Name: mouse fetal liver culture system to dissect target gene functions at the early and late stages of terminal erythropoiesis
Uploaded: 2014-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis at JoVE.com

Bu çalışma NIH R00HL102154 tarafından desteklenen ve P Ji Hematoloji bilim adamı ödülü bir Amerikan Derneği oldu.

Bu protokol açıklanan deneyler Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı. Kültür ortamına hazırlanması 1. <ol><li> Fibronektin çözeltisi hazırlayın. , Insan fibronestini (1 mg) ile bir şişe su 1 ml ilave edilir. Çalkalama olmaksızın 30 dakika boyunca doku kültürü kaputu çözeltisi bırakın. 20 ug / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona yapmak için PBS, 50 ml toplam sıvı transferi ve yavaşça karıştırın. Plakası (aşağıya bakınız) kaplamadan önce fibronektin çözelti taze olun. </li><li> Epo serbest ortamda (SCF orta) 50 ml hazırlayın. Taze yapıldığı zaman Tablo 1&#39;de listelenen katkı maddelerinin bir araya getirin. Ortamı 1 ay boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> EPO ihtiva eden bir ortamda 50 ml hazırlayın. Taze yapıldığı zaman Tablo 2&#39;de sıralanan terkip maddelerinin bir araya getirin. Ortamı 1 ay boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol&gt; 2. Fibronektin Kaplı Plaka <ol><li> 6 çukurlu bir levha (ya da 12 çukurlu bir levhanın her bir çukuruna 0.5 ml) her bir oyuğuna, 1 mi fibronektin solüsyonu ekleyin. 1 saat boyunca doku kültürü kaputu plaka bırakın. </li><li> Iki kez steril su ile kuyu durulayın ve hava plaka kurulayın. </li><li> Plaka sarın ve 4 ° C&#39;de soğuk odada kaydedin. </li></ol> Fetal karaciğer eritroblast 3. saflaştırılması NOT: E15 E13 dan Kullanım fetal ciğeri hamile fareler (C57BL / 6) zaman aşımına. E 13.5 karaciğerler CFU-E progenitörlerin verimini en üst düzeye çıkarmak için tercih edilmektedir. Gebe fareler zamanlı elde edilmesi için, 6-8 haftalık erkek ve dişi fareler bir kafes (bir ya da iki kadın genellikle bir erkek) yerleştirilmiştir. Kadın vajinal fişler çiftleşme başarılı olup olmadığını belirlemek için ertesi sabah kontrol edildi. Fiş bulunduktan sonra gebeliğin ilk günü gündü. <ol><li> Toplam Fetal karaciğer hücrelerinin hazırlanması <ol><li> Mou KurbanCO 2 inhalasyon ve servikal dislokasyon ile se. Dezenfeksiyonu için% 70 etanol ile karın püskürtün. Rahim kaldırmak için diseksiyon makas ile karın açın. 1x PBS rahim yıkayın. </li><li> Bir doku kültürü kaputu ve otoklavlanmıştır araçlarını kullanarak steril koşullar altında fetusa incelemek ve 1x PBS içinde yıkayın. </li><li> Fetusundan fetal karaciğerleri teşrih. Yavaşça başka bir forseps ile vücuttan uzak fetal karaciğer (renkli pembe) çekin, bir forseps ile fetusun gövdesini tutun. Ilişkili fibrotik dokuların kaldırmak için forseps ile fetal karaciğer temizleyin. % 10 fetal sığır serumu içeren taze 1x PBS içine tüm cenin karaciğerleri yerleştirin. </li><li> Mekanik yukarı ve aşağı pipetleme fetal karaciğerleri bozabilir. </li><li> 50 ml konik tüp içine 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre. 5 dakika boyunca 800 x g&#39;de Pelet hücreleri. </li><li> FBS, süpernatan aspire edin ve% 10 1 ml PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri (yaklaşık 8 E 13.5 cenin karaciğeri) ml başına. </li></ol></li><li> Negatif Ter119 eritroblast saflaştırılması <ol><li> 15 dakika boyunca buz üzerinde sıçan IgG&#39;si ile hücreleri (0.2 mg / ml) bloke eder. </li><li> , Yıkama ya da santrifüj olmadan hücre süspansiyonu (1 ug / ml) biyotinile anti-Ter119 antikor ekleyin. Buz üzerinde 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 5 dakika boyunca 800 x g&#39;de 10% FBS (1:10) ve santrifüj ile 1x PBS içinde yıkayın. % 10 FCS içeren 1 ml PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> 75 ul ekle manyetik parçacıklar ile konjüge edilmiş ve buz üzerinde 10 dakika inkübe streptavidin. </li><li> PBS% 10 FBS içeren 2.5 ml hacim ekleyin. Alt tüp yuvarlak 5 ml&#39;lik polipropilen içine hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Manyetik hücre sınıflandırma düzeneğinin içine takın ve tüp, 10 dakika için inkübe edilir. Ter119 pozitif hücreler, tüp yan ekleme. Serbest Ter119 negatif Eritroblastlar süspansiyon halinde kalır. </li><li> Alt tüp yuvarlak yeni bir 5 ml&#39;lik polipropilen içine hücre süspansiyonu dökün. </li><li><html> Tekrar kalan Ter119 pozitif hücrelerini kaldırmak için 3.2.6 ve 3.2.7 adımları. </li><li> 5 dakika boyunca 800 x g&#39;de Pelet hücreleri. Süpernatant aspire. % 10 FBS içeren 1 ml PBS içerisinde yeniden süspanse edin ve hücreleri, tripan mavi ile canlı hücreleri sayın. </li></ol></li></ol> Virüsler kodlayan cDNA ya da shRNA 4. İletimi <ol><li> 3-5 de saflaştırılmış Ter119 negatif cenin karaciğer hücreleri levhası X 10 5/12-gözlü plaka kaplanmış bir fibronektin (farklı plaka kullanılması durumunda, hücre sayısını ayarlamak) olarak. </li><li> Viral iletimini kolaylaştırmak için 10 ug / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar polibren ekleyin. Sıkma 37 ° C 1-1.5 saat boyunca 800 x g hızında, lentivirüsleri ya da retrovirüsler, kodlayan cDNA ya da shRNA ile hücreleri enfekte etmektedir. </li></ol> Kalıt aktarımlı Ter119 Negatif Fare fetal karaciğer eritroblast 5. Kültür <ol><li> (Şekil 1 kesik çizgiler) terminali eritropoezin erken evrede gen fonksiyonlarını test etmek için.&quot;&gt; </ol.><ol><li><ol. li=""> Kültür 12 saat boyunca EPO barındırmayan ortam (SCF ortam) olarak transduse edilmiş hücrelerin transduse genler ve progenitör bir durumun muhafazası ekspresyonunu sağlamak için. </ol.></li><li> 5 dakika boyunca 800 xg&#39;de hücreleri santrifüj. Süpernatant aspire. 12-çukurlu bir levhanın her çukuruna ortam içeren 1 ml Epo süspansiyon hücreleri. </li><li> 24 veya 48 saat kültürden sonra, başka analizler için hücreler hasat edilir. </li></ol></li><li> Terminal eritropoezde (Şekil 1 katı çizgiler) geç evrede Test gen fonksiyonları. <ol><li> Kültür EPO ihtiva eden bir ortam içinde hemen transduse hücreleri. </li><li> 24 veya 48 saat kültürden sonra, başka analizler için hücreler hasat edilir. </li></ol></li></ol> Akış Sitometrik Analizi Kültür Fetal Karaciğer Hücreleri 6. Boyama <ol><li> Yıkayın ve 1x PBS içinde hücreleri tekrar süspansiyon. Hasat akım sitometri analizi için 2 x 10 5 kültür hücreleri. </li><li> Inkübekaranlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca florofor konjuge antikor ile hücreler. Farklılaşmasını test etmek için APC konjuge anti-CD71 ve PE konjüge anti-Ter119 kullanın. Enükleasyonu test etmek için, diğer antikorlar yanı sıra, Hoechst 33342 boyası kullanın. </li><li> 1x PBS ile hücreleri yıkayın. Hücreler ölü hücreleri boyamak ve analiz dışında tutmak için% 1 FBS ve propidyum iyodür (PI) (1 ug / ml) ihtiva eden 0.5 ml PBS içerisinde süspansiyon hücreleri. </li><li> Davranış akış cytrometric analizi. Sitometresinin akışının ayarlanması ve tazminat için ilk tek renk lekeli ve lekesiz kontrolü hücreleri analiz. </li></ol>

<ol>
	<li>Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+stem+cell+to+red+cell:+regulation+of+erythropoiesis+at+multiple+levels+by+multiple+proteins,+RNAs,+and+chromatin+modifications.">From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications.</a> Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).</li><li>Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+cells+red:+signal+transduction+mediated+by+erythropoietin.">Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin.</a> Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).</li><li>Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha4beta1+integrin+and+erythropoietin+mediate+temporally+distinct+steps+in+erythropoiesis:+integrins+in+red+cell+development.">Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development.</a> The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).</li><li>Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+by+erythropoietin+of+viability+and+maturation+of+murine+erythroid+precursor+cells.">Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells.</a> Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).</li><li>Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+2+is+required+for+chromatin+condensation+and+subsequent+enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts.">Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts.</a> Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).</li><li>Dumitriu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox6+cell-autonomously+stimulates+erythroid+cell+survival,+proliferation,+and+terminal+maturation+and+is+thereby+an+important+enhancer+of+definitive+erythropoiesis+during+mouse+development.">Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development.</a> Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).</li><li>Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+hematopoietic+stem+cell+isolation+methods.">Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods.</a> Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).</li><li>Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+characterization+and+isolation.">Hematopoietic stem cell characterization and isolation.</a> Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).</li><li>Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+control+of+terminal+erythropoiesis+via+physical+interactions+among+erythroid+cells.">Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells.</a> Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).</li><li>Bhatia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+fatty+acid-mediated+effects+on+erythropoiesis+in+primary+definitive+erythroid+cells.">Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells.</a> Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).</li><li>Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ras+signaling+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+cells:+functional+analysis+by+a+flow+cytometry-based+novel+culture+system.">Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system.</a> Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).</li><li>Socolovsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).</li><li>Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts+requires+Rac+GTPases+and+mDia2.">Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2.</a> Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).</li><li>Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytokine+signaling+molecules+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+hematopoietic+cells:+functional+analysis+of+signaling+molecules+by+retrovirus-mediated+expression.">Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression.</a> Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).</li><li>Patel, V. P., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fibronectin+matrix+is+required+for+differentiation+of+murine+erythroleukemia+cells+into+reticulocytes.">A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes.</a> The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).</li><li>Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin-induced+suppression+of+erythropoiesis:+the+role+of+erythropoietin+and+a+heme+synthesis+stimulating+factor.">Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor.</a> Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).</li><li>Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+erythropoiesis.">New insights into erythropoiesis.</a> Current opinion in hematology. 9 (2), 93-100 (2002).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Burada kronolojik fare fetal karaciğer terminali eritropoezi analiz etmek için eşsiz bir sistem sunuyoruz. Farklı kültür koşulları uygulama sayesinde, başarıyla erken ve geç evrelerinde terminal eritropoezi disseke. Bu çok işlevli genlerin mekanizmaların belirlenmesi özellikle önemlidir. Örneğin, Rac GTPazlar terminali eritropoezin farklı aşamalarında önemli rol oynar. Terminal eritropoezis etkiler, hücre farklılaşması ve çoğalması erken evrede Rac GTPases engellenmesi. Diğer yandan, hücre farklılaşmasını, proliferasyonunu, 13 veya hayatta kalmasını etkilemeden, terminal blokları eritropoiez enükleasyonu geç evrede rac GTPases aktivitesini inhibisyonu. Bu protokolde birkaç önemli adımlar akılda tutulmalıdır. İlk olarak, bir fare E 13.5 fetal karaciğer Ter119 negatif hücrelerin saflaştırılması için tercih edilir. Eski embriyolar kullanılır ama proporti olabilirTotal fetal karaciğer hücrelerinin üzerinden progenitörlerinin düşük olacaktır. Mekanizma açık değildir, ancak İkinci olarak, bu, bu enükleasyonu için kritik olduğu EPO ortamda düşük endotoksin BSA kullanılması önemlidir. Fibronektin eritropoezde 15 için önemli olduğu bildirilmiştir, ancak Üçüncüsü, biz fibronektin kaplı plakanın kullanımı isteğe bağlı olduğunu ortaya koymuştur. Bizim sistemi içinde hücre çoğalmasını, farklılaşmasını veya enükleasyonu etkilemez. Hücreler, imüno gibi belirli uygulamalar için de önemli olabilir plakasına bağlamak için Ancak, fibronektin yararlı olabilir. Dördüncü, retikülositlerde veya geç evre eritroblast küçük bir yüzdesi dönüştürülmüş hücreler ile gerçekleştirildi GFP sinyalini kaybedebilirsiniz. Veya biz transduced hücreleri izlemek için bir belirteç olarak insan CD4 kullanın. Son olarak, önceki raporlar günde 1 11 kültüründen eritropoietin çıkarılmasını tavsiye etti. Hücre üzerinde anlamlı bir fark yoktu çünkü biz bunu yapmak gerekli değildi bulunduveya eritropoietin kaldırılması olmadan farklılaşma, çoğalma, ya da enükleasyon. Aksine, ortam değişikliği, hücre kaybına neden olabilir. Aynı strateji kullanarak, son zamanlarda, terminal eritropoezi farklı aşamalarında (Zhao ve ark., Yayınlanmamış sonuçlar) içinde yeni işlevleri oyun 30&#39;dan fazla gen keşfedilmiştir. Rac GTPases gibi, bu genlerin pek çok terminal eritropoezin hem erken ve geç evrelerinde ikili işlevleri oyun. Bu terminal eritropoiezde sinyal yolları yakından birbirine olduğunu gösterir. Remodeling aktin hücre iskeleti ve nükleer yoğunlaşma ile ilgili genler terminali eritropoezde boyunca bu sinyal yollarının kritik rolleri nedeniyle ikili işlevleri oyun eğiliminde olanlardır. Diğer taraftan, böyle bir hema sentezi ve eritroid spesifik plazma zarının üretimi gibi yollar ile ilgili genler, terminal eritropoiezde 16,17 erken aşamasında daha kısıtlı olması eğilimindedir. Ther rağmenE böyle nispeten düşük enfeksiyon hücre hatlarının iletimi karşılaştırıldığında verimlilik ve uzun yarılanma ömrü ile proteinleri aşağı vurma güçlüğü gibi bu deneysel stratejinin bazı sınırlamalar vardır, biz gen fonksiyonlarını diseksiyon önem verilen bizim sistemini kullanmak için rutin bir uygulama tavsiye Terminal eritropoezin farklı aşamalarında. Buna ek olarak, bu deneysel strateji başka uygulamalarda da kullanılabilir. Örneğin SCF kültür ortamı koşulları kullanılarak, örneğin kendini yenileme ya da farklılaşma gibi kök hücre özelliklerinin korunmasının katılan genler analiz edilebilir. Geç aşama eritrosit analiz etmek için kullanılan yöntem kullanılarak, bir de organel uzaklaştırılması için Otofaji dahil edilebilir genlerin işlevini belirlemek de mümkündür. Genel olarak, bu deneysel strateji ve bu megakaryopoiesis miyelopoezle gibi diğer hematopoetik sistemlerin fonksiyonel soruşturma uygulanabilir. Bu s başarılı uygulamatrategy aynı zamanda kan hücrelerinin farklı gelişim aşamalarında spesifik genlerin moleküler mekanizmaların gizli tarafını ortaya çıkaracaktır.

Eritrosit oluşumu, eritrositler olgunlaşması için multipotent hematopoetik kök hücrelerin farklılaşması işlemidir. Bu kademeli işlem, ilgili eritroid patlama oluşturan birimler (BFU-Es), hızla bölünen eritroid koloni oluşturan birimler (CFU-Es) ve morfolojik olarak algılanabilen birçok eritroblast 1,2 oluşumunu kapsamaktadır. CFU-E projenitör hücrelerin Terminal eritropoezis sıralı eritropoietin bağımlı ve bağımsız aşamaları 2,3 içerir. Terminal eritropoezi erken aşamasında, eritropoetin (EPO), hücre yüzeyi üzerinde kendi reseptörüne bağlanan ve hücre apoptozu önlemez ve hızlı hücre bölünmesi ve gen ekspresyonunu teşvik 1,4 aşağı doğru sinyal yollarının bir dizi yol açar. Terminal eritropoezin geç evrede, Eritroblastlar derece yoğun çekirdeklerin 5 terminali hücre döngüsü çıkmak, kromatin ve çekirdek yoğunlaşmayı ve ekstrüzyon tabi. Terminalin anlayışımızeritropoezis sayesinde büyük ölçüde in vitro birkaç başarılı kullanımı ve in vivo fare modellerinde 6-9 büyük ölçüde son birkaç on yıl içinde artmıştır. Bu modeller arasında, fare, fetal karaciğer eritroblast vitro kültür içinde hücre arıtma için hızlı çoğalma ve farklılaşma dahil olmak üzere birçok avantaj kolaylığı sağlar ve insan erythropoiesis 10,11 yakından taklit eder. Bu sistemde, fare fetal dokulardan eritroid progenitör hücrelerin çok sayıda kolay Ter119 tek aşamada arıtıldıktan (olgun eritroid hücreler için bir işaret) negatif eritroblast izole edilebilir. Eritroblast iki günlük kültür boyunca, bu, hücrelerin farklılaşması Transferin reseptörüne (CD71) ve Ter119 antijenin 12 yüzey ifadesine dayalı akış sitometrik analizi ile izlenebilir. Buna ek olarak, terminal farklılaşma eritroblast enükleasyonu 1 bir DNA makinesi (Hoechst 33342) tarafından tespit edilebilir3. Bundan başka, arıtılmış ataları genetik olarak cDNA veya erythropoiesis 11,13,14 gen ekspresyonunun fonksiyonlarının mekanistik çalışmalar kolaylaştırır ve ilgilenilen genler için, küçük bir saç tokası RNA (shRNAs) eksojen ekspresyonu ile modifiye edilebilir. Bu terminali eritropoezin farklı aşamalarında gen işlevleri tanımlamak zor olduğundan, diğer taraftan, hızlı hücre büyüme oranı iki ucu keskin kılıç olabilir. Çoğu durumda, bu cDNA&#39;lar veya shRNAs ifade zaman terminalinde eritropoezi erken aşamasında belirli bir gen fonksiyonları, hücreler daha önce ilk aşamayı belirlemek zordur. Bu sorunu çözmek için, biz terminali eritropoezin erken ve geç evreleri incelemek için eşsiz bir sistem geliştirdi. Terminal eritropoezi erken bir aşaması için, genetik olarak tadil edilmiş Ter119 negatif Eritroblastlar EPO içermeyen ortam içeren ama kök hücre faktörü (SCF), IL-6 ve FLT3 kültürlendiligand kendi progenitör statüsünü korumak ve ifade 13 transdüse cDNA&#39;lan veya shRNA izin vermek. Hücreler, hücre proliferasyonunu ve farklılaşmasını uyarmak için 12 saat sonra EPO ihtiva eden ortam ile değiştirildi. Hücrelerin ayırt başladı Bu şekilde, transduse ya da cDNA&#39;lar shRNAs daha önce ifade edildi. Terminal eritropoezi geç aşaması için, negatif Ter119 Eritroblastlar EPO transdüksiyon sonra hemen sıvı ihtiva eden kültürlenmiştir. Bu nedenle, bir terminal eritropoezi geç evrede, ilgi konusu genlerin fonksiyonlarının analiz edebilir. Özetle, bu sistemin geniş bir uygulama terminali eritropoezin farklı aşamalarında teşrih gen fonksiyonlarını yardımcı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s MediumIMDM (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>GEMINI Bio-product</td><td>700-102P</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>100x</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Hyclone</td><td>SH30034.01</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L)</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>14-8001-80</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)&amp;nbsp;</td><td>GEMINI Bio-product</td><td>300-327P</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>STEMCELL TECH</td><td>9300</td><td>10% stock in IMDM</td></tr><tr><td>Erythropoietin(Epo)</td><td>PROCRIT</td><td>NOC 59676-303-00</td><td>3,000 U/ml stock</td></tr><tr><td>Streptavidin particles Plus</td><td>BD Pharmingen</td><td>557812</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>STEMCELL TECH</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml</td><td>FALCON</td><td>352063</td><td></td></tr></tbody></table>

mouse fetal liver culture system to dissect target gene functions at the early and late stages of terminal erythropoiesis

Eritropoez hızla birimleri oluşturan eritroid koloni (CFU-Es) bölünmesiyle ardından taahhüt eritroid patlama oluşturan birimler (BFU-Es) ile başlayan dinamik bir süreç gerektirir. CFU-Es sonra hücreler morfolojik olarak algılanabilen ve genelde bağlantı eritroblastlarda olarak adlandırılır. Terminal eritropoezin çalışma için zorluklardan biri kronolojik bir şekilde gen fonksiyonlarını incelemek için deneysel yaklaşımların olmaması. Bu protokol, biz terminali eritropoezin erken ve geç evrelerinde gen fonksiyonlarını belirlemek için benzersiz bir strateji belirlemelidir. Bu sistemde, bir fare fetal karaciğer Ter119 (olgun eritroid hücre işaretleme maddesi) negatif Eritroblastlar saflaştırılmış ve cDNA veya ilgi duyulan genler için küçük bir saç tokası RNA (shRNAs) eksojen ekspresyonu ile transduse. Hücreler, bundan sonra, eksojen cDNA veya shRNAs izin verirken 12 saat boyunca da projenitör sahne korumak Eritropoietin (EPO) dışındaki ortam ihtiva eden büyüme faktörleri kültürlendiifade etmek. Hücreler, egzojenez genetik malzeme, daha ifade edildi, hücre farklılaşmasını ve çoğalmasını uyarmak için 12 saat sonra EPO ortamına değiştirildi. Bu protokol, terminal eritropoezin erken evre gen fonksiyonlarının analizini kolaylaştırır. Geç aşama terminali eritrosit oluşumunu çalışmak için, hücreler hemen transdüksiyon sonra EPO ortamı içinde kültürlenmiştir. Transduse genetik malzeme olarak ifade edilmiştir, bu durumda, hücreler daha önce, terminal eritropoezi geç dönem için farklılaştırılmıştır. Biz terminali eritropoezin farklı aşamalarında detaylı gen fonksiyonlarını anlamak yardımcı olacak bu stratejinin genel bir uygulama önerilir.

Şekil 1, deneysel stratejileri açıklamaktadır. Bu protokol, terminal eritropoezi erken ve geç aşamalarında sinyal molekülleri Hedef alma fonksiyonları için iki bağımsız koşulları oluşur. Ter119 negatif Fetal karaciğer Eritroblastlar E 13.5 fare fetüs saflaştırılmıştır. Fetal karaciğer eritrosit önce ve saflaştırma işleminden sonra, akış sitometrik analizi ile arıtma (Şekil 2A ve 2B) etkili olduğunu gösterdi. Terminal erythropoiesis (Şekil 1, kesik çizgiler) arasında erken bir aşaması için, viral transdüksiyon sonra, hücreler 12 saat boyunca EPO içermeyen ortamda (SCF ortamı) kültürlenmiştir. Bu süre içinde, hücreler transdüksiyona tâbi tutulmamış hücreler gözlemlenen anlamlı bir apoptoz (GFP pozitif) (Şekil 3) ile en az farklılaşmasını (Şekil 2C) göstermiştir. Hücreler (EPO-içeren ortama transfer edildikten sonra Şekil 4 ayırt başladı </<html> Güçlü&gt;), (Şekil 1, düz çizgiler ve Şekil 5) EPO transdüksiyon sonra hemen ortamı içeren kültürlenmiş hücrelere benzer olan. Her iki yöntemde EPO ihtiva eden bir ortamda 2 gün boyunca kültürü, (CD71 düşük Ter119 düşük) eritroid progenitör hücrelerin çoğu gün 2 (CD71 yüksek Ter119 yüksek) (Şekil 4A ve Şekil üzerindeki transferin reseptörünün uyarılmasının (CD71) ve Ter119 sergiledi 5A). Hoechst yüksek Ter119 yüksek (Eritroblastlar) Hoechst düşük Ter119 yüksek (retikülosit) (Şekil 4B ve Şekil 5B) ile gözlendiği haliyle Enükleasyon, 2. günde meydana geldi. Bu Epo&#39;nun (düz çizgi) hemen hücreler kültür hücrelerden daha farklılaşması ve enükleasyon nispeten daha etkili olduğu dikkat çekmektedir SCF ortamında (kesikli çizgi) kültüre ilk. &quot;&quot; width = &quot;500&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 51894 / 51894fig1highres.jpg 5in /&gt;:&quot; içerik-width = fo &quot;? Güre 1 Şekil 1. Deney stratejisi şematik bakış. Kesik ve katı çizgiler sırasıyla Terminal eritropoezin erken ve geç dönemlerinde sinyal molekülleri incelemek için yöntemlerini temsil eder. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" width="500" src="/files/ftp_upload/51894/51894fig2highres.jpg" /> Farenin Şekil 2. flow sitometri analizleri, fetal karaciğer eritroid hücreler önce ve Ter119 olumsuz eritroblast arıtıldıktan sonra. (A), Ter119 ve CD71 ile lekelenmiş toplam fetal karaciğer hücreleri. Ter119 ve CD71 ile boyanmıştır (B) Temizlenmiş Ter119 negatif hücrelerin. (C) Saf Ter119 SCF bir ortam içinde 12 saat kültürden sonra negatif hücreleri. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51894/51894fig2highres.jpg" target="_blank">pleas</a>E bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" width="500" src="/files/ftp_upload/51894/51894fig3highres.jpg" /> 12 saat boyunca Şekil 3. Akış EPO içermeyen ortam (SCF ortamda) olarak kültürden apoptosis sitometrik analizi. (AB) Ter119 negatif Eritroblastlar yeşil floresan protein (GFP), (B), kontrol kodlayan lentivirüsler (A) ya da lentivirüs ile transdüse edilmiştir. GFP pozitif kalıt aktarımlı hücrelerin yüzdesi TFA ortam içinde kültür 12 saat sonra belirlenmiştir. (B) GFP negatif (C) &#39;apoptoz ve pozitif (D) hücreleri (CD) testi. <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" width="500" src="/files/ftp_upload/51894/51894fig4highres.jpg" /> Transdüksiyona erythrobla farklılaşma ve anükleasyon Şekil 4. Akım sitometri analiziEPO aracını takiben TFA ortamında kültürlenmiştir STS. Şekil 3&#39;te olduğu gibi (A) GFP negatif ve pozitif hücreleri hücreler ek bir 48 saat boyunca ortam EPO ve kültüre edildikten sonra değiştirildi ve CD71 Ter119 kullanılarak diferansiyasyon analiz için geçitlendi. (B) tahlili Enükleasyon Hoechst ve belirtilen bir Ter119 kullanılarak EPO ortam içinde 48 saat sonra, hücreler. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" width="500" src="/files/ftp_upload/51894/51894fig5highres.jpg" /> Epo ortamda doğrudan kültüre Transdüksiyona eritroblast farklılaşma ve anükleasyon Şekil 5. Akım sitometri analizi. (A) GFP negatif hücrelerin Ter119 kodlayan lentivirüs ile transdüse edilmiştir. Hücreler hemen transdüksiyon sonra EPO ortamı içinde kültürlenmiştir. GFP negatif ve pozitif hücrelerin hücre farklılaşması analiz, kültür içinde 48 saat sonra CD71 ve Ter119 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. (B) Enükleasyon deneyiKültür içerisinde 48 saat sonra, ticari olarak Hoechst&#39;den Ter119 kullanılarak belirtilen hücreleri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td> Bileşen </td><td > Miktar </td></tr><tr ><td> IMDM </td><td> 41,385 mi </td></tr><tr ><td> Fetal sığır serumu (FBS,% 15) </td><td> 7.5 mi </td></tr><tr ><td> B-merkaptoetanol (10 -4 M) </td><td> 50 ul (IMDM içinde 10 -1 M stok) </td></tr><tr ><td> Penisilin-Streptomisin (% 1) </td><td> 500 ul </td></tr><tr ><td> Glutamin (2 mM) </td><td> 500 ul </td></tr><tr ><td> Kök hücre faktörü (50 ng / ml) </td><td> 100 ng / ml &#39;stoktan 25 ul </td></tr><tr ><td> FLT3 ligandı (FLT-3 L) (30 ng / ml) </td><td> 50 ng / ml stok, 30 ul </td></tr><tr ><td> , IL-6 (20 ng / ml) </td><td> 100 ng / ml stok, 10 ul </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Madde for SCF orta (EPO ücretsiz orta). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td> Bileşen </td><td > Miktar </td></tr><tr ><td> IMDM </td><td> 36.3 mi </td></tr><tr ><td> FBS (% 15) </td><td> 7.5 mi </td></tr><tr ><td> Sığır Serum Albumin (BSA,% 10) </td><td> 5 ml (% 10 IMDM stoku) </td></tr><tr ><td> İnsülin (10 mg / ml) </td><td> 4 ° C&#39;de 50 ul stok </td></tr><tr ><td> Holo-transferini (200 mg / ml) </td><td> 200 ul (50 mg / ml su içerisinde, -20 C ° stokta) </td></tr><tr ><td> B-merkaptoetanol (10 -4 M) </td><td> 50 ul (IMDM içinde 10 -1 M stok) </td></tr><tr ><td> Penisilin-Streptomisin (% 1) </td><td> 500 ul </td></tr><tr ><td> 2 mM Glutamin </td><td> 500 ul </td></tr><tr ><td> EPO (2 U / ml) </td><td> 33 ul (3.000 U / ml stok) </td></tr></tbody></table><sTrong&gt; Epo Tablo 2. Bileşen ortamını ihtiva eden.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis at JoVE.com

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Biz terminali eritropoezin erken ve geç aşamaları masaya bir in vitro fare fetal karaciğer erythroblast kültür sistemi sunuyoruz. Bu sistem, farklı gelişim aşamasındaki özel genlerin işlevsel analiz kolaylaştırır.

Fare Fetal Karaciğer Kültür Sistemi Terminali Eritropoiesis Erken ve Geç Dönemlerinde Hedef Gene İşlevleri teşrih etmek

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

mouse-fetal-liver-culture-system-to-dissect-target-gene-functions-at

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

A Hierarchical Stem-Cell System: Blood Cell Formation

SCIENTISTS IN ACTION

14.9K Görüntüleme.  Northwestern University.  Biz terminali eritropoezin erken ve geç aşamaları masaya bir in vitro fare fetal karaciğer erythroblast kültür sistemi sunuyoruz. Bu sistem, farklı gelişim aşamasındaki özel genlerin işlevsel analiz kolaylaştırır. 

Video: Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Gelişim Biyolojisi

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming &#34;units&#34; known as BFU-e and CFU-e. Until recently, methods for the direct prospective and complete isolation of pure BFU-e and CFU-e progenitors from freshly isolated adult mouse bone marrow were not available. To address this gap, a single-cell RNA-seq (scRNAseq) dataset of mouse bone marrow was analyzed for the expression of genes coding for cell surface markers. This analysis was combined with cell fate assays, allowing the development of a novel flow cytometric approach that identifies and allows the isolation of complete and pure subsets of BFU-e and CFU-e progenitors in mouse bone marrow or spleen. This approach also identifies other progenitor subsets, including subsets enriched for basophil/mast cell and megakaryocytic potentials. The method consists of labeling fresh bone marrow or spleen cells with antibodies directed at Kit and CD55. Progenitors that express both these markers are then subdivided into five principal populations. Population 1 (P1 or CFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71med/high) contains all of the CFU-e progenitors and may be further subdivided into P1-low (CD71med CD150high) and P1-hi (CD71high CD150low), corresponding to early and late CFU-e, respectively; Population 2 (P2 or BFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71low CD150high) contains all of the BFU-e progenitors; Population P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150low CD41low) is enriched for basophil/mast cell progenitors; Population 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41+) is enriched for megakaryocytic progenitors; and Population 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41-) contains progenitors with erythroid, basophil/mast cell, and megakaryocytic potential (EBMP) and erythroid/ megakaryocytic/ basophil-biased multipotential progenitors (MPPs). This novel approach allows greater precision when analyzing erythroid and other hematopoietic progenitors and also allows for reference to transcriptome information for each flow cytometrically defined population.

Here, we describe a novel flow cytometric method for prospective isolation of early burst-forming unit erythroid (BFU-e) and colony-forming unit erythroid (CFU-e) progenitors directly from fresh mouse bone marrow and spleen. This protocol, developed based on single-cell transcriptomic data, is the first to isolate all the tissue's erythroid progenitors with high purity.

Patlama Oluşturan Birim ve Koloni Oluşturan Birim Eritroid Progenitörlerinin Fare Dokusundan Akım Sitometrisi ile Tanımlanması ve İzolasyonu

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of red cell formation is regulated by the hormone erythropoietin (Epo), whose synthesis is triggered by tissue hypoxia. A threat to adequate tissue oxygenation results in a rapid increase in Epo, driving an increase in erythropoietic rate, a process known as the erythropoietic stress response. The resulting increase in the number of circulating red cells improves tissue oxygen delivery. An efficient erythropoietic stress response is therefore critical to the survival and recovery from physiological and pathological conditions such as high altitude, anemia, hemorrhage, chemotherapy or stem cell transplantation. 
The mouse is a key model for the study of erythropoiesis and its stress response. Mouse definitive (adult-type) erythropoiesis takes place in the fetal liver between embryonic days 12.5 and 15.5, in the neonatal spleen, and in adult spleen and bone marrow. Classical methods of identifying erythroid progenitors in tissue rely on the ability of these cells to give rise to red cell colonies when plated in Epo-containing semi-solid media. Their erythroid precursor progeny are identified based on morphological criteria. Neither of these classical methods allow access to large numbers of differentiation-stage-specific erythroid cells for molecular study. Here we present a flow-cytometric method of identifying and studying differentiation-stage-specific erythroid progenitors and precursors, directly in the context of freshly isolated mouse tissue. The assay relies on the cell-surface markers CD71, Ter119, and on the flow-cytometric 'forward-scatter' parameter, which is a function of cell size. The CD71/Ter119 assay can be used to study erythroid progenitors during their response to erythropoietic stress in vivo, for example, in anemic mice or mice housed in low oxygen conditions. It may also be used to study erythroid progenitors directly in the tissues of genetically modified adult mice or embryos, in order to assess the specific role of the modified molecular pathway in erythropoiesis.

A flow-cytometric method for identification and molecular analysis of differentiation-stage-specific murine erythroid progenitors and precursors, directly in freshly &#x2013;harvested mouse bone marrow, spleen or fetal liver. The assay relies on cell-surface markers CD71, Ter119, and cell size.

CD71/TER119 Flow-sitometrik Testi kullanarak Fare eritro-id progenitörlerin Tanımlama ve Analiz

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Biyoloji

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not yet been fully elucidated. A common problem encountered when studying the localization of key proteins and structures within enucleating erythroblasts by microscopy is the difficulty to observe a sufficient number of cells undergoing enucleation.&#160;We have developed a novel analysis protocol using multiparameter high-speed cell imaging in flow (Multi-Spectral Imaging Flow Cytometry), a method that combines immunofluorescent microscopy with flow cytometry, in order to identify efficiently a significant number of enucleating events, that allows to obtain measurements and perform statistical analysis.
We first describe here two in vitro erythropoiesis culture methods used in order to synchronize murine erythroblasts and increase the probability of capturing enucleation at the time of evaluation.&#160;Then, we describe in detail the staining of erythroblasts after fixation and permeabilization in order to study the localization of intracellular proteins or lipid rafts during enucleation by multi-spectral imaging flow cytometry.&#160;Along with size and DNA/Ter119 staining which are used to identify the orthochromatic erythroblasts, we utilize the parameters &#8220;aspect ratio&#8221; of a cell in the bright-field channel that aids in the recognition of elongated cells and &#8220;delta centroid XY Ter119/Draq5&#8221; that allows the identification of cellular events in which the center of Ter119 staining (nascent reticulocyte) is far apart from the center of Draq5 staining (nucleus undergoing extrusion), thus indicating a cell about to enucleate.&#160;The subset of the orthochromatic erythroblast population with high delta centroid and low aspect ratio is highly enriched in enucleating cells.

The present protocol describes a novel method of identifying a population of enucleating orthochromatic erythroblasts by multi-spectral imaging flow cytometry, providing a visualization of the erythroblast enucleation process.

Multi-spektral Görüntüleme Sitometrisi ile Enucleating Olaylar bir Kemirgen erythroblast ICSI&#39;nin Zenginleştir tanımlanması

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

Fare Karaciğerinde Hücre Tipine Özgü Gen Ekspresyonu Profiloluşturma

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...