç boyutlu mikroçevresinin birlikte bulunmaktadır. Yani, çeşitli stratejiler araya ESC / iPS hücrelerini yapmak ve üç boyutlu onları büyümeye uygulanmıştır. Bu kök hücre agrega embriyoid organları (EBS) denir. Çalışmalar kök hücrelerin EB farklılaşma embriyo gelişiminin erken evre taklit ve kendiliğinden onun dış yüzeyinde ilkel endoderm neden olduğunu göstermiştir. EB gelişme ilerledikçe sonra, her üç germ soylarının farklılaştırılmış hücre fenotipleri 17-18 görünür. Therefore, EBS tabanlı farklılaşma protokolleri ESC / iPS hücrelerinin in vitro farklılaşması için dikkat çekti ve pluripotent kök hücrelerinden 13 den RPE nesil için iyi bir aday olduğunu var. EBS ESC / iPS hücrelerinden çeşitli yöntemlerle yapılabilir. Başlangıçta, EBS yapışkan koloniler kazıma ve yapışmayan süspansiyon kültürü içinde muhafaza edilerek yapılmıştır. Ancak, bu yaklaşım, düşük tekrarlanabilirlik neden EBS heterojen nüfus verir. Asma damla hücre kültürü ve mikro temelli EBS formasyonu oldukça tekrarlanabilir tanımlanan boyutlarda homojen EBS verim EBS oluşumu için diğer popüler teknikler vardır. Ayrıca, mikro tekniği daha az çaba ile agreganın çok sayıda elde edebilirsiniz. EBS içindeki hücrelerin farklılaşması dışı ve hücre içi mikroçevreden morfojenik ipuçları bir multiplex tarafından düzenlenir. Bir mon farklılaşma aksineolayer biçimi, EBS hücrelerin karmaşık montaj ve 17 oluşmasına arası sinyalizasyon için bir platform sağlar. İlginç bir şekilde, tek tek EBS yapmak için kullanılan pluripotent kök hücre sayısı hücrelerin kaderini etkileyen gözlenmiştir. 1000 hücre EB eritroid soy 20 doğru itilir ise, örneğin, insan EKH bir hematopoietik farklılaşma çalışmada 500 hücre EB myeloid doğru farklılaşmasını teşvik ettiği görülmüştür. Bir başka çalışmada, küçük EBS nöro-ektoderm farklılaşma 11, 17 doğru terfi büyük EBS ise endoderm farklılaşma tercih. Bu geçmiş çalışmalar kuvvetle bireysel EBS yapmak için kullanılan ESC / iPS hücrelerinin sayısı herhangi bir hücre tiplerine farklılaşma esaslı EBS etkilediğini göstermektedir. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, RPE doğru ayırt etmek eğiliminde EBS büyüklüğü etkisini aydınlatılamamıştır var hiçbir geçerli çalışmalar vardır. Bu çalışmanın amacı etkisini karakterize etmekRetina pigment epiteli (RPE iPS-) farklılaşma ve RPE soy yönelik farklılaşması için EBS yapmak için en uygun hücre sayısını belirlemek için - uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri üzerine EB boyutu.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 media + 5x supplement</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-7154</td><td></td></tr><tr><td>Non essential amino acids</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>Knockout serum replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM media</td><td>Life Technologies</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>N1 supplement</td><td>Sigma</td><td>N-6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Triiodo-L-thyronine sodium&amp;nbsp; salt</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 plate</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27940</td><td></td></tr><tr><td>AggreWell medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5893</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-PAX6 antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-RX antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab23340</td><td></td></tr><tr><td>Mouse&amp;nbsp; Anti-MITF antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-772-P</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-ZO-1 antibody</td><td>Invitrogen</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy plus mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Promega</td><td>M7502</td><td></td></tr><tr><td>High capacity RNA to cDNA kit</td><td>Life Technologies</td><td>4387406</td><td></td></tr></tbody></table>

deriving retinal pigment epithelium (rpe) from induced pluripotent stem (ips) cells by different sizes of embryoid bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

Bu deneyde, iPS hücreleri kültüre ve EBS gelen RPE soy içine ayırt. Kontrol boyutlarda EBS mikro plakalar kullanılarak oluşturulmuştur. Şekil 1, EB oluşumu görüldüğü gibi, mikro plakalar içinde homojen olduğu görülmüştür. Bu EBS sonra, (Şekil 2), toplandı ve 6-delikli plakalar üzerine plakalandı. RPE RPE işaretlerinin da klasik altıgen morfolojisi, pigmentasyon ve ifade ile tespit edilebilir. 12 haftalık kültür sonrası, 200 h?...

Watch this Scientific Journal Video about Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies at JoVE.com

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Bu raporun amacı, embriyoid organlarının farklı boyutlarda kullanılarak uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerden retina pigment epiteli (RPE) elde etmek protokolleri tanımlamaktır.

Embriyoid Kuruluşlarının Farklı Boyutları tarafından uyarılmış pluripotent kök gelen Retina pigment epiteli (RPE) türetilmesi (iPS) Hücreler

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

deriving-retinal-pigment-epithelium-rpe-from-induced-pluripotent-stem

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

10.5K Görüntüleme.  U.S. Army Institute of Surgical Research.  Bu raporun amacı, embriyoid organlarının farklı boyutlarda kullanılarak uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerden retina pigment epiteli (RPE) elde etmek protokolleri tanımlamaktır. 

Video: Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Gelişim Biyolojisi

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

Transplantasyonu uygun Retina Pigment epitel doku mühendisliği insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Süspansiyon Retina pigment epiteli Hücreleri sunun Kemirgenler Subretinal Enjeksiyonları Sahne

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Tıp

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative therapies. This protocol describes a simpler, robust, and stepwise method of generating retinal organoids in a hybrid culture system consisting of adherent monolayer cultures during the first 4 weeks of retinal differentiation till the emergence of distinct, self-organized eye field primordial clusters (EFPs). Further, the doughnut-shaped, circular, and translucent neuro-retinal islands within each EFP are manually picked and cultured under suspension using non-adherent culture dishes in a retinal differentiation medium for 1-2 weeks to generate multilayered 3D optic cups (OC-1M). These immature retinal organoids contain PAX6+ and ChX10+ proliferating, multipotent retinal precursors. The precursor cells are linearly self-assembled within the organoids and appear as distinct radial striations. At 4 weeks after suspension culture, the retinal progenitors undergo post-mitotic arrest and lineage differentiation to form mature retinal organoids (OC-2M). The photoreceptor lineage committed precursors develop within the outermost layers of retinal organoids. These CRX+ and RCVRN+ photoreceptor cells morphologically mature to display inner segment-like extensions. This method can be adopted for generating retinal organoids using human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). All steps and procedures are clearly explained and demonstrated to ensure replicability and for wider applications in basic science and translational research.

This protocol describes an efficient method of differentiating hiPSCs into eye field clusters and generating neuro-retinal organoids using simplified culture conditions involving both adherent and suspension culture systems. Other ocular cell types, such as the RPE and corneal epithelium, can also be isolated from mature eye fields in retinal cultures.

Sağlıklı ve Retina Hastalığına Özgü İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Retinal Organoidlerin Üretimi

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Gelişmiş 3D Nöral Retina Farklılaşması

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of retinopathy. Unfortunately, ethical barriers hinder the collection of evidence from humans. Recently, numerous studies have shown that human pluripotent stem cells (PSCs) can be differentiated into retinal organoids (ROs) using different induction protocols, which have enormous potential in retinopathy for disease modeling, drug screening, and stem cell-based therapies. This study describes an optimized induction protocol to generate neural retina (NR) that significantly reduces the probability of vesiculation and fusion, increasing the success rate of production until day 60. Based on the ability of PSCs to self-reorganize after dissociation, combined with certain complementary factors, this new method can specifically drive NR differentiation. Furthermore, the approach is uncomplicated, cost-effective, exhibits notable repeatability and efficiency, presents encouraging prospects for personalized models of retinal diseases, and supplies a plentiful cell reservoir for applications such as cell therapy, drug screening, and gene therapy testing.

Yazar Spotlight: Hastalık Modellemesi için Basit ve Verimli Nöral Retina Organoid Üretimi

The present protocol describes an optimized 3D neural retina induction system that reduces the adhesion and fusion of retinal organoids with high repeatability and efficiency.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Nöral Retina Üretimi

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Embriyoid Kuruluşlarının Farklı Boyutları tarafından uyarılmış pluripotent kök gelen Retina pigment epiteli (RPE) türetilmesi (iPS) Hücreler

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için

Transplantasyonu uygun Retina Pigment epitel doku mühendisliği insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş

Süspansiyon Retina pigment epiteli Hücreleri sunun Kemirgenler Subretinal Enjeksiyonları Sahne

Sağlıklı ve Retina Hastalığına Özgü İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Retinal Organoidlerin Üretimi

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Nöral Retina Üretimi

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Nöral Retina Üretimi

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Nöral Retina Üretimi

İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli