The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.

1.. Elektrot Binası (Şekil 1) <ol><li> Ticari çok kanallı amplifikatör sistemleri 1,2,25 elektrot arayüz kartı uygun bir elektrot adaptörü üretimi. <ol><li> 18 Pin bağlayıcı tabanına yapıştırılmış küçük bir pleksiglas tabak kullanın. </li><li> Pleksiglas plaka üzerine vidalı 3 ayrı lehim pabuçları için izole tel 3 kısa adet (Şekil 1 A1-A3) ile taban bağlayın. </li><li> Bir cam kılcal kolayca hareket edebilir ve bir vida ile yerinde tutulabilir hangi Plexiglas plaka içine bir yiv (Şekil 1 B1) takın. </li><li> Bir minutien pimi kullanılarak yaklaşık 5 mm cam kılcal uzatın. </li><li> Istikrar ve destek garanti minutien pimi ve cam kapiller boyunca mikro elektrot tel takmak. </li></ol></li><li> Çok kanallı mikro tel üretimi (Ryuichy Okada 32,33 den alınmıştır) <ol><li> Dizisi 3. mikro teller (poliüretan kaplı bakır tel, 15bunlar yanyana yerleştirilen bir şekilde (Şekil 1 B2) um çapında). </li><li> (Elektrot ucu) (Şekil 1 B3) birlikte tutkal onları kısmen telleri boyunca düşük erime diş balmumu ince bir film tabakası (50 ° C) yaymak için bir 12 V lehim iğne kullanın. Bu bölümde elektrot adaptörü ile mikro telleri bağlamak için daha sonra kullanılabilir olacak gibi unglued birkaç santimetre (elektrot ucu) bırakın. </li></ol></li><li> Elektrot adaptöre çoklu kanal mikro teli bağlayın <ol><li> Sahibinden cam kılcal çıkarın ve elektrot ucu minutien iğne ile sabitleyin. Mikro-elektrot (Şekil 1 B3) paralel bir konuma getirin. </li><li> Düşük erime diş balmumu kullanarak minutien pin elektrot ucu Tutkal ve (küçük oklar 1 B3 Şekil) minutien pin ve elektrot sonunda 2-3 cm çıkıntılı, ucunda mikro elektrot kesti. </li><li> Kılcal sl Kaymaightly geri elektrot adaptörü içine. (Şekil 1 B4) bunu düzeltmek için vidayı kullanın. </li><li> Yalıtımın erimesini (Şekil 1 B4) olmak üzere yaklaşık 360 ° C arasında bir sıcaklığa sahip bir lehim tabancası kullanarak lehim pabuçları için üç tellerin gevşek uçları Lehim. Lehimleme sonra yeterli elektrik kontağı (~ 300 kOhm) olduğundan emin olun. </li><li> Headstage elektrot arayüz kartına elektrotlar (master) birini mount ve ayrı bir adaptör üzerinde diğer çok kanallı elektrot (köle) düzeltin. Ana elektrot (Şekil 1 C1) slave kanallarını bağlayın. Ayrıca, ana elektrot tabanına başvuru yanı sıra kas elektrotlar (Şekil 1 C2) lehim. </li></ol></li></ol> 2.. Arı Hazırlama (Şekil 2) Bu tarif edilen deneylerde, omurgasız bir hayvan olan bal arısı (Apis mellifera),ve bu nedenle kullanım için özel etik izin kullanılır gerektirmez. <ol><li> Başkaları 34,35 gösterildiği gibi sabah kovan girişinde balarısı silaj (A. mellifera) yakalayın. </li><li> Immobilizasyon (5-10 dk) kadar ezilmiş buz üzerinde arılar soğuk ve baş maruz bir şekilde (Şekil 2 A) standart bir pleksiglas sahibinin veya metal tüp içinde bir tane. En aza indirmek için baş hareketleri, düşük erime diş mumu (~ 50 ° C) kullanabilir ve bileşik göz ve boyun çevresinde esas sahibine dikkatlice başlığı düzeltmek. </li><li> Flagellumu dokunmadan baş kapsülü (Şekil 2 B) anten SCAPI sabitleşmek düşük erime balmumu kullanın. Antenin kamçı ileri işaret edilmesi gerekmektedir. Arı serbestçe burnumun taşıyabilirsiniz emin olun. </li><li> Kesintisiz bir görünüm ve başın üst erişimi sağlamak için baş kapsülü tıraş. </li><li> Saturati kadar bir% 30 sukroz çözeltisi ile arı Beslemebeyin dokusu ve hayvanın iyi canlılığı (Şekil 2 C) yeterli nemlendirilmesini sağlamak için. </li><li> Dikey olarak bileşim gözün sınırları boyunca ve yatay olarak antennal bazlar yukarıdaki gibi ocelli altında dikkatli olun ve insizyon kütikül gevşek parça (Şekil 2 B) çıkarın. </li><li> Dikkatle hipofaringeal bezleri kenara ve net bir görünüm ve ekleme (Şekil 2E, 2F) elektrot önce beyne erişim sağlamak için trakea çıkarın. </li></ol> 3.. Elektrot Yerleştirme Şekil 2&#39;de gösterilen örnek durumda, tek bir elektrot l-ALT, m-ALT 2 amaçlayan diğer bir amaçlayan konumlandırılmıştır. Özellikle işaretlerini kullanarak, diğer hedef bölgelerde, örneğin MB AL ve çıkış bölgeleri 1, hem de mümkündür. <ol><li> (Ilgilenilen bölgesinde mikromanipülatörler kullanarak elektrotlara yerleştirin <strong&gt; Şekil 2G ve 3A). M-ALT yerde AL ve mediale MB dikey lobundan arasındaki elektrot hedeflemek için. Mediolateral ALT PNS dallanma noktasının üzerinde olma ekleme siteyi olun. Yaklaşık 180 um (Şekil 2E) bir derinliğe sahip, beyin içine elektrod çıkıntı yapar. Elektrot dikey lob ve AL orta yan tarafı arasında bir hayali çizginin ortasında yanal protocerebrum (LH) altında l-ALT PN kayıt için burası. Yaklaşık 300 um (Şekil 2E) bir derinliğe sahip elektrot yerleştirin </li><li> Manikür küçük bir kesikten taraftaki bileşik göz içine referans (gümüş tel, yaklaşık 25 mikron çapında) takın. Yanal ocelli altındaki kas projeksiyon bölgeye başka bir gümüş tel yerleştirin. NOT: Gerekirse arının öğrenme davranışı i katılır kas M17, kayıt yüksek zamansal hassasiyetle izlenebilirn arı 36 burnumun uzantısı yanıt (PER) olarak 25 tarif. </li><li> Sağlam, beyin ve kafa kapsül içindeki elektrotlar demirlemek kurumasını beyin engeller, iki bileşenli silikon (Şekil 2H) ile beyin yukarıdaki tüm alanı kapsayacak. Not: kayıtlar güne kadar saatlerce sürebilir ve arılar, örneğin klasik bir klima prosedür (Şekil 2H) sırasında kaydedilebilir ya da farklı kokuların geniş bir paneli ile stimüle edebilir. </li></ol> 4. Veri Toplama ve önişlemesi <ol><li> Aşağıdaki gereksinimleri karşılayan uygun toplama yazılımı kullanın: min 25 kHz örnekleme oranı; analog 1,25 veya elektrot kanallar arasında dijital 2 çapraz farklılaşması; bant başak olayları ayıklamak için 8.000 Hz 300 Hz arasında geçiş filtresi. </li><li> Templ örneğin, tek birim aktivitesi elde etmek için mevcut çivi sıralama yazılımı kullanarakSpike2 yazılımı (Şekil 3) dahil olarak eşleştirme tekniklerini yedik. </li><li> Daha fazla analiz için (Şekil 4) veya Temel Bileşen Analizi (PCA) için nüfus vektörleri hesaplamak için (Şekil 5) piyasada mevcut yazılımını kullanarak koku yanıtları ortalama tek bir birim hesaplamak için ayıklanır birimlerinin zaman damgalarını kullanın. Ayrıca tek bir birim ve nüfus yanıt gecikme analiz etmek son yayınları 1,2,25 karşılaştırın lütfen. </li></ol> 5.. Bağıl Elektrot Pozisyon Görselleştirme (Şekil 4) <ol><li> Alexa 568 veya Alexa önce kayıt deneyler için 0.5 M potasyum klorid solüsyonu içinde eritildi 488 hydrazide% 5 hydrazide% 5 ya da bir çözelti içine elektrotlar ipuçları batırın. </li><li> Arı Ringer çözeltisi ile beyin durulayın, deneylerden sonra dikkatlice elektrotları ve kaplama silikon kaldırmak, bezleri ve trakea çıkarın ve tetramethylrhodami minik kristaller eklemekn, dekstran ya da anterogradely ALTS etiket AL içine 1.0 M potasyum asetat içinde çözülmüş,% 5 solüsyonu ekleyin. Karanlıkta aşağıdaki adımları uygulayın. </li><li> Boya içine alındı ​​ve bir 30-45 dakika daha arı Ringer çözeltisi ile üç kez beyin yıkanmasından önce, aksonal yolları (30-45 dakika) (Şekil 4A) boyunca çıkıntı nöronlar tarafından taşınacak izin verin. </li><li> Immobilizasyon kadar buz üzerinde arı soğuk ve dikkatle kafa kapsülden beyin kaldırmak. % 4 formaldehit ihtiva eden bir 0.1 M PBS çözeltisi içinde durulama beyin sabitleştirmek ve 4 ° C de bir gece tutmak </li><li> 0.1 M PBS (her biri 10 dk) &#39;de beyni, iki kez yıkamadan önce en az 12 saat bekleyin. </li><li> % 0.2 &#39;in 20 dakika boyunca 3 kez yıkayın beyin Triton artan bir alkol serisi (% 30,% 50,% 70,% 90,% 95,% 100 etanol 3x, 20 dakika içinde dehidrasyon önce 0.1 M PBS içinde seyreltilmiş X-100 her adım). </li><li> Bir mikroskop lamı ve s metilsalisilat de susuz beyin gömBir kapak slayt ile eal. </li><li> Bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın ve bir harmonik Bileşik Planı Apochromat objektif (10X 0.4 NA daldırma) kullanarak her 2-5 mikron optik bölüm olarak beyin tarayın. 568 nm dalga boyu için tetramethylrhodamin dekstran ve elektrot konumu için 488 nm&#39;lik bir dalga boyu kullanılarak doku harekete geçirir. </li><li> Rekonstrüksiyon yazılımına (örneğin. AMIRA veya Fiji) (Şekil 4) ile 3D görüntü yığınlarından gelen lekeli beyin yapıları ve elektrot yolları yeniden. </li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Bu makalede, üretim ve özel tasarlanmış çok kanallı mikro tel elektrotların kullanımını gösterir. Tarif edilen elektrotlar bir birim ve (ayrıntılar için bkz 1,2,25) bir numune içinde gecikme ölçümleri ve farklı nöron ve farklı neuropils diğer geçici yanıt özellikleri için özellikle yararlıdır nüfus aktivitesini kayıt için uygundur. Ayrıca biz kalıcı güne kadar saat sürecek bal arıları davranıyor istikrarlı, uzun süreli kayıtları izin mikro tel elektrotları nasıl uygulanacağını göstermiştir. Ekstrasellüler çoklu birim kayıtları mekansal bilgi ile birlikte yüksek zamansal çözünürlük elde etmek için olumlu bir araç haline geldi. Bizim durumumuzda, bu paralel nöronal yolları 2 ya da iki farklı neuropils 1. ya vardır. Çoklu nöronlar paralel tek nöron düzeyinde ve yüksek zamansal çözünürlükte kayıt ve analiz edilebilir. Çoklu-birim rekor41 - bulgular ilk böceklerin 39 da daha sonra memelilerde 38 uygulandı ve edilmiştir. Önemli ilerleme dışı çoklu kanal kayıt teknikleri 42,43 geliştirilmesi ve iyileştirilmesi ile elde edilmiştir. Bu, örneğin, yeni elektrotlar 44 veya roman başak sıralama ve kümeleme algoritmaları 45 geliştirme içerir. 48 - hücre-dışı çok üniteli bir kayıt teknikleri genel yöntemler de 46 tarif edilmiştir. Bu videoda gösterilen kendini inşa elektrotlar ayrıca daha elektrot başına microwires veya mikro teller uçları arasındaki ölçülebilir sürekli mesafeleri kazanmak için bükülmüş olabilir ekleyerek adapte edilebilir. Her iki prosedür, ancak, esneklik azaltılması ve elektrot kalınlığı artan yol açacaktır. Yaygın şahin güve, keçiboynuzu ve hamamböceği 40,49 gibi çok daha büyük böcekler dışı kayıtlar için kullanılan silikon sondalar karşılaştırıldığında - </sup&gt; 51 tarif edilen mikro tel elektrotlar esnek, daha küçük olan ve potansiyel beyin hareketleri ile kolayca başa çıkabilir ve bu nedenle, güvenilir bir şekilde daha geniş bir davranış gösterir repertuar arı ve karıncalar gibi küçük sosyal böceklerde kullanılabilir. Tanımlanan mikro teller, yuvarlak esnek ve daha küçük ve hedefi uzun çalışma için ise açık bir avantajdır çevredeki dokuya dolayısıyla daha az zararlı iken çoğu silikon sondalar, onların ekleme kanal boyunca akson ve sinir dokusunun kesilmesi gibi yapıları keskin incik var bir sağlam ve davranışlar hayvan vadeli plastisite. Mikro tel elektrotlar diğer bir avantajı da düşük maliyetli üretim ve kolay kullanımıdır. Bunun yerine dikkatle pahalı silikon sonda temizlik elektrot telleri taze, bu nedenle tıkanıklık olmaması sorunları önce beyin ekleme için kesilir ve. Bundan başka, her iki farklı neuropiles 1 o eklenen aynı hazırlanmasında birden fazla mikro tel elektrot kullanmak mümkündürr yolları 2 biz burada göstermek gibi. Bu yaklaşım, farklı nöral işleme düzeylerde tepki gecikmeleri ve etkileşimler gibi zamansal yönlerini analiz etmek ve karşılaştırmak için özellikle olumludur. Biz bir hücre dışı kayıtlı sinyal başına tek hücre aktivitesini yansıtmadığını bilincindeyiz. Her zaman, elektrot ucu etrafında gerilim etkinliğinin bir bileşiktir. Bir elektrot içinde iki komşu kablo mikro kanallar fark her zaman hesaplanan sinyalinin kaynağını tam olarak belirlemek için. Böylece tek ünite aktivitesini ayıklamak için kullanılan başak sinyalleri için kaynak her zaman bir ya da kolayca ayırt başak dalga şekilleri sonuçlanan diğer elektrot kanala ya da çok yakındı. Uzağa gelen sinyaller, komşu neuropils kas aktivitesi veya etkinlik gibi, karşılaştırılabilir şekilleri ve genlikleri çağrıştıran, aynı anda hem elektrotlar ulaşmak ve bu prosedür ile atılır. Spike2 şablon uygun teknik kullanılarak,Biz aynı değildir tek ünite aktivitesini elde etmek çok emin, ama tek bir nöron aktivitesi için çok yakındır. Ancak, başak sıralama sorunu hücre içi kayıt teknikleri kullanılarak önlenebilir. Keskin elektrotlar veya yama pipet ile ya tek hücre kayıtları, tek bir nöronun fizyolojik özellikleri hakkında derinlemesine bilgi sağlar. Bununla birlikte, küçük bir böcek nöronların büyüklüğü ve nöritlere (arı PNS 52 için, örneğin., En az 1 um), sadece kısa vadeli kayıtları yönetilebilir. Ayrıca, hücre içi kayıtları invaziv olabilir ve muhtemelen zamansal sınırlamalar için bir başka nedendir hücreyi zarar olabilir. Böceklerde in vivo hücre içi kayıtları nadiren bir saat dayanmak. Tek bir tespit nöronun, ventral çiftleşmemiş maxilar nöron # 1 (VUMmx1) dan hücre içi kaydedilen Martin Hammer 53 öncü çalışmaları için yeterli bir zaman penceresi. O l olabilirdoğrudan ödül yoluna mürekkep aktivitesini. Juliane Mauelshagen 54 hücre bir tespit mantar vücut dış nöron aktivitesini kayıtlı, klasik koşullanma sırasında pedunculus dış nöron # 1 (PE1). Onlar Kenyon Hücreler elektriksel stimülasyon sonra LTP bulduğumda aynı nöron Menzel ve Manz 55 odağı oldu. Ancak, Okada ve arkadaşları 56 ekstraselüler kayıtlar sırasında Pe1 tanımlanması için hücre iyi karakterize spike desen (çift ve üçlü ani) kullanabilirsiniz. Her iki yöntemin her bir kombinasyonundan sonra tespit nöronlar ve dışı uzun süreli kayıtlar hücre içi kayıtları gelecekteki araştırmalar için güçlü bir araç olabilir. Ancak, zamansal tepki ilişkileri ve / veya hatta plastik değişiklikleri analiz etmek güne kadar birçok saat boyunca farklı işleme seviyelerde aynı anda birden fazla hücre (adet) kaydetmek için keskin elektrotlar kullanan ineredeyse imkansız. 62 - ilk kalsiyum görüntüleme kalsiyum duyarlı boyalar kullanarak balarısı 57,58 yaklaşımları ile koku yanıtların mekansal desen analizi 59. erişilebilir. Ancak, birçok durumda kalsiyum duyarlı boyalar tekrar arının ömrü ve analiz hücrelerin içsel özellikleri sınırı invaziv manipülasyonlar yoluyla beyin dokusu tanıtılacak olması. Bu sorun, genetik tanıtıldı kalsiyum sensörleri 63,64 kullanarak meyve sineği gibi diğer model organizmalar aşılır. Büyük olasılıkla koku tepkilerin geçici özelliklerini etkileyen kalsiyum tampon olarak hareket edebilir Ancak, genel olarak, kalsiyum algılayıcılar başka sınırlamalar taşıyabilirler. Kalsiyum görüntüleme veya hesaplamalı yaklaşımlar ile birlikte eşzamanlı hücre içi kayıtları görüntüleme uygun zamansal çözünürlük 65,66 işler kanıtlayabilirim. Bununla birlikte, görüntüleme işlemi kendi zamansal çözünürlüğü olan rather sınırlıdır. 2-Foton-Görüntüleme hızlı dizileri 68 elde etmek mümkün olabilir ancak optik toplama sistemleri genellikle, 5-20 Hz 67 bir zamansal çözünürlüğe sahip CCD-görüntüleme kullanın. Ancak, artan örnekleme oranı her zaman uzamsal çözünürlük kaybı ile birlikte gider. Ayrıca honeybee kullanılan kalsiyuma duyarlı boyalar da elde etme süresi 69 azaltan ağartma, geçer. Böceklerde diğer fizyolojik kayıt teknikleri ile karşılaştırıldığında bizim esnek çoklu-kanal mikro-tel elektrotlar tek ünite ve arılar davranıyor nüfus nöronal aktivitenin uzun süre erişim sağlamak. Biz farklı kayıt siteler arasında zamansal kodlama yönlerinin analizini kolaylaştırır aynı hayvan, farklı işleme aşamalarında bu elektrotların ikisini nasıl kullanılacağını gösterdi. Araştırma sorunu ve burada gösterdiği elektrot binanın temel yöntemi böcek modele bağlı olarak kolayca genişletmek edilirmümkün ve / veya adapte edilebilir. Örneğin, bu çok kanallı elektrotları oluşturmak için üç adet tek teller fazla kullanmak düşünülebilir. Buna ek olarak, kayıt sitelerinin sayısı genişletilmiş ve ikiden fazla ya da yolları neuropils zamansal açıdan gözlemlemek mümkündür edilebilir. Temennimiz bu yöntem pek çok bilim adamı ilham kaynağı olacak ve küçük beyinleri gelişmiş nöronal işleme anlayışına olumlu katkı olacaktır.

Bal arısı gibi diğer birçok böcekler ağır olfaction güveniyor. Diğerlerinin arasında bu yönelim, çiftleşme, conspecifics ile iletişim ve yiyecek aramak için koku ipuçlarını kullanın. Onların iyi oluşturulmamıştır koku sistemi çiçek koku uyanlarla ilişkili öğrenme davranışları zengin bir repertuar katkıda bulunmaktadır. (- 5 incelemesi 3 bakınız) Bu davranışlar kolayca kontrollü laboratuvar koşullarında ele alınabilir. Nöron nispeten küçük numaralar ile onların &quot;mini beyinleri&quot; (krş. 6) balarısı koku kodlama eğitim ve nöral aktivitenin izlenmesi sırasında öğrenme için de uygun bir model organizma yapar. Böcekler hem de memelilerde koku alma sistemi (7,8 inceleme için bakınız) büyük ölçüde benzer organizasyonunu göstermektedir. Bal arılarında yılında anten 10,11 boyunca sensillae bulunan yaklaşık 80.000 reseptör nöronlar 9 neur içine çevre koku uyaran çevirmekÖnal sinyali. Olfaktör reseptör nöronlardan gelen aksonlar omurgalı koku ampul karşılaştırılabilir bir glomerüler organizasyona sahiptir antennal lobu (AL), innerve. AL 4000 yerel internöronlar (LN) ile birbirleri ile bağlantılı yaklaşık 164 glomerül içerir (inceleme için 12). Özellikle balarısı o LN yamalı yanal bağlantı sağlamak ve farklı subpopülasyonunun element ve configural koku kodlama özelliklere 13,14 sahip olduğu son zamanlarda kanıtlanmıştır. AL medial ve lateral antennal lob yolu (m-ve l-ALT sebebiyet veren bir ventral ve dorsal hemi lobun bölünerek gösterilmiştir; eskiden m-ve medial-lateral antennal lob protocerebral l-APT olarak adlandırılan ) 15-17 cezbet. İşte böcek beynin bir birleşik adlandırılması için yeni bir çaba tarafından tanıtılan yeni bir sistem terminoloji 18 kullanılacaktır. Her iki ALT basılı (l-ve m-ALT) 410 (l-ALT) veya 510 (m-ALT) uniglomerular Proje ya da kombinection nöronlar (PN), sırasıyla 15,16,19. Her iki yollarında PNS son zamanlarda (inceleme için 17,20 bakınız) paralel 2 kod koku gösterilmiştir ve hem yolları synaptically Kenyon Hücreleri (KC), mantar gövde (MB) anapara nöronlar ile farklı bağlantıları oluşturur. 23 - Her MB yaklaşık 172.000 kcs 21 içerir. MB uyarıcı entegrasyon, öğrenme ve hafıza oluşumunda rol oynadığı bilinmektedir. Vertica veya alfa-lob ve yatay veya beta-lob 22,24: keratinosit karsinom axo dentritler iki ana çıkış bölgeleri var pedinkülde (mantar kök) oluşturur. MB çıkışı sadece yaklaşık 400 dış nöronların (EN) 24 yakınlaşıyor. Koku bilgi işleme sorumlu çoğunlukla dikey lobun 22 ventral innerve ens. Son zamanlarda, bu alanda kaydedilen Ens&#39;i koku ödül ilişki 25 kodlayan gösterilmiştir. Olarak Temporal29 - böcekler gibi omurgalıların koku alma sistemi içinde cevapların dağılımı potansiyel kodlama ilke 26 gibi önemli ve anlamlı bir yönü haline gelmiştir. Aynı anda yüksek temporal çözünürlük farklı sitelerden birden nöronlar kayıt yapabilmek için, biz arı koku sisteminde farklı hedef bölgelere tanıtıldı özelleştirilmiş çok kanallı tel elektrotlar kullanılarak çift çoklu birim kayıt tekniklerini kurulmuştur. Bu yaklaşım tek nöronların ve ya paralel koku yolları, ikili koku yolunun 2 veya farklı sonraki neuropils 1 arasında var nöronların popülasyonlarının düzeyinde balarısı koku sisteminde zamansal işleme, analiz ve karşılaştırma için bize sağlar. Son zamanlarda elektrotlar farklı bir yapılandırma kullanarak çekirge koku alma sistemi 30 benzer bir deneysel yaklaşım ile plan-değişmeyen koku tanıma 31 için zamanmekansal kodlama mekanizmasını analiz başardık. ThBize, kurulan ikili kayıtları eşzamanlı nöronal aktivite profilleri hakkında mekansal bilgi toplama etkinleştirin. Kalsiyum görüntüleme elde geniş uzamsal örnekleme göre bu yöntem sadece iki noktalar kaydedilmesini sağlar. Bununla birlikte, kalsiyum görüntüleme tekniklerine göre avantajı ise, geleneksel CCD görüntüleme ya da 2-ya da foton görüntüleme satın tarafından temin edilemeyen bir eylem potansiyeli kayıtlarında, yüksek zamansal hassas olduğunu. Burada tarif edilen hücre dışı bir sürekli olarak implante elektrotlar ve elektrot sürüklenme kaçınarak, beyin ve kafa kapsül göre sabitlenir. Bu keskin hücre içi elektrotların kullanımı ile karşılaştırıldığında açık bir avantajdır. Hücre içi kalsiyum kayıtları ve görüntüleme kıyasla diğer bir avantajı, çok saatler güne kadar değişen uzun bir gözlem sinir zamandır. Bu öğrenme ve bellek oluşumu sinirsel araştırmak için önemli bir ön koşuldur. Çok ek faydalarbirim kayıtları ayrıca tartışma bölümünde özetlenmiştir. Bu metodolojik genel olarak özel tasarım tel elektrotlar imalat prosedürü, gösterilir 32,33 uyarlanan ve balarısı beyinde uzun süreli çoklu birim kayıtları için uygundur. Buna ek olarak, bu tür elektrotların sürekli olarak aynı anda kaydetmek üzere bal arısı koku alma sistemi içinde iki farklı kaydına implante nasıl bir örnek L-ve çok stimülasyon protokolleri izin vermek için, uzun süre boyunca m-ALT 2 gösterilmiştir. Kayıt pozisyonların doğrulanması için kayıt sitelerin boyama ve sonrası kayıt görselleştirme için bir örnek ve protokol sağlanır.

<table><tbody><tr><td>Paraffin oil</td><td>Fluka</td><td>76235</td><td></td></tr><tr><td>Odors</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>4% Formaldehyde</td><td>ThermoScientific</td><td>28908</td><td>Methanol free</td></tr><tr><td>Triton X</td><td>BioChemica</td><td>A1388</td><td></td></tr><tr><td>Methylsalicylate</td><td>Roth</td><td>4529.1</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby)</td><td>Invitrogen</td><td>D7162</td><td>keep dark</td></tr><tr><td>Alexa 488 hydrazide</td><td>Invitrogen</td><td>A-10436</td><td>keep dark</td></tr><tr><td>Alexa 568 hydrazide</td><td>Invitrogen</td><td>A-10437</td><td>keep dark</td></tr><tr><td>Bee Ringer Solution</td><td>see Brill &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyurethane-coated copper wire</td><td>Elektrisola</td><td>15 &amp;micro;m diameter &amp;amp; P155 insulation</td><td></td></tr><tr><td>Dental Wax&amp;nbsp;</td><td>Densply Detrey</td><td>64103015S1</td><td>moderate melting point</td></tr><tr><td>Dental Wax</td><td>Flexaponal&amp;nbsp;</td><td>124-202-00</td><td>low melting Wax</td></tr><tr><td>KWIK SIl</td><td>WPI</td><td>03L</td><td></td></tr><tr><td>18 Pin Socket</td><td>Conrad Electronic</td><td>189634-62</td><td></td></tr><tr><td>Hot melting glue</td><td>Conrad Electronic</td><td>827673</td><td></td></tr><tr><td>Soldering needle</td><td>Conrad Electronics</td><td>830283</td><td>12 V</td></tr><tr><td>Soldering terminal lug&amp;nbsp;</td><td>Conrad Electronic</td><td>531901</td><td></td></tr><tr><td>Glaselectrodes</td><td>WPI</td><td>1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>V2A 0.2 x 12 mm</td></tr><tr><td>Switchable headstage</td><td>Tucer Davis Technologies</td><td>SH16</td><td></td></tr><tr><td>Headstage connection module</td><td>NPI</td><td>INT-03M</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier Module</td><td>NPI</td><td>PDA-2F</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition boards</td><td>National Instruments</td><td>NI-6123, Ni-6143</td><td></td></tr><tr><td>Acquisition Software</td><td>National Instruments</td><td>Lab View 8.2</td><td>custom design</td></tr><tr><td>Spike-Sorting&amp;nbsp;</td><td>CED&amp;nbsp;</td><td>Spike 2 v7.11</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>R2008B</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Leitz</td><td></td><td>manual</td></tr><tr><td>AG-wires</td><td>WPI</td><td>AGT05100</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SP2 AOBS</td><td></td></tr><tr><td>AMIRA</td><td>Mercury Computer Systems&amp;nbsp;</td><td>2/5/2000</td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous long-term recordings at two neuronal processing stages in behaving honeybees

Memeliler ve böcekler hem de nöronal bilgiler farklı yüksek ve düşük seviyede beyin merkezlerinde işlenir. Bu merkezler yakınsak ve ileri besleme ve geri besleme kabloları dahil olmak üzere farklı anatomik bağlantıları yoluyla birleştirilir. Ayrıca, aynı menşe bilgisi kısmen farklı ve bazen aynı beyin alanlara paralel yollar aracılığıyla gönderilir. Bu kablo stratejileri ve birbirlerine özellikle geçici bağımlılıkları evrimsel yararları yanı sıra sayısal avantajları anlamak için, bu yüksek zamansal çözünürlükte Aynı müstahzar içindeki değişik yolları veya neuropiles tek nöron eş zamanlı erişim için gereklidir. Burada iki müteakip neuropiles 1, antennal lobun (AL), ilk koku işleme aşamasında ve mantar gövdesinin (MB), daha yüksek dereceden entegrasyon merkezi invo multi ünite aktivitesini kaydetmek için eşsiz bir hücre dışı uzun süreli erişim göstererek bal arıları üzerinde yoğunlaşmaköğrenme ve bellek oluşumu, ya da MB ile AL bağlayacak iki paralel nöronal yolları 2 lved. Ikinci bir örnek olarak seçilmiştir ve tam bir şekilde tarif edilecektir. Destekleyen video inşaat ve esnek çok kanallı teli kalıcı ekleme gösterilmiştir. Mikro telidir kanalları İkili diferansiyel amplifikasyon ölçüde gürültüyü azaltır ve sinyalin kaynak yakın elektrot ucunun konumu ile ilişkili olduğunu doğrular. Kullanılan tel elektrotlar mekanik esneklik sağlar: istikrarlı, uzun vadeli invazif kayıtlar çok saat boyunca, geleneksel olarak ilave ve hücre içi vivo kayıt teknikleri ile karşılaştırıldığında açık bir avantaj olan gün kadar.

&quot;Mevcut protokol bireysel arıları içinde iki farklı işleme aşamalarında eş zamanlı kayıtlar sağlar ve ayrıca örneğin yoluyla öğrenme ve hafızanın altında yatan mekanizmaları test etmenize olanak sağlar., Ölçülü bal arıları içinde klima PER.&quot; Bu nöronal işleme zamansal yönlerini analiz etmek için bir ön koşuldur. Farklı bilimsel yaklaşımlar arının koku alma sisteminin nöronal ağı çözülmeye için yöntem kolaylıkla uyarlanabilir. Örneğin, bu yöntem honeybee ikili koku yolunun, l ve m-ALT PNS (Şekil 5) içinde PNS zamansal işleme analiz etmek için, (i) kullanılır. Şekil 5A aynı anda m-ALT bir PN ile kaydedilen bir l-ALT PN bir örneği on deneme ortalaması olarak verilen ve renk kodlu ısı komplo olarak beş farklı koku konsantrasyonları açısından tepki gücü ve gecikmeyi göstermektedir edilir. 11 l-ve 13 mA ile yedi arıların bir ortalamaLT PNS (Şekiller 5B, 5C) tepki gücü hem de cevap gecikme hem de belirli bir dereceye kadar, odorant konsantrasyonunu yansıttığını göstermektedir. Artan Odorant konsantrasyon ile cevap gecikmesi (Şekil 5B, 5C) azalırken, böylece bu örnekte PNS tepki gücünü artırmak. Bu sonuç oldukça sınırlı ve analiz koku verici madde için geçerlidir, ama yine AL 37 son hesaplama modelleri ile uyumludur. Arının AL koku konsantrasyonu kodlama lineer olmayan hesaplamaları yatan ya da diğer kodlama özellikleri hala gelecekte analiz edilmesi gerekir temelini olsun. Ayrıca yöntem, (ii) iki daha sonraki işlem aşamalarında, AL ve MB-çıktı (Şekil 6) en nüfus aktiviteye zamansal açıdan karşılaştırmak için kullanılabilir. Temel bileşenler analizi (PCA) koku hesaplama uzun ve PN düzeyde tüm koku tanıtımı dayanmak olduğunu göstermektedir oysa ENSette ve kapalı yalnızca koku nüfus aktivitesi (Şekil 6) olarak temsil edilmiştir s. PN aktivite hala (krş. Film 1) gelişmekte olan zaman böylece EN nüfus bir zaman noktasında zaten maksimal aktivitesini ulaştı. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig1highres.jpg" width="400" /> ... Şekil 1. Üç kanallı mikro-tel elektrotları İmalat A1) üç tellerin uçları Pozisyonlar 11, 13 ve 16 A2) Dört lehim pabuçları bir pleksiglas plastik taban plakası üzerine vidalanır bir IC pin konnektör lehimli; Bir minutien pim daha sonra plastik levha. A3) plastik levha, bir IC pim bağlantısı ve her telin serbest ucu üstüne yapıştırılır bağlanmış bir cam boru ucuna sokulur En iyi lehim birine lehimlenmiştir pabuçlar. &lt;İnce bakır teller ile elektrot tutucu donatmak strong&gt; B1), kılcal sahibinin baz daha sonra cihazı hizalanması özel yapılmış sabittir) bir kez daha. B2 dışarı alınmalıdır. . Üç bakır mikro teller B3) paralel mikro teller diş balmumu ile yapıştırılır ve kılcal yerde (uzun oklar) geri koymak her ucunda oluk boyunca hizalanmış ve yapışkan bant ile sabitlenir; yapıştırılmış mikro teller daha sonra bakır teller üç gevşek uçları, böylece elektriksel temas içine getirilmesi üç üst lehim pabuçları lehimlenmiştir diş balmumu ve uçları (kısa oklar) kesilir. B4) ile kılcal bağlıdırlar IC pimli konektör. C1) tam olarak monte iki elektrot, bu amaç için, tek bir headstage. C2) ile kullanılmak bir elektrot (sol, slave) ve pimler doğru (diğer elektroda yalıtılmış kablo ile bağlanır için birbirine bağlanabilir direk) er, burada kafa aşamasına bağlıdır; headstage bağlı elektrot da bir kas (M17) ve referans elektrot (Ref) girdi toplayabilirsiniz. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2,. Hazırlanması ve arı beyin içine sürekli elektrot yerleştirme. A) arı buz üzerinde hareketsizleştirme sonra Plexiglas tutucu içine sokulmaktadır. Flagellum (FL) ve Scapus (SC) ile anten kafa) B. Gösterilir ve antenler diş balmumu kullanılarak tespit edilir. C) baş kapsülü traş edilir ve arı) şekerli su. D ile beslenen kafa kapsülü açıldı. E) beyin üstünden bezleri ve trakea çıkarılmasından sonra, farklı neuropiles ve başlıca yerler kolayca ayırt edilebilir. Alts yörüngeleri ile birlikte gösterilirelektrotlar yerleştirilir bir işareti. (MB: Mantar vücut, AL: Antennal lob, OL: Optik lob, α: Alfa lob veya dikey lob, ALT: antennal lob yolları, E1: m-ALT kayıtları için elektrot yerleştirme tarafı, E2: l-ALT için elektrot yerleştirme yan kayıtları). F) Başvuru (Ref) ve kas elektrotlar (M17) sonra manikür veya bileşik göz. G) tel elektrotlar uygun siteler. H de beyin içine sokulur) küçük deliklerden baş kapsülü içine sokulur iki bileşenli silikon kullanarak yerine elektrotlar sabitleme, arı hala PER gösterir ve klimalı (örn.., şeker su kullanarak). <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" width="500" /> Iki nöral yolları ve tek ünite ekstraksiyon (başak sıralama). Bir de Şekil 3.. Ekstrasellüler kayıt </strong&gt; deney düzeneği) şematik çizim. Arı bir pleksiglas tutucuya sabitlenmiş durumdadır. Koku stimülasyon bir cam tüp ile sağlanmaktadır. İki elektrot sap maruz arı beyinden kayıt edilmiştir. B) bir konsantrasyonda su çözeltisi içinde bal bir 500 msn koku uyarılması için her iki yolları ile ilgili uyarıcı yanıt gösteren l-ve m-ALT PNS (yeşil ve mor izleri) gelen eş zamanlı kayıtları 1:100, en 33 ° C. Her çizilen çizgi A Bar&#39;da elektrot lehim pabuçları renk kodlu etiket olarak farklılaşmış kanallarını temsil eder: tek aksiyon potansiyelleri kriteri ve renk kodlu 50 mV C) başak sıralama işlemlerinden sonra.. Sıralanan birimlerinin Yerleşimi dalga ayrılmasını göstermektedir. D) Spike aralık histogram yeterli başak sıralama kanıtı olarak sıralanmış birimlerinin ayrılması kalitesini gösterir. Ünitenin refrakter dönem içinde herhangi bir başak olduğunu unutmayın. E) İki Defa (E1, E2)birbirine sıralanmış birimlerinin mesafeyi gösterir, temel bileşen analizi ile sıralı biriminin 3D kümeleme. Çemberler uzayda SD ve benzer) Renk kodlu birimleri tek yolu kayıt üç kanalları büyütme görünür aksiyon potansiyelleri tasvir ana bileşen uzay F kümelerin önemli bir farklılaşma gösterir 2.5 kat Mahalanobis mesafeyi belirtir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" target="_blank">tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.</a> <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4. Post-kayıt görselleştirme ve kayıt konumuna 3D-rekonstrüksiyon. Bir antero maksimum yoğunluğu hizalama ile z ekseni boyunca orto-dilimlerinin A) Projeksiyon görünüşüdürve MB ve LH AL çıkıntı uniglomerular projeksiyon nöronlarının retrograd dolgu. Hücre içi tracer Microruby (tetramethylrhodamin dekstran) kayıt deneylerden sonra AL sokulmuştur. Alexa olan iki elektrot bir boyama maksimum yoğunluğu hizalama ile z ekseni boyunca orto dilimlerin AL kanıtı uygun PN lekeleme. B) projeksiyon görüntüsü içindeki lekeli glomerül m-ALT (E1, ok için elektrot yerleşimini gösteren 488 hydrazide ) ve l-ALT (E2, ok). İzleyici Alexa hydrazide 488, elektrot çevresindeki dokuya göç ve elektrot yerleştirme sitesi boyar. AL belirgin boyama birlikte balarısı koku alma sisteminin (şematik bir bakış ile yüzeysel bir eser lekeli hedef hücreler (PNS). C) 3 boyutlu rekonstrüksiyon ve A, B (sağ taraf gelen elektrot ekleme site), Not sol l-ve m-ALT yörüngeleri göstergesi yan). Sadece uniglomer, Notular PN yolları gösterilmiştir. AN: antennal sinir, AL: antennal lob, LH: yan boynuz, MB: mantar gövde, E1, E2: elektrot ekleme siteleri, m-ALT: medial antennal lob yolu, l-ALT: yanal antennal lob yolları, c: kaudal, r: rostral, m: medial, l:. yanal <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig5highres.jpg" width="300" /> Koku yoğunluğu kodlama Şekil 5,. Örnek çift koku yol içinde. A) ısı araziler tek l-ALT (yeşil tepkisini göstermektedir) ve tek m-ALT PN (Mor) koku verici madde tepki olarak tek bir honeybee aynı anda satın (10 -6 1:100 1 ilâ) koku Artan konsantrasyonlarda heksanal. Her satırı on deneme stimülasyonu bir ortalamaulation. Ateşleme hızı 7 kaydedildi arılar 11 l-ve 13 m-ALT PNS. B) Nüfus tepki gecikme çıkarılır spontan aktiviteye ilişkin ateşleme oranı göreceli yoğunluk değişim olarak gösterilir. Her arı hem sistemince PNS aynı anda kaydedildi. Nüfus cevap gecikmesi hem sistemince PNS koku konsantrasyonu artan azalan bir gecikme gösterir. 99 msn de antenlerden de koku tepki başlangıçlı electroantennograms aracılığıyla kaydedildi ve PN tepki gecikmeleri çıkarılır. Tepkiler gecikme ölçümleri için çok zayıftır ve bu nedenle, tepki gücü artmaktadır koku artan konsantrasyon ile B&#39;de olduğu gibi aynı PNS ateşleme hızı. C) nüfus yanıt alınmadı düşük konsantrasyonlarda unutmayın. L-ALT daha güçlü bir tepki kuvvetini gösterir. B, C, ortalama ve SD verilmiştir. <img alt="Şekil 6," fo:content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51750/51750fig6highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Şekil 6,. Bal arısı en koku yolu boyunca iki daha sonraki işlem aşamalarında nüfus aktivitesi ile karşılaştırılması. Veriler 1-heksanol ve 2-oktanon. A) ile uyarıldı 20 hayvanlarda kaydedildi her satır yanlış renk kodlu bir çıkıntının ortalama ateşleme hızı temsil eder nöron (PN) 1-heksanolün 10 koku tekrar karşısında hesaplanmıştır. Koku sunum 0 zamanda başlar ve üç saniye. B sürdü) A&#39;da olduğu gibi aynı gösterir) ama mantar vücut dış nöronların (EN) için. A &#39;de gösterilen matris) 1-hekzanol ile koku uyarılması sırasında bir PN nüfus vektörü olarak görülebilir. Biz 2-oktanon ile koku uyarılması sırasında nüfus vektörü aynı tür hesaplanır ve zamansal boyut. C tutarak bir temel bileşen analizi hem vektörleri (PCA) kullanılan) ilk üç temel bileşen (PC1, 2 ve 3) idiantennal lob çıkışında PN grup etkinliği olarak koku ayırma göstermek için birbirlerine karşı çizilmiştir. Koku başlamasından önce zaman siyah işaretlenir. 1-heksanol ile uyarma üç saniye boyunca mavi aktivitesi gösterilmiştir. 2-oktanol ile uyarılması esnasında aktivitesi kırmızı gösterilir. Ayrıca, 1-hekzanol (açık mavi) ve (pembe) 2-octanonen kümesi koku sonra aktivitenin 1.5 saniye (post) göstermektedir. PN topluluk düzeyinde çok farklı yörüngeler çağrıştıran hem de kokuları &quot;sabit nokta&quot; outlasts bütün koku uyarımı döneminde yerleşmek unutmayın. Koku ofset sonra yörüngeleri koku uyarımı olmadan geri temel aktiviteye taşıyın. D) Aynı analiz mantar vücut çıkışında faaliyeti temsil EN topluluk düzeyinde yapıldı. PN aktivitesine kıyasla kokuları daha az belirgin yörünge çağrıştırıyor. Ayrıca bir &quot;sabit nokta&quot; gözlemlenebilir değildir. Başlangıçta koku kaynaklı yörüngeleri intekoku hala mevcut olsa da başlangıç ​​etkinliği ile rmingle. Ofset yalnızca, koku ilave bir yörünge uyandırdı. <a href="/files/ftp_upload/51750/Movie_R3_Brill_et_al._JoVE.avi" target="_blank">. Movie 1</a> Zaman PN-nüfus vektörü (solda) ve EN nüfus vektörü temel bileşen analizi sonra bir koku uyarılan yörünge değerlendirilmesini çözüldü. (. hakkı; cp Şekil 6) üst kısımları ilk üç temel bileşeni (PC1 içerir 2 ve 3) birbirlerine karşı çizilmiştir. Daha altta olan paneller zaman içinde PC1, 2 ve 3&#39;ün değerlendirilmesini göstermektedir. Koku stimülasyon gri çubuk ile işaretlenir. Tüm paneller senkronize edildi. EN nüfus etkinlik PN nüfus etkinlik öncesi biraz başlayacağını unutmayın, contraintuitive gibi görünüyor ama bir fenomen bağlantısı ve önceki 1 tartışılmıştır ilgili katmanları, özellikleri ile açıklanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees at JoVE.com

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

İki farklı beyin neuropiles veya iki farklı anatomik yolları eşzamanlı dışı uzun süreli kayıtları arıları kuruldu. Bu kayıtlar farklı beyin bölgelerinde tek nörona yanı sıra davranıyor hayvanda topluluk düzeyinde karşısında nöronal işleme zamansal açıdan soruşturma izin.

Davranan Bal arısı iki nöronal İşleme Dönemlerinde Eşzamanlı Uzun vadeli Kayıtlar

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

simultaneous-long-term-recordings-at-two-neuronal-processing-stages

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.9K Görüntüleme.  University of Würzburg.  İki farklı beyin neuropiles veya iki farklı anatomik yolları eşzamanlı dışı uzun süreli kayıtları arıları kuruldu. Bu kayıtlar farklı beyin bölgelerinde tek nörona yanı sıra davranıyor hayvanda topluluk düzeyinde karşısında nöronal işleme zamansal açıdan soruşturma izin. 

Video: Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the survival of a honeybee colony depends on the exploitation of food sources, forager bees learn and memorize variable flower sites as well as their profitability. Forager bees can be easily trained in natural settings where they forage at a feeding site and learn the related signals such as odor or color. Appetitive associative learning can also be studied under controlled conditions in the laboratory by conditioning the proboscis extension response (PER) of individually harnessed honeybees3,4. This learning paradigm enables the study of the neuronal and molecular mechanisms that underlie learning and memory formation in a simple and highly reliable way5-12. A behavioral pharmacology approach is used to study molecular mechanisms. Drugs are injected systemically to interfere with the function of specific molecules during or after learning and memory formation13-16.
Here we demonstrate how to train harnessed honeybees in PER conditioning and how to apply drugs systemically by injection into the bee flight muscle.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

We demonstrate how to implement a behavioral pharmacology method in an appetitive olfactory conditioning paradigm in honeybees (Apis mellifera) by systemic application of drugs. This method allows investigation of the mechanisms underlying learning and memory formation in a simple and reliable way.

Bal arısı burnumun Extension Tepki Klasik Koşullanma Davranış Farmakoloji ( Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

Nörobilim

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Belirlenen Nöronlar ve Beslenme Davranışı Kalsiyum sinyaller aynı anda kayıt Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

All organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is especially important in insects, which use their olfactory systems to respond to, and discriminate amongst, complex odor stimuli. These odors elicit behaviors that mediate processes such as reproduction and habitat selection1-3. Additionally, chemical sensing by insects mediates behaviors that are highly significant for agriculture and human health, including pollination4-6, herbivory of food crops7, and transmission of disease8,9. Identification of olfactory signals and their role in insect behavior is thus important for understanding both ecological processes and human food resources and well-being.
	To date, the identification of volatiles that drive insect behavior has been difficult and often tedious. Current techniques include gas chromatography-coupled electroantennogram recording (GC-EAG), and gas chromatography-coupled single sensillum recordings (GC-SSR)10-12. These techniques proved to be vital in the identification of bioactive compounds. We have developed a method that uses gas chromatography coupled to multi-channel electrophysiological recordings (termed 'GCMR') from neurons in the antennal lobe (AL; the insect's primary olfactory center)13,14. This state-of-the-art technique allows us to probe how odor information is represented in the insect brain. Moreover, because neural responses to odors at this level of olfactory processing are highly sensitive owing to the degree of convergence of the antenna's receptor neurons into AL neurons, AL recordings will allow the detection of active constituents of natural odors efficiently and with high sensitivity. Here we describe GCMR and give an example of its use.
	Several general steps are involved in the detection of bioactive volatiles and insect response. Volatiles first need to be collected from sources of interest (in this example we use flowers from the genus Mimulus (Phyrmaceae)) and characterized as needed using standard GC-MS techniques14-16. Insects are prepared for study using minimal dissection, after which a recording electrode is inserted into the antennal lobe and multi-channel neural recording begins. Post-processing of the neural data then reveals which particular odorants cause significant neural responses by the insect nervous system.
	Although the example we present here is specific to pollination studies, GCMR can be expanded to a wide range of study organisms and volatile sources. For instance, this method can be used in the identification of odorants attracting or repelling vector insects and crop pests. Moreover, GCMR can also be used to identify attractants for beneficial insects, such as pollinators. The technique may be expanded to non-insect subjects as well.

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Olfactory cues mediate many different behaviors in insects, and are often complex mixtures comprised of tens to hundreds of volatile compounds. Using gas chromatography with multi-channel recording in the insect antennal lobe, we describe a method for the identification of bioactive compounds.

Böcek antennal Lob Gaz Kromatografisi-Multi-ünite Recordings (GCMR) kullanarak Olfaktör Uçuculuk tanımlanması

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktör Devreler

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

In vivo Ca 2 + - Bal Arısı Koku Öğrenme sırasında Mantar Vücut Nöronlar Görüntüleme

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Biyoloji

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

Dokunsal İklimlendirme Ve Bal Arısı yılında antennal Örnekleme Stratejileri Hareket Analizi (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). There are several behavioral mechanisms through which an insect learns salient associations and relates them to these events. It is important to understand this behavioral plasticity for programs aimed toward assisting insects that are beneficial for agriculture. This understanding can also be used for discovering solutions to biomedical and agricultural problems created by insects that act as disease vectors and pests. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol was developed for honey bees (Apis mellifera) over 50 years ago to study how they perceive and learn about floral odors, which signal the nectar and pollen resources a colony needs for survival. The PER procedure provides a robust and easy-to-employ framework for studying several different ecologically relevant mechanisms of behavioral plasticity. It is easily adaptable for use with several other insect species and other behavioral reflexes. These protocols can be readily employed in conjunction with various means for monitoring neural activity in the CNS via electrophysiology or bioimaging, or for manipulating targeted neuromodulatory pathways. It is a robust assay for rapidly detecting sub-lethal effects on behavior caused by environmental stressors, toxins or pesticides.
We show how the PER protocol is straightforward to implement using two procedures. One is suitable as a laboratory exercise for students or for quick assays of the effect of an experimental treatment. The other provides more thorough control of variables, which is important for studies of behavioral conditioning. We show how several measures for the behavioral response ranging from binary yes/no to more continuous variable like latency and duration of proboscis extension can be used to test hypotheses. And, we discuss some pitfalls that researchers commonly encounter when they use the procedure for the first time.

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

Bir burnumun Extension Tepki Böcekler Davranış Plastisitesi incelenmesi için protokol: Basic, Biyomedikal Uygulama ve Tarımsal Araştırma

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

Simultaneous Monitoring of Wireless Electrophysiology and Memory Behavioral Test as a Tool to Study Hippocampal Neurogenesis

Brainwaves amplitude obtained from electroencephalography (EEG) has been well-recognized as a basis for cognitive capacity, memory, and learning on animals and humans. Adult neurogenesis mechanism is also linked to memory and learning improvement. Traditionally, researchers used to assess learning and memory parameters in rodent models by behavioral tasks. Therefore, the simultaneous monitoring of behavioral changes and EEG is particularly interesting in correlating data between brain activity and task-related behaviors. However, most of the equipment required to perform both studies are either complex, expensive, or uses a wired setup network that hinders the natural animals&#8217; movement. In this study, EEG was recorded with a wireless electrophysiology device along with the execution of a novel object recognition task (NORT). The animal&#8217;s behavior was monitored simultaneously by a video tracking system. Both recordings were analyzed offline by their timestamps which were synched to link EEG signals with the animal&#8217;s actions. Subjects consist of adult Wistar rats after medium-term environmental enrichment treatment. Six skull screw electrodes were fixed in pairs on both hemispheres over frontal, central, and parietal regions and were referenced to an electrode located posterior of the nasal bone. NORT protocol consists of exposing the animal to two identical objects for 10 min. After 2 h and 24 h, one of the objects was replaced with a novel one. Exploration time for each object was monitored by a behavioral tracking software (BTS) and EEG data recording. The analysis of the EEG synced with behavioral data consists of estimations of alpha and beta relative band power and comparisons between novel object recognition versus familiar object exploration, between three experimental stages. In this manuscript, we have discussed electrodes manufacturing process, epidural electrodes implantation surgery, environmental enrichment protocol, NORT protocol, BTS setup, EEG &#8211; BTS coupling for simultaneous monitoring in real-time, and EEG data analysis based on automatic events detection.

The protocol presented here provides information on the simultaneous electroencephalography (EEG) and behavioral assessment in real-time. We have discussed all steps involved in this protocol as an attractive solution for researchers in many fields of neuroscience, particularly in learning and memory areas.

Hipokampal nörogenezi incelemek için bir araç olarak kablosuz elektrofizyoloji ve hafıza davranış testinin eşzamanlı izlenmesi

Brainwaves amplitude obtained from electroencephalography (EEG) has been well-recognized as a basis for cognitive capacity, memory, and learning on ...

Davranış

Recording Single Neurons' Action Potentials from Freely Moving Pigeons Across Three Stages of Learning

While the subject of learning has attracted immense interest from both behavioral and neural scientists, only relatively few investigators have observed single-neuron activity while animals are acquiring an operantly conditioned response, or when that response is extinguished. But even in these cases, observation periods usually encompass only a single stage of learning, i.e. acquisition or extinction, but not both (exceptions include protocols employing reversal learning; see Bingman&#160;et al.1 for an example). However, acquisition and extinction entail different learning mechanisms and are therefore expected to be accompanied by different types and/or loci of neural plasticity.
Accordingly, we developed a behavioral paradigm which institutes three stages of learning in a single behavioral session and which is well suited for the simultaneous recording of single neurons&#39; action potentials. Animals are trained on a single-interval forced choice task which requires mapping each of two possible choice responses to the presentation of different novel visual stimuli (acquisition). After having reached a predefined performance criterion, one of the two choice responses is no longer reinforced (extinction). Following a certain decrement in performance level, correct responses are reinforced again (reacquisition). By using a new set of stimuli in every session, animals can undergo the acquisition-extinction-reacquisition process repeatedly. Because all three stages of learning occur in a single behavioral session, the paradigm is ideal for the simultaneous observation of the spiking output of multiple single neurons. We use pigeons as model systems, but the task can easily be adapted to any other species capable of conditioned discrimination learning.

Learning new stimulus-response associations engages a wide range of neural processes which are ultimately reflected in changing spike output of individual neurons. Here we describe a behavioral protocol allowing for the continuous registration of single-neuron activity while animals acquire, extinguish, and reacquire a conditioned response within a single experimental session.

Serbestçe Öğrenmenin üç aşamalı karşısında Güvercinler Hareketli gelen tek nöronların &#39;Aksiyon Potansiyelleri kayıt

While the subject of learning has attracted immense interest from both behavioral and neural scientists, only relatively few investigators have observed ...

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

Ölçülü ve Serbest uçan Bal Arısı Nörofarmakolojik Manipülasyon,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

Davranan Bal arısı iki nöronal İşleme Dönemlerinde Eşzamanlı Uzun vadeli Kayıtlar

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bal arısı burnumun Extension Tepki Klasik Koşullanma Davranış Farmakoloji ( Apis mellifera)

Belirlenen Nöronlar ve Beslenme Davranışı Kalsiyum sinyaller aynı anda kayıt Drosophila melanogaster

Böcek antennal Lob Gaz Kromatografisi-Multi-ünite Recordings (GCMR) kullanarak Olfaktör Uçuculuk tanımlanması

Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (

In vivo Ca ^{2 +} - Bal Arısı Koku Öğrenme sırasında Mantar Vücut Nöronlar Görüntüleme

Dokunsal İklimlendirme Ve Bal Arısı yılında antennal Örnekleme Stratejileri Hareket Analizi (

Bir burnumun Extension Tepki Böcekler Davranış Plastisitesi incelenmesi için protokol: Basic, Biyomedikal Uygulama ve Tarımsal Araştırma

Hipokampal nörogenezi incelemek için bir araç olarak kablosuz elektrofizyoloji ve hafıza davranış testinin eşzamanlı izlenmesi

Serbestçe Öğrenmenin üç aşamalı karşısında Güvercinler Hareketli gelen tek nöronların 'Aksiyon Potansiyelleri kayıt

Ölçülü ve Serbest uçan Bal Arısı Nörofarmakolojik Manipülasyon,