Name: methods for cell-attached capacitance measurements in mouse adrenal chromaffin cell
Uploaded: 2014-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell at JoVE.com

This work is supported by a National Science Foundation award (1145581) to LWG.

NOT: Chicago Illinois Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan tüm prosedür, Ulusal Sağlık Enstitüleri kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. Çözümleri ve Kültür Medya Hazırlıklar <ol><li> Altı aya kadar -20 ° C&#39;de tüm çözümleri tutun. 3 aya kadar 4 ° C &#39;de kültür ortamı tutun. </li><li> DMEM ile 100 ml ITSX (İnsülin-Transferrin-Selenyum takviyesi-) 1 Pen-strep çözeltisi ve 1 ml kültür ortamı karıştırılarak 100 ml hazırlayın. </li><li> DMEM, 250 mi, 100 mM CaCl2, 2.5 ml ve 50 mM EDTA, 2.5 ml enzim çözeltisi karıştırarak hazırlayın. </li><li> DMEM, 225 ml FBS, 25 ml, 625 mg albumin ve 625 mg tripsin inhibitörü karıştırılarak inaktivasyonu çözeltisi hazırlayın. </li><li> 154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 5,0 mM HEPES, 3.6 mM NaHCO3, 5,6 mM glikoz, bir Locke çözeltisi hazırlayın. NaOH ile 7.3 pH ayarlayın. </li><li>50 mg / ml &#39;lik bir poli-D-lisin (PDL) çözeltisi hazırlayın. Kat lamelleri, 1 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyon kullanın. </li><li> 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM CaCI2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH, 10 mM glukoz, hücre dışı bir çözelti hazırlayın. ~ 310 nmol / kg &#39;lık bir ozmolarite NaOH ile 7.3 pH ayarlayın. </li><li> 50 mM NaCI, 100 mM TEACl, 5 mM KCI, 2 mM CaCI2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, bir pipet çözeltisi hazırlayın. ~ 290 nmol / kg &#39;lık bir ozmolarite NaOH ile 7.3 pH ayarlayın. </li></ol> 2. Adrenal İzolasyon <ol><li> Büyük ve küçük diseksiyon makas ve forsepsle iki çift bir çift otoklava. Bütün bu işlemler sırasında eldiven giyin ve bir buz kovası diseksiyon tepsiye yerleştirin. </li><li> Gün, 0-3 alındığı fareler kullanır. Dekapitasyon basınçlı CO 2 tankı ile hayvan öldürülür. </li><li> Cervi&#39;de gelen omurga aşağıdaki yavru geri kesmek için makas küçük kümesi yararlanın<html> cal bölgeyi kaudale. Deri altında yüzeysel kesilir ve vücut boşluğuna delmek değil emin olun. </li><li> Sonraki uzak omurga soyma cilt bu kaslar omurga net bir görünümü var maruz böylece. Buradan, servikal spinal kord bir transectional kesim yapmak ve daha sonra omurga kenarları boyunca iki paralel kesim yapmak. </li><li> Hayvanın ana gövdesini tutan forseps bir çift, omuriliğe kapmak ve böbrekler maruz dek omurga geri soymak için forseps diğer çifti kullanın. </li><li> Bu noktada, böbreklerin üstüne böbreküstü bezleri görselleştirmek. Daha sonra dikkatli bir Locke çözeltisi ile doldurulmuş bir konik tüp içine her hayvandan iki bezi yerleştirin. NOT: Bazen bezleri forseps sadık olacaktır. Bu durumda, yavaşça Forseps ve Locke çözelti içine bezlerinin bertaraf edilmesine yardımcı olmak için başka bir çift forseps kullanır. Bezleri 2 saat kadar bu durumda muhafaza edilebilir. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Doku sindirimi <ol><li> Bu arada, kabarcık, 15 dakika boyunca% 5 CO2 +% 95 O2 ile enzim solüsyonu kullanımdan önce. Dengelenmiş çözüm pembemsi / turuncu renk içine bir parlak pembe renk döner emin olun. </li><li> 20-25 ünite / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda taze olarak kabarcıklar halinde enzim çözeltisine papain ekleyin. , Papain ile enzim çözeltisi içerisinde 37 ° C&#39;de 40-60 dakika boyunca, her bir hayvandan bezlerinin her çift inkübe edin. </li><li> Her tüpe inaktivasyon çözeltisi% 75 ilave edildikten sonra 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Bu inkübasyon papain enzim aktivitesini eylemsiz hale getirir. </li><li> Inaktivasyonu çözeltisi ile 10 dakika süreyle inkübe edildikten sonra, yavaşça yeni etiketli tüpe aktarın ve bezleri bezleri kültür ortamı ile 3 kez yıkayın. </li></ol> 4. Hücre Ayrılma ve Kaplama <ol><li> Yıkama işleminden sonra, kültür ortamı içine 200 ul iki bezi yerleştirin ve sonra yavaşça bezleri ve titreaşağı 200 ul pipet pipet ucu ile artık çözelti içinde dokusunun büyük bir parçası kalmayıncaya kadar. Not: titre zaman, 200 ul pipet ucu aşağıya doğru bir kuvvet ile tüpün alt bezleri ve muhafaza ve yavaşça doku girerler. , Yavaş, sürekli darbeleri kullanmak için belirli olun asla hızlı veya ani pipetlerken. </li><li> 450 ul kadar kültür ortamı toplam hacmi getirmek için ek bir 250 ul kültür ortamı ekleyin. </li><li> Plaka, bir 60 x 15 mm kültür tabağına yerleştirilir yedi ila 12 mm PDL önceden kaplanmış lamelleri, her biri üzerine, bu, hücre-ihtiva eden çözelti, 60 ul. </li><li> Bir kez kaplama, hücre canlılığı için bir ortam sağlamak için 30 dakika boyunca% 5 CO 2 sürekli bir akış / arz ile 37 ° C ayarlanır ve muhafaza kuvöz içine koyunuz. İnkübasyondan sonra, yavaşça kültür kabı içine önceden ısıtılmış kültür ortamı 5 ml ilave edilir ve 24 saat süreyle tekrar inkübatör içine yemeğin geri hücre ataşe öncesinded kayıtları. Not: Hücreler tipik olarak, en fazla 4 gün boyunca elektrofizyolojik kayıtları için kullanılabilir. </li></ol> 5. Hücre Tanımlama ve gigaohm Seal Oluşumu <ol><li> Hücre dışı çözelti içine 12 mm&#39;lik bir örtücü cam yerleştirin. Bütün böbreküstü bezleri hücre hazırlanması için kullanılan bu yana, kortikal hücreleri (küçük ve) hücreleri kromafin daha sönük kültür içinde kromaffin hücreleri (kahverengimsi / bej rengi ve mükemmele yakın bir dairesel formlu, genellikle çok parlak (Şekil 1) karıştırın. </li><li> Programlanabilir P-97 çektirmenin kullanarak dört aşamada yama pipetler çekin. Daha sonra cam kapasitenin azaltılması ve yardımcı olacak bir erimiş mum içine pipet ucu batırın pipet içerisinden ucu &quot;darbe-away&quot; lehçe bu balmumu ateş. Not: Yama pipet çözeltisi ile doldurulan, yama pipetler genellikle yaklaşık 2 M? Bir dirence sahiptir. </li><li> Birkaç metre içinde hücreye yakın yama pipet Yaklaşımicrons. Hücreye bağlı bir konfigürasyon elde etmek için, hücreye yakın yama pipet yaklaşması sırasında herhangi bir hafif hücre deformasyon için bak. Bir GΩ mühür elde edilinceye kadar nazik vakum uygulayın. </li></ol> 6. Hücre-Ekli Kapasite Kayıtlar <ol><li> Bir mühür ortaya GΩ sonra, EPC-7 artı yama-kenet büyütücü kullanımı ile hücre bağlı kayıt yapmak ve iki fazlı bir analog kilidi amplifikatör (ekipman ekli tabloya bakınız). Kilit-amplifikatör 50 mV (rms) genlik ve 20 kHz frekans ile bir sinüs dalgası uygulayın. </li><li> 1 msn zaman sabiti ve 24 db de kilit-amplifikatör çıkış filtre ayarlayın. Kilit-amplifikatör gibi nazik emme bakliyat tarafından üretilen geçici kapasite değişiklikleri sadece yama iletkenlik (Re) iz içine hiçbir projeksiyon ile yama kapasitans (Im) iz görünür ki (Şekil 2) fazını ayarlayın. NOT: bir yeniden sistemin kalibrasyonu için ayrıntıları bakın19 Ference. </li><li> &quot;Aşağıya doğru&quot; adımlar (Şekil 3) ile tipik kapasite değişiklikleri belirlemek. NOT: Bir katı kayıt Tek veziküllerini içselleştirerek gösterir birçok aşağıya doğru adımlarla bir &quot;merdiven&quot; tipi benzerliği olarak görülecektir. Yama işlemi eylem akım tipik olarak en hücrelerinden kaydedilmiş olacağından mekanik uyarım olarak hizmet vermektedir. </li><li> Bu dosya içinde aa / gg / yıl ve kendi bireysel numaralandırma (xx) gibi her hücre bağlı kayıt: Bireysel tarih dahil klasörler gibi dosyaları isim. </li></ol>

<ol>
	<li>Rettig, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+presynaptic+proteins+in+Ca++-triggered+exocytosis.">Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis.</a> Science. 298, 781-785 (2002).</li><li>Gong, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+phosphate+kinase+type+I+gamma+regulates+dynamics+of+large+dense-core+vesicle+fusion.">Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).</li><li>Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fusion+pore.">The fusion pore.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1641, 167-173 (2003).</li><li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389, 509-512 (1997).</li><li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitance+flickers+and+pseudoflickers+of+small+granules,+measured+in+the+cell-attached+configuration.">Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration.</a> Biophys J. 75, 53-59 (1998).</li><li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+fusion+pore+of+small+granules+has+a+conductance+similar+to+an+ion+channel.">The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel.</a> The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).</li><li>Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+amperometry:+high-resolution+measurements+of+single-vesicle+fusion+and+release.">Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release.</a> Nat Methods. 2, 699-708 (2005).</li><li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells.">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li><li>Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytotic+catecholamine+release+is+not+associated+with+cation+flux+through+channels+in+the+vesicle+membrane+but+Na++influx+through+the+fusion+pore.">Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore.</a> Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).</li><li>Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+vesicles+membrane+area+is+regulated+in+tandem+with+quantal+size+in+chromaffin+cells.">Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).</li><li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+does+not+provide+direct+mechanical+forces+for+vesicle+fission+during+clathrin-mediated+endocytosis.">Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).</li><li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin+1+is+necessary+for+the+Ca2++dependence+of+clathrin-mediated+endocytosis.">Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).</li><li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis.">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).</li><li>Murthy, V. N., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+the+presynaptic+terminal.">Cell biology of the presynaptic terminal.</a> Annu Rev Neurosci. 26, 701-728 (2003).</li><li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses.">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li><li>Rosenboom, H., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exo-endocytosis+and+closing+of+the+fission+pore+during+endocytosis+in+single+pituitary+nerve+terminals+internally+perfused+with+high+calcium+concentrations.">Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).</li><li>MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+increases+endocytotic+vesicle+size+and+accelerates+membrane+fission+in+insulin-secreting+INS-1+cells.">Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).</li><li>Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+inhibition+of+endocytosis:+novel+roles+for+noradrenaline+and+G+protein+G(z).">Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z).</a> J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).</li><li>Debus, K., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+patch+capacitance+recordings+and+of+fusion+pore+conductances+in+small+vesicles.">Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles.</a> Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Hücre bağlı kapasite ölçümleri başarılı bir şekilde yüksek kalitede ses kayıtları elde etmek için bazı kritik adımları gerektirir: böbreküstü bezlerinden hazırlanmış 1) canlı ve sağlıklı hücreleri; Lamelleri 2) PDL kaplama; 3) gigaohm yalıtım oluşturma; 4) sistem gürültü seviyesi; ve 5) faz düzeltme. Hayvan ameliyatı için bir potansiyel yapabilirsiniz değişiklikler en uygun dirayeti cerrahi yaklaşımı ayarlamak ve diseksiyon sırasında zarar görmesini önlemektir. Elektrofizyolojik kayıtlar için kullanılacaktır hücreleri böbreküstü bezinin medulla münhasıran gelmek gibi Ayrıca, bulma ve böbreküstü bezleri kaldırılması yeterli uygulama zorunludur. Enzimi sindirimi için,% 5 CO2 +% 95 O 2 solüsyonu köpürtülmesi ile enzim çözeltisinin denge sağlaması için önemlidir. Silindire bağlı boru hiçbir sızıntıları ile yeterli ve sıkı olduğundan emin olun. Ayrıca, emin olun ki son,n çözümü düzgün bütün 15 dakika köpüren zamanında yerleştirilir; Bu uygun bir hava akışını yönlendirmek üzere borunun sonunda körleştirilmiş olan bir 20 G iğne ucunun yerleştirilmesi ile elde edilebilir. Dahası, bu adım için ek süre tüp içinde çözüm taşma gibi hava akımı o kadar güçlü değil sürece zarar vermez. Hücre titrasyon uygulama alacak bir başka önemli bileşenidir. Aşırı titre halinde hücrelerin çoğunluğu hasar görebilir; titrasyon yeterli değilse tersine, ayrışmış dokulardan çok az tek bir izole hücre olacaktır. Etkili titre için, titre gibi bezleri hafifçe 200 ul pipet geçirilir emin, aşağı 7-8x kadar pipetle 200 ul pipet kullanmak ve. PDL kaplama için, bir zaman lamelleri yeterli kaplama sağlamak için 3 saat kadar lamelleri PDL kuluçka süresini uzatabilirsiniz. PDL kaplama eklemek hücrelerin kromafin için kritikve hücre kaplama sonra lamelleri üzerinde büyür. PDL kaplama yeterli değilse, hücrelerin en gigaohm yalıtım oluşturma zorlaştıracaktır lamel, ayırmak edilecektir. Yama teknik özel bir süreç gibi hücre kayıtları bağlı, her zaman değiştirilebilir ve geliştirilebilir. Yumuşak ve ince, emme ve hücre yama pipet temas içinde olduğunda gigaohm conta oluşumunu kolaylaştırarak kritiktir. Çok fazla emme ucu yama hücre temas yok edecek ve aşırı durumlarda, hücreler, Patch-pipetinin içine emilebilir. Bu çok kolay bir bütün hücre yapılandırma içine değiştirerek veya bir çok büyük dönen çok az bir direnç tarafından osiloskopta görülecektir; uygulama, yüksek kaliteli gigaohm conta oluşumunu elde etmek için büyük önem taşımaktadır. Yüksek sızdırmazlık direnci hücre bağlı kayıtlarında gürültü seviyesini en aza indirmek için kritik olsa da, aşağıdaki iki aşama da vardırTek endositik olayları çözmek için gürültü seviyesinin düşürülmesi önem: (1) Yama pipet çözümde, TEACl voltaj kapılı K + kanallarının bloke etmek için kullanılır; (2) pipet ucu yapışkan balmumu ile kaplanır ve pipet içindeki mum ısı taşlama işlemi ile kaldırılabilir. Protokol aşama 6.2 detaylı faz ayarlama kayıt sürecinin ilk aşaması kurmak için kritik olsa da, bu adım ideal olmayabilir. Bu nedenle, bireysel olaylar için fisyon-gözenek analizi sırasında faz düzeltme gerçekleştirmek için önemlidir. -65 MV bir dinlenme membran potansiyelinde, tam-hücre kayıtları tipik bir fare kromafin hücresi, fare kromafin hücrelerinin membran iletimini ~ hesaplar 5 pF bir giriş kapasitansı ve 500 M?, Bir giriş direnci olduğunu göstermektedir 0,4 pS / fF. Bu 1 fF bir kapasite büyüklüğü ile bir endositik olay ~ 0.4 pS membran iletkenliği net zarara neden olacağını ima eder. Bu değer en kıyasla ihmal edilebilirypical 50-100 pS iletkenlik değişim zarı hücre bağlı kayıtları endositik fisyon-gözenekli kapanması ile ilişkili. Bu nedenle, bizim faz düzeltme bize böyle öncesi ve sonrası fisyon-gözenek kapatma aynı seviyede olduğunu zar iletkenliği taban çizgisini ayarlamak için izin verir eminiz; Bu süreç bizim veri analizi içine &lt;% 1 hata getirebilir. Özet olarak, burada açıklanan protokol hücre bağlı kapasitans kayıtları model sistem olarak fare kromafin hücreleri kullanılarak tek bir vezikül endositoz izlemek için kullanılabilir gösterilmiştir. Bu teknik bir endositoz sırasında vezikül fizyon için düzenleyici mekanizmaların analiz etmeyi sağlar.

Sinaptik nörotransmiter içeren sinaptik veziküllerin ekzositozu aracılık eder ve bu veziküller uzun vadede nöronal iletişim sağlamak için sinir terminal içinde yerel endositik geri dönüşüm geçmesi gerekmektedir. Sinaptik vezikül döngüsü, bir bütün olarak, hücresel haberleşme daha iyi bir kavramaya yönelik gerekli bir temel teşkil eden moleküler makine anlaşılması, sinaptik iletim temel rolü göz önüne alındığında. Hücre modeli sistemleri arasında, adrenal kromafin hücre sinaptik vezikül geri dönüşüm altında yatan moleküler makineler içine en kesin içgörü bazı sağlamıştır. Ekzositoz, nörotransmitter açıklamasında son adım, son derece okudu ve adrenal chromaffin hücrenin 1,2 kullanımı yoluyla incelenmiştir. Aslında, salgı granüllerin oluşumuna, hedefleme, yerleştirme ve füzyon orkestra moleküler oyuncu büyük çapta div uygulanmasından tespit edilmiştirkromafin hücreleri 1 erse teknikleri. Ayrıca, Ekzositoz katılan protein makine tek-vezikül çözümü için izin için bir fırsat sağlayarak, kromaffin hücre vezikül füzyonu 3 soruları yanıtlamak için güçlü bir model kalır. Hücre bağlı kapasitans ölçümleri ilk Ekzositoz 3 sırasında tek vezikül füzyon çözümünde kullanılmıştır. ~ Çapı 60 mil gösterilmiştir kadar küçük veziküller Ekzositoz hücre konfigürasyonda bağlı olarak 4-7 yama kelepçe tekniğiyle birlikte hücre zarı admitans ölçümleri ile tespit edilebilir. Admittans bir devre ya da cihaz, bir akımın akmasına izin verecek kadar kolay bir ölçüsü olarak tanımlanır; Bu empedansının tersidir. Böylece, giriş ölçümler membran kapasitans anlaşılmasını sağlamak. Bu, plazma membranı içine veziküler membranın eklenmesi ile gerçekleştirilir; Bu birleşme yüzeyinde değişiklikler ortayaalan 8. Her bir füzyon vezikül membran kapasitans 9,10 kademeli bir artışa neden olur. Ayrıca, bu geçiri ölçüm membran iletkenliğini ve eksositotik olay 3 sırasında füzyon gözenek iletkenlik sağlar. Bu tekniğin Ekzositoz sırasında tek vezikül kinetiği belirlenmesi eşsiz bir araç sağladı gibi, bizim laboratuvar son zamanlarda tek kesecikler 11,12 endositozu algılamak için bu kavramı başvurdu. Bizim özel ilgi birçok hücreleri 13 ve nöronal terminalleri 14,15 sinaptik vezikül endositoz için bir ana yol olarak temel bir temizlik bileşeni olarak kabul edilmiştir klatrin aracılı endositoz (CME), olduğunu. CME Ancak kinetiği nedeniyle tekil endositik olayların izlenmesinde teknik sınırlamalara tam olarak anlaşılamamıştır, biyolojik olarak önemli olduğu bilinmektedir. Kromaffin hücreleri ve nöronlar arasındaki 1 ekzositik mekanizmalarında benzerlikler dikkate alındığında, plchromaffin hücreleri fisyon mekanizmalar büyük olasılıkla nöronlarda sinaptik vezikül endositoz için geçerli olabilir ausible. Hücre bağlı kapasite ölçümleri bireysel endositik olayları izlemek ve en yöntemleri çözemiyorsanız fisyon kinetik analiz için kullanılmıştır. Bizim hücre bağlı kayıtlarında, 20 kHz&#39;de bir sinüs dalgası tutma potansiyelinden üzerine biner, ve çıkış akımı yükseltici kilitli iki fazdan, başka bir kanalda bir kanal ve membran kapasitans membran iletkenliği ayrılır 16- 18. Membran iletimini ve kapasitanstaki değişimlere kaynaktan, tek bir olasılıkla kabarcık kıstırma önce plazma zarına içe vezikül bağlayan boru şeklindeki zar boynuna karşılık fisyon-gözenekli, kinetiğini hesaplayabilir. Topluca, bu teknik bize CME sırasında vezikül fisyon düzenleyici mekanizmaları incelemek için fırsat verir.

<table><tbody><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>15066024</td><td>Keep out of UV</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Carolina Biological</td><td>633029</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Insulin-Trans-Sel-X</td><td>Life Technologies</td><td>51500056</td><td>Only thaw on ICE!</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>39S11614</td><td></td></tr><tr><td>EPC-7 plus patch amplifier</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090 data acquisition board</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor data acquisition software</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-110-10</td><td>Outer diameter: 1.5 mm&lt;br /&gt;
Inner diameter: 1.10 mm&lt;br/&gt;
Length: 10 cm</td></tr></tbody></table>

methods for cell-attached capacitance measurements in mouse adrenal chromaffin cell

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion known as exocytosis that mediates synaptic transmission. Subsequent retrieval of synaptic vesicles is necessary to generate new neurotransmitter-filled vesicles in a process identified as endocytosis. During exocytosis, fusing vesicle membranes will result in an increase in surface area and subsequent endocytosis results in a decrease in the surface area. Here, our lab demonstrates a basic introduction to cell-attached capacitance recordings of single endocytic events in the mouse adrenal chromaffin cell. This type of electrical recording is useful for high-resolution recordings of exocytosis and endocytosis at the single vesicle level. While this technique can detect both vesicle exocytosis and endocytosis, the focus of our lab is vesicle endocytosis. Moreover, this technique allows us to analyze the kinetics of single endocytic events. Here the methods for mouse adrenal gland tissue dissection, chromaffin cell culture, basic cell-attached techniques, and subsequent examples of individual traces measuring singular endocytic event are described.

Hücre canlılığı ve gigaohm sızdırmazlık kalitesinin hücre bağlı kapasitans kayıtlarının kalitesini belirlemek için önemlidir. Bu nedenle, önceki elektrofizyolojik kayıtları ve tipik yaşayabilir hücrelerin, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir etkili ve verimli bir hücre kültürünü temin etmek önemlidir. Teori ve zaman yüksek kaliteli bir yalıtım elde edilir gigaohm yararlı olacaktır. Bir açık protokol Aşama 5.3 &#39;te tarif edildiği gibi Patch-Pipeti hücre yaklaşmaktadır hücre deformasyon görüldüğünde, yüksek kaliteli bir sızdırmazlık elde etmek için daha iyi bir olasılığı vardır. 3 ile bağlantılı çok sayıda aşağıya doğru adımlarla membran kapasitans tipik bir kaydını gösteren Şekil Tek vezikül endositoz. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52024/52024fig1highres.jpg" /> Canlı fare adrenal kromafin hücreleri Şekil 1. örnekleriHücre kültürü sonra 24 saat. 3 canlı kromaffin hücrelerine Oklar. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52024/52024fig1large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/52024/52024fig2highres.jpg" /> Hücre bağlı kayıtlarında Şekil 2. Faz ayarı. Başlangıç ​​aşaması ayarında, nazik emmelerde geçici hem kapasitans (Im) ve iletkenlik (Re) izleri değişiklikleri ve Re izlemesi projeksiyonlar neden bir 23 ° faz tarafından iptal edilir shift. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52024/52024fig2large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52024/52024fig3highres.jpg" /> Şekil 3. Tipik bir cTek vezikül endositozla ilişkili birden aşağı adımlarla, ile kayıt ell bağlı kapasitans. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52024/52024fig3large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell at JoVE.com

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

Fare Adrenal Kromafin Cell Hücre bağlı Kapasitans Ölçümler Yöntemleri

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

methods-for-cell-attached-capacitance-measurements-mouse-adrenal

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Görüntüleme.  University of Illinois at Chicago. After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

Video: Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Mouse Adrenal Chromaffin Cell Isolation

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting.  This protocol illustrates the method used to dissect the adrenals and then isolate the medullary region by stripping away the adrenal cortex.  The digestion of the medulla into single chromaffin cells is then demonstrated.

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting. This protocol illustrates the method used to dissect the adrenals and then isolate the medullary region by stripping away the adrenal cortex. The digestion of the medulla into single chromaffin cells is then demonstrated.

Fare Adrenal Kromafin Hücre İzolasyonu

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting.  This ...

Biyoloji

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-kelepçe Kapasitans Ölçümler ve Ca 2 + Retina Dilimleri Tek Sinir Terminalleri Görüntüleme

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Nörobilim

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has a broad spectrum of applications. Detection of antigens allows for characterization and identification of multiple cell types. Located above the kidneys and encapsulated by a layer of mesenchymal cells, the adrenal gland is an endocrine organ composed by two different tissues with different embryological origins, the mesonephric intermediate mesoderm-derived outer cortex and the neural crest-derived inner medulla. The adrenal cortex secretes steroids (i.e., mineralocorticoids, glucocorticoids, sex hormones), whereas the adrenal medulla produces catecholamines (i.e., adrenaline, noradrenaline). While conducting adrenal research, it is important to be able to distinguish unique cells with different functions. Here we provide a protocol developed in our laboratory that describes a series of sequential steps required for obtaining immunofluorescence staining to characterize the cell types of the adrenal gland. We focus first on the dissection of the mouse adrenal glands, the microscopic removal of periadrenal fat followed by the fixation, processing and paraffin embedding of the tissue. We then describe sectioning of the tissue blocks with a rotary microtome. Lastly, we detail a protocol for immunofluorescent staining of adrenal glands that we have developed to minimize both non-specific antibody binding and autofluorescence in order to achieve an optimal signal.

Here we present a method to isolate adrenal glands from mice, fix the tissues, section them, and perform immunofluorescence staining.

Yalıtım, fiksasyon ve fare böbreküstü bezlerinin ayirt görüntüleme

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity and the amount of neurotransmitter released from vesicles in single exocytosis events. It has been suggested that the reduction in neurotransmitters expelled is due to alterations in membrane biophysical properties when cells shrink in response to osmotic stress and with assumptions made that secretory vesicles in the cell cytoplasm are not affected by extracellular osmotic stress. Amperometry recording of exocytosis monitors what is released from cells the moment a vesicle fuses with the plasma membrane, but does not provide information on the vesicle content before the vesicle fusion is triggered. Therefore, by combining amperometry recording with other complementary analytical methods that are capable of characterizing the secretory vesicles before exocytosis at cells is triggered offers a broader overview for examining how secretory vesicles and the exocytosis process are affected by osmotic shock. We here describe how complementing amperometry recording with intracellular electrochemical cytometry and transmission electron microscopy (TEM) imaging can be used to characterize alterations in secretory vesicles size and neurotransmitter content at chromaffin cells in relation to exocytosis activity before and after exposure to osmotic stress. By linking the quantitative information gained from experiments using all three analytical methods, conclusions were previously made that secretory vesicles respond to extracellular osmotic stress by shrinking in size and reducing the vesicle quantal size to maintain a constant vesicle neurotransmitter concentration. Hence, this gives some clarification regarding why vesicles, in response to osmotic stress, reduce the amount neurotransmitters released during exocytosis release. The amperometric recordings here indicate this is a reversible process and that vesicle after osmotic shock are refilled with neurotransmitters when placed cells are reverted into an isotonic environment.

Osmotic stress affects exocytosis and the amount of neurotransmitter released during this process. We demonstrate how combining electrochemical methods together with transmission electron microscopy can be used to study the effect of extracellular osmotic pressure on exocytosis activity, vesicle quantal size, and the amount of neurotransmitter released during exocytosis.

Ozmotik stres etkisi salgı veziküller ve ekzositozu izleme

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu<sup&gt; 2 +</sup&gt; Geçici ve Membran Akımlar

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal microscopy was used in combination with patch-clamp recording to detect three fusion modes in primary culture bovine adrenal chromaffin cells. The three fusion modes include 1) close-fusion (also called kiss-and-run), involving fusion pore opening and closure, 2) stay-fusion, involving fusion pore opening and maintaining the opened pore, and 3) shrink-fusion, involving shrinkage of the fusion-generated &#937;-shape profile until it merges completely at the plasma membrane.
To detect these fusion modes, the plasma membrane was labeled by overexpressing mNeonGreen attached with the PH domain of phospholipase C &#948; (PH-mNG), which binds to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) at the cytosol-facing leaflet of the plasma membrane; vesicles were loaded with the fluorescent false neurotransmitter FFN511 to detect vesicular content release; and Atto 655 was included in the bath solution to detect fusion pore closure. These three fluorescent probes were imaged simultaneously at ~20-90 ms per frame in live chromaffin cells to detect fusion pore opening, content release, fusion pore closure, and fusing vesicle size changes. The analysis method is described to distinguish three fusion modes from these fluorescence measurements. The method described here can, in principle, apply to many secretory cells beyond chromaffin cells.

This protocol describes a confocal imaging technique to detect three fusion modes in bovine adrenal chromaffin cells. These fusion modes include 1) close-fusion (also called kiss-and-run), involving fusion pore opening and closure, 2) stay-fusion, involving fusion pore opening and maintaining the opened pore, and 3) shrink-fusion, involving fused vesicle shrinkage.

Adrenal Kromafin Hücrelerinde Üç Füzyon Gözenek Dinamiği Modunu Ölçmek için Konfokal Mikroskopi

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

Tüm cep telefonu Elektrofizyoloji birincil kültürlü fare Enterochromaffin hücre

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Camera-based Measurements of Intracellular [Na+] in Murine Atrial Myocytes

Intracellular sodium concentration ([Na+]i) is an important regulator of intracellular Ca2+. Its study provides insight into the activation of the sarcolemmal Na+/Ca2+ exchanger, the behavior of voltage-gated Na+ channels and the Na+,K+-ATPase. Intracellular Ca2+ signaling is altered in atrial diseases such as atrial fibrillation. While many of the mechanisms underlying altered intracellular Ca2+ homeostasis are characterized, the role of [Na+]i and its dysregulation in atrial pathologies is poorly understood. [Na+]i in atrial myocytes increases in response to increasing stimulation rates. Responsiveness to external field stimulation is therefore crucial for [Na+]i measurements in these cells. In addition, the long preparation (dye-loading) and experiment duration (calibration) require an isolation protocol that yields atrial myocytes of exceptional quality. Due to the small size of mouse atria and the composition of the intercellular matrix, the isolation of high quality adult murine atrial myocytes is difficult. Here, we describe an optimized Langendorff-perfusion based isolation protocol that consistently delivers a high yield of high quality atrial murine myocytes.
Sodium-binding benzofuran isophthalate (SBFI) is the most commonly used fluorescent Na+ indicator. SBFI can be loaded into the cardiac myocyte either in its salt form through a glass pipette or as an acetoxymethyl (AM) ester that can penetrate the myocyte&#8217;s sarcolemmal membrane. Intracellularly, SBFI-AM is de-esterified by cytosolic esterases. Due to variabilities in membrane penetration and cytosolic de-esterification each cell has to be calibrated in situ. Typically, measurements of [Na+]i using SBFI whole-cell epifluorescence are performed using a photomultiplier tube (PMT). This experimental set-up allows for only one cell to be measured at one time. Due to the length of myocyte dye loading and the calibration following each experiment data yield is low. We therefore developed an EMCCD camera-based technique to measure [Na+]i. This approach permits simultaneous [Na+]i measurements in multiple myocytes thus significantly increasing experimental yield.

The intracellular Na+ concentration ([Na+]i) in cardiac myocytes is altered during cardiac diseases. [Na+]i is an important regulator of intracellular Ca2+. We introduce a novel approach to measure [Na+]i in freshly isolated murine atrial myocytes using an electron multiplying charged coupled device (EMCCD) camera and a rapid, controllable illuminator.

Intracellular sodium concentration ([Na+]i) is an important regulator of intracellular Ca2+. Its study provides insight into the activation of the ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Fare Adrenal Kromafin Cell Hücre bağlı Kapasitans Ölçümler Yöntemleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler