Bu çalışma Rowland Yeni Fellow programı tarafından desteklenmektedir. Chris Stokes özel yapılmış, bilgisayar destekli basınç kontrolü kurulumu, Ph.D. Diane Schaak, gelişmesinde yaptığı yardım için: Yazarlar Harvard&#39;da Rowland Enstitüsü bilim adamları ve personel için minnettarlığını ifade etmek istiyorum biyolojik numune taşıma için onun girişi için, Winfield Tepesi için elektrik kurulumu, Ph.D. Alavaro Sanchez, gelişmekte Basınç kurulumu için gerekli mekanik tesisat bileşenleri işlemek için sitometrede akış, Scott Bevis, Kenny Spencer ve Don Rogers erişim verilmesi için. Mikroakışkan ustaları Harvard Üniversitesi&#39;nde Nano Sistemleri Merkezi (MSS) de imal edildi.

1. Hücre Hazırlanması <ol><li> Levha 1 x 10,% 10 (h / h) cenin sığır serumu ve 1 ile takviye Leibovitz L-15 Vasatı içerisinde doku kültürü T75 şişesi başına 10 ml&#39;lik bir hacim içinde metastatik göğüs kanser hücre hattı MDA-MB-231 5 hücre / mi % penisilin-streptomisin. </li><li> 0% CO2 ortamında 37 ° C&#39;de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde, MDA-MB-231 hücreleri inkübe edin. </li><li> 2 dakika boyunca% 0.25 tripsin-EDTA ile işleme tabi tutarak hücreler 2 gün sonra tohumlama deneyleri için Hücreleri, büyüme ortamı ve 8 ml eklenerek tripsin enzim aktivitesini bloke ederler. </li><li> 5 x 10 5 hücre / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona (Ca 2 + ve Mg2 + olmaksızın DPBS, 1x) Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su içinde 200 x g ve tekrar süspansiyon 5 dakika boyunca santrifüj ile pelet hücreleri. </li></ol> 2. Cihaz Tasarımı ve İmalatı NOT: Maske, ana kalıp yapımında veMikrokanal parça işlem olup, polidimetilsiloksan (PDMS), mikrokanal döküm işlemi normal bir laboratuvar masa üstü gerçekleştirilebilir ise temiz bir oda içinde gerçekleştirilmiştir edilecektir. <ol><li> AutoCAD, Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi bir mikroakışkan cihaz tasarımı. Cihaz (L = 7 mm W = 40 um arasında, H = 70 um), birden fazla enjeksiyon girişine, kaba filtre ve iki paralel düz dikdörtgen şekilli eylemsiz odaklama kanallı bir giriş oluşmalıdır. Bağımsız bir düz kanal alüminyum elektrotlar delikleri ile iki tane ayrı 800 um yerleştirilir 5 elektroporasyon odası, (W, C = 400 um) oluşur. İki çapraz bitişik kesonlar elektroporasyon negatif elektrot için delik paylaşır. Iki düz kanal elektroporasyon bölgenin mansabında bir prize birleştirme. </li><li> LinkCAD kullanarak bir GDSII dosyaya mikro-desenli CAD dosya dönüştürme. Boş bir 5 &quot;x 5&quot; photomask mikro-desen yazBir lazer maske yazıcı kullanarak. Üreticinin protokolünü takip ederek, maske geliştirir. NOT: Maske gelişim süreci Photoresist gelişen, krom aşındırma ve kaldırma karşı içermektedir. Alternatif olarak, mikro-desenler yüksek çözünürlüklü bir şeffaflık üzerine basılmış (&gt; 20.000 dpi) üçüncü taraf üreticiler satın alınan ve bir photomask olarak kullanılabilir. Bir photomask Final mikro özellikleri olumsuz Fotorezist kutuplarını maç şeffaf olmalıdır. </li><li> 70 um son kalınlığı için 2000 rpm&#39;de, 4 inçlik bir silikon gofret üzerinde olumsuz bir fotorezist tabaka ile bükülmüş, standart yumuşak litografi teknikleri kullanarak cihazı 23 tasarım döküm kalıbı imal. </li><li> 95 ° C&#39;de 20 dakika boyunca negatif fotorezist ile gofret Önceden fırınlanmış patates. </li><li> Gofret ile maske başvurun ve bir maske hizalama kullanarak 80 saniye boyunca bir UV kaynağı (17.4 mj / cm 2) maruz. </li><li> Bir SU-8 geliştirici 4 dakika boyunca maruz gofret geliştirin. </li><li> Tedbiryüzey profilometre kullanarak gelişmiş Fotorezist kalınlığı. </li><li> Madde (silikon elastomer kiti) kurutma elastomer 1 oranında ve PDMS, kopyaları oluşturmak için döküm kalıbı üzerine dökün: dikkatli bir şekilde 10 karıştırın. 30 dakika boyunca gazdan arındırın döküm elastomer ve 2 saat boyunca 70 ° C&#39;de bir fırın içinde gazı alınmış bir elastomer ile döküm kalıbı sertleştirmek. </li><li> Pin mengenesi kullanarak girişleri, çıkış ve elektrot ilaveler için kalıp ve zımba deliklerinden mikrokanallı desenleri ile tedavi PDMS çoğaltma delamine. Not: pim mengenenin normal kesme kenar çapı yerine sıkıca PEEK boru (1/32 OD &quot;) ve alüminyum elektrotlar (0,029 OD&quot;) tutulması için yeterli 0.76 mm olması gerekmektedir. </li><li> Sırasıyla 75 ve 500 W mTorr, bir radyo frekans güç ve oksijen kısmi basıncında 7 saniye boyunca bir oksijen plazma temizleyici bir cam slayt bağlama PDMS kopyalarına kapalı mikroakışkan kanal oluşturur. </li></ol> 3. Akış Deneyler <ol><li> Eklealüminyum elektrotlar (0.029 &quot;OD) ve bir çıkış PEEK boru (1/32&quot; mikrokanalda delikleri yoluyla belirlenen yerlere OD) (Şekil 3B). </li><li> Alüminyum elektrotlara yüksek gerilim kısa kare dalga darbeleri üretmek için 18 sorumlu elektrik donanımı bağlayın PDMS kalıp çözeltilerin akıtılmasıyla ile temas halinde olduğu (Şekil 3C). NOT: ekipman darbe jeneratörü ve bir in-house inşa yüksek gerilim amplifikatör oluşmalıdır 18. </li><li> (Şekil 3A) hücreleri ve bir molekül olarak dört adet 50 ml&#39;lik bir santrifüj tek DPBS ihtiva eden tüpler, çözeltiler hazırlayın ve pnömatik akış kontrol sistemine bağlı olarak, ilgili şişe tutucu için her bir tüpe takmak. 18 </li><li> Mikroakışkan cihaz ilgili giriş deliklerine flakon sahiplerinden giriş PEEK hortumu bağlayın. </li><li> Elektrik Bes olması için 100 V, kare dalga darbeleri, V büyüklüğünü ayarlamaLD gücü E = v / l, e elektroporasyon bölmesi üzerinde 0.7 kV / cm eşdeğer olduğu. Not: Burada, Y e pozitif ve negatif elektrotlar akan çözeltisi ile temas halinde olan iki nokta arasındaki mesafedir (Şekil 1 e bakınız). </li><li> 40 psi&#39;ye kadar basınç regülatörü ayarlayın. NOT:. Tek elle ayarlanabilir azot kaynağı muntazam tüm numune şişeleri basınç vermek için kullanılan ve yüksek hızda manifoldu zamanında ısmarlama LabVIEW yazılımı aracılığıyla bireysel çözüm noktalarını etkinleştirmek için kullanılır 18 </li><li> Valf kontrolü için, Vana Runner etiketli ısmarlama LabVIEW yazılımı açın ve işletmek başlıklı açılır menüden çalıştırmak tıklatın. </li><li> Her gelen valf ikonuna tıklayarak vanalar açın. NOT: aktive olduğunda vana simgesi yeşil dönmelidir. Etkin simgesini tıklayıp devre dışı ve vanasını kapatın olacaktır. Kapalı vana simgesi gri dönmelidir. </li><li> (DPBS rezervuar vanasını açınyani., 1.5 dakika boyunca sabit bir hücre hapsi girdap oluşumu için gereklidir ana akış hızına yıkama çözeltisi). </li><li> 30 saniye (örneğin, hücre yakalama adım) için elektroporasyon bölmesi içinde tuzak hücrelere hücre çözeltisine yıkama çözeltisi, aktif solüsyon noktası geçin. </li><li> Çözüm anahtarlama adım sırasında undisrupted akışını sağlamak için hücre hapsi aşamasından önce 10 saniye aynı anda cihaz yoluyla hem yıkama hem de hücre çözümler akış. NOT: Bu kısa eş akış adım, her bir çözelti anahtarlama adımında tekrar edilmelidir. </li><li> Yıkama portu açın ve non-tuzak kirlenmesine neden olan hücreler ortadan kaldırmak amacıyla 20 saniye boyunca cihazı yıkayın. </li><li> Çevrede cihazına (3000 Da nötr veya anyonik dekstran molekülleri ya da 1.5 mg / 70000 Da nötr dekstran molekülün ml 0.2 mg / ml) ilk molekülü içeren çözelti enjekte edilir. </li><li> Derhal enjeksiyonundan sonra beş kısa darbeleri (Dt 2 sn aralıklarla 30 msn =) UygulaMoleküler çözümü ve bir osiloskop kullanarak gerçek zamanlı olarak uygulanan elektrik akımı büyüklüğünü ve süresini izlemek. </li><li> 3.10 birçok kez ek moleküllerin sayısı olarak adımı tekrar teslim edilmesi. Her moleküler dağıtım için, bu durumda moleküler bir solüsyon içinde 100 sn için kuluçkalayın 100 temizle fazla molekülleri uzaklaştırmak için yıkama çözeltisi ile yıkayın cihazı. </li><li> 5 psi değerinin altında ve çalışma basıncı düşürerek alt analizi için 96 oyuklu bir plaka içerisinde hücreleri bırakın. Not: 100 hücre ile çözelti yaklaşık 100 ul her yayın toplanır. </li><li> Deneysel akış sitometri için yeterli hücreleri toplamak için 3.16 üç kez ile 3.9 adımları çalıştırın. </li><li> 228 x g&#39;de 5 dakika boyunca işlenen hücreleri ihtiva eden 96 oyuklu bir plaka santrifüj. </li><li> Aşırı floresan moleküller içerir süpernatantı. </li><li> Flow sitometri analizi için DPBS&#39;de süspansiyon hücreleri. </li><li> Moleküler u sitometrede akışında yük hücreleriverimlilik analizi emme. </li></ol>

<ol>
	<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+Past+present+and+future.">Electroporation Past present and future.</a> Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).</li><li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery.">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).</li><li>Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+electro-microfluidic+channel+for+single+cell+electroporation.">Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation.</a> Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).</li><li>Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+electroporative+dye+uptake+by+mouse+B+cells.">Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells.</a> Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).</li><li>Jaroszeski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+anticancer+agents+mediated+by+electroporation+in+vitro.">Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro.</a> Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).</li><li>Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells+by+an+improved+version+of+MultiRound+Gateway+technology.">Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology.</a> Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).</li><li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses.">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).</li><li>Heller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intradermal+delivery+of+interleukin-12+plasmid+DNA+by+in+vivo+electroporation.">Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation.</a> DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).</li><li>Boukany, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells.">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Effects+of+Nanosecond+Pulsed+Electric+Fields+Combined+with+Low+Concentration+of+Gemcitabine+on+Human+Oral+Squamous+Cell+Carcinoma.">Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma.</a> In Vitro PLoS One. 7, (2012).</li><li>Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+electroporation+chip+using+multiple+electric+field+zones+in+a+single+channel.">Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel.</a> Appl Phys Lett. 101, (2012).</li><li>Wang, S. N., Lee, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-/nanofluidics+based+cell+electroporation.">Micro-/nanofluidics based cell electroporation.</a> Biomicrofluidics. 7, (2013).</li><li>Sharei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vector-free+microfluidic+platform+for+intracellular+delivery.">A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery.</a> Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).</li><li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+by+OCT4.">Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4.</a> Nature. 461, U649-U693 (2009).</li><li>Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-encapsulation+of+two+plasmids+in+chitosan+microspheres+as+a+non-viral+gene+delivery+vehicle.">Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle.</a> J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).</li><li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, U311-U313 (2007).</li><li>Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+size-based+rare+cell+enrichment+using+microscale+vortices.">High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices.</a> Biomicrofluidics. 5, (2011).</li><li>Yun, H. Y., Hur, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+multi-molecule+delivery+using+vortex-assisted+electroporation.">Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation.</a> Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).</li><li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+theory+and+methods,+perspectives+for+drug+delivery,+gene+therapy+and+research.">Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).</li><li>Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vortex-assisted+DNA+delivery.">Vortex-assisted DNA delivery.</a> Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).</li><li>Jia, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonviral+minicircle+vector+for+deriving+human+iPS+cells.">A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells.</a> Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).</li><li>Dunbar, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+hematopoietic+stem+cells+Implications+for+gene+therapy+of+human+disease.">Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease.</a> Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).</li><li>Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+Unlabeled+Proteins+into+Living+Cells+by+Electroporation+and+Isolation+of+Viable+Protein-Loaded+Cells+Using+Dextran+Fluorescein+Isothiocyanate+as+a+Marker+for+Protein-Uptake.">Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake.</a> Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).</li><li>Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Electroporation-Fast+Molecular-Exchange+by+Electroosmosis.">Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).</li><li>Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+electrophoretic+DNA+transfer+into+cells.+The+effect+of+DNA+interaction+with+electropores.">Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores.</a> Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).</li><li>Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+large+molecules+into+viable+fibroblasts+by+electroporation+Optimization+of+loading+and+identification+of+labeled+cellular+compartments.">Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments.</a> Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).</li><li>Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+specific+antibodies+into+electropermeabilized+cells+is+a+valuable+tool+for+eliminating+specific+cell+functions.">Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions.</a> Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Verim ve çoklu teslimat molekül verimlilikte yeni paralelleştirilmiş elektroporasyon platformu 10 kat geliştirilmesi ile, daha önce geliştirilmiş tek odacıklı sistem sağladığı tüm yararları ek olarak elde edildi. 18 Daha önce hazır yararları: (i) ön-arıtılması canlılık geliştirme için üniform bir boyut dağılımı, (ii) tam bir dozaj ve ayrı ayrı moleküler kontrol ve (iii) düşük işletme elektrik akımı ile hedef hücrelere. Bu molekül ağırlıkları, konjuge florofor türleri ve bir elektrik yükü geniş kolayca elde edilebilir, çünkü, floresanla işaretlenmiş dekstranlar, ilgi konusu moleküllere olarak seçilmiştir. Bu makro-moleküller. Floresan dekstran, kuluçka süresi 24 optimum konsantrasyonu onlar doğal olarak yaşayan hücrelerin için geçirimsiz membran ve sitotoksisite sergilemek değil çünkü böyle bir çalışma için iyi bir aday ve elektriksel parametreler mevcut sistem önceki t tespit edildielektroporasyon deneyler o. Optimizasyon süreci nedeniyle gerçek zamanlı moleküler alım sürecini izlemek üzere platformun yeteneği oldukça basit ve etkili oldu. Bu sürecin Görselleştirme az-hayır elektroporasyon parametreleri bilgisine sahip bir molekül veya hücre tipi test ediliyor ise çok faydalıdır. Test edilen tüm moleküller için inkübasyon süresi başarılı moleküler teslimat tamamlandığını gösteren, 10 odaları içinde sıkışıp hücreler, gerçek zamanlı olarak tespit edilebilir sinyal floresan yoğunluğu sergileyen 100 s olarak ayarlandı. Bu moleküler teslimat için gerekli asgari kuluçka süresi olduğunu unutmayın. O sadece difüzyon 4,19,25 veya elektroforez aracılı olup olmadığını, elektroporasyon kullanarak moleküler teslim sürecine ilişkin uzun soluklu bir tartışma olmuştur. Moleküler teslimat baskın mekanizmasının 26 Kimlik karşılaştırarak, zahmetli bireysel testlerin bir dizi içerir tO moleküler boyutlarda, elektrik ücretleri ve elektroporasyon parametrelere bağlı olarak belirsizdir. Yazarların bilgimize için, bu zahmetli optimizasyon süreçleri geleneksel elektroporasyon sistemleri ile bildirilmemiştir. 4,26-28 geliştirilen sistemin basit bir parametre optimizasyon yeteneği elektroporasyon verimliliği inceleyerek değişikliklerden, baskın moleküler dağıtım mekanizmasının belirlenmesi için izin Moleküler ve elektrik parametrelerine bağlı olarak. Sonuçlar anyonik 3.000 Da dekstran verimliliği gözlenen moleküler alım muhtemelen difüzyon aracılık olduğunu düşündüren, onun nötr meslektaşı (sırasıyla 83 ve% 75) önemli ölçüde daha farklı olmadığını göstermiştir. Diğer elektroporasyon sistemlerin aksine, işlenmiş hücrelerin sürekli olarak bu sistemde elektroporasyon işlemi boyunca ajite edilmiştir. Yörüngedeki hücrelerin floresan sinyalleri kademeli artış olduğunu yayılmasını düşündüren domina olurdu gözlendint dağıtım mekanizması. Nötr 70,000 Da dekstran molekülleri yüksek verim moleküler alımı (% 90) daha fazla, hatta yüksek molekül ağırlıklarında teslim işlemi difüzyon sonucu ortaya çıktığını göstermektedir. Son olarak, 3000 Da anyonik ve nötral dekstran moleküllerin başarılı sıralı teslim moleküler teslim molekülleri ücret rağmen meydana iddiasını katılaşır. Bu sonuç aynı zamanda membran mühürleme Elektroporasyonun 3 dakika (moleküler doğum başına 100 sn) içinde tamamlanması olmadığını göstermektedir. Sunulan moleküler dağıtım platformu sırayla bakılmaksızın elektrik yüklerinin moleküler boyutlarda geniş aralıkları sunabilirsiniz. Zamanında ince ayar ve bireysel parametrelerin değiştirilmesi gerçek zamanlı çalışma izleme yeteneği ile destekli az çaba ile elde edilebilir. Bu sistem özellikle esaslı hücre saflaştırma işlemi laboratuarda örnek hazırlama ve zaman alıcı bir santrifüj öncesi ve sonrası elektroporasyon için olan ihtiyacı ortadan kaldırıradım. Ayrıca, sistemin düşük işletme akımı önemli ölçüde hücre ölümlerini azaltmaktadır.

Son yıllarda, hücre dışı molekülleri sitosolik sağlanmasının kolaylaştırılması için elektrik darbeleri kullanımı memeli hücreleri manipüle çekici bir araç haline gelmiştir. 1 ayrıca elektroporasyon gibi bilinen bu yöntem, tersine çevrilebilir şekilde erişim elde etmek için doğal olarak zarın geçirgen moleküller sağlayan, hücresel membran permeabilizes hücrelerin hücre içi muhitine. Hemen hemen herhangi bir molekül, elektroporasyon kullanılarak hücre herhangi bir tip membran geçici oluşturulan gözenekler yoluyla sitosol içine sokulabilir için, teknik olarak rapor edilmiş olan, daha fazla tekrarlanabilir evrensel olarak uygulanabilir, ve virüs aracılı, kimyasal mekanizmayı da içeren diğer yöntemlere göre daha verimli Hücreler, canlı ve sağlam tutarken ve optik yaklaşımlar. 2-3 Bu teknik, floresan molekülleri yerleştirilebilir 4 ilaçlar 5 ve nükleik asitler 6-7 kullanılmıştır. Bu faydaları göz önüne alındığında, elektroporasyon ortak emek olarak kabul edilmiştirDNA, transfeksiyonu için atory teknik, in vivo gen terapisi 8 ve hücre aşı çalışmaları. Başarılı elektroporasyon için gerekli olan elektrik alan gücü yakından hücrenin çapı ilişkilidir, çünkü geleneksel elektroporasyon sistemleri aynı zamanda boyut olarak büyük heterojenlikleriyle bu numuneler için pratik etkinlik ve canlılığı elde etmek için olması, yine de, zordur. Ayrıca, bu sistemlerin çoklu moleküler miktarlarda hassas kontrolü toplu Stokastik moleküler teslimat sürecinde güven nedeniyle teslim izin vermez. 9 bu sorunları ele almak için bir çok grup, alt gözeneklendirmenin gerilimlerinin avantajı sunan, mikrofluidik elektroporasyon platformları geliştirdik Daha iyi transfeksiyon verimi, hücre ölüm oranlarında önemli bir azalma ve çoklu molekülleri iletme kabiliyeti. 10-13 Bu avantajlar, elektrot aralığı olan mikro elektro sistemleri az yer kaplayan sayesinde mümkün olmuşturuzunlukları ölçüde başarılı teslimat için gerekli gerilimleri azalan, alt milimetre. Ayrıca, bu mikro elektroporasyon sistemler dağıtım verimliliğini artırırken, indirgenmiş hücre ölümlerini, sonuçta üretilen ısıyı hızla homojen bir elektrik alan dağılımı elde edebilir. Ayrıca bu mikroçipler için şeffaf malzeme kullanımı istemi parametre değişiklikleri için elektroporasyon işleminin yerinde gözlem sağlar. 2,12 Ancak, hassas dozaj kontrolü ve araştırma ve tedavi uygulamaları, 6 gelişmekte için gerekli moleküllü ve hücresel-bağımlı parametre kontrolü, 14-16 hala çözülmemiş kalır. Bu çalışma, ardışık olarak, hedef hücrelerin önceden seçilmiş aynı popülasyonu içine çok molekül verme yetisine sahip bir mikroakışkan girdap destekli elektroporasyon sistemi sunar. Üniform bir boyut dağılımı olan hücreler, daha önce rapor si kullanılarak Elektroporasyondan önce izole edilirze-seçici yakalama mekanizması. 17-18 bir üniform bir boyut dağılımı, daha az değişim elektroporasyon verimlilikte elde edildi ve belirli bir elektrik alanı gücüne göre geliştirilmiş canlılığı sahip olarak. 19 Bundan başka, sürekli mikro girdapları kullanılarak yakalanan hücrelerin ajite boyunca moleküllerin homojen dağılımı için bırakıldı sonuçları ile uyum içindedir bütün sitosol, daha önce, bu sistem, genel olarak, biyolojik uygulamalarda, molekül, geniş bir aralığına uygulanabilirdir olacağını saptamak. bir girdap destekli platform kullanılarak elektroporasyon 20 bilgi teslim edilmiştir molekül ağırlıkları çok geniş bir yelpazede olan makro moleküller metastatik meme kanseri hücreleridir. Ayrıca, gerçek zamanlı süreç izleme yardımı ile, bu iş ağırlıklı olarak difüzyon-aracılı. 14 karşı elektroforezi-aracılı olmak, electrporation sırasında moleküler teslim mekanizması ile ilgili uzun süredir tartışmalara bir son vermek için daha fazla kanıt sağlar </sup&gt; Diğer elektroporasyon sistemlerden farklı olarak, bu platform benzersiz elektroporasyon hassas çok moleküllü teslimat, yüksek moleküler temin verimi, en az hücre ölüm oranı, boyutu ve teslim moleküllerin ücretler geniş bir açıklık, hem de gerçek zamanlı görsel kombine avantaj sağlamaktadır süreci. Bu yetenekleri göz önüne alındığında, geliştirilen elektroporasyon sistemi elektroporasyon moleküler dağıtım mekanizmalarını derinlemesine anlaşılması için gerektiren hücresel yeniden programlama çalışmaları, 6,14,21-22 ilaç dağıtım uygulamaları 10,19 ve uygulamalar için çok yönlü bir araç olarak pratik bir potansiyele sahiptir.

<table><tbody><tr><td>MDA-MB-231 cancer cell line</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;s L-15 Medium</td><td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>21-030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer easyCyte HT</td><td>Millipore</td><td>0500-4008</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen Plasma Cleaner</td><td>Technics Micro-RIE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dektak 6M surface profiler</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KMPR 1050</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compressed Nitrogen gas</td><td>Airgas</td><td>NI 300</td><td></td></tr><tr><td>High Pressure Regulator</td><td>McMaster-Carr</td><td>6162K22</td><td></td></tr><tr><td>Downstream regulator</td><td>McMaster-Carr</td><td>4000K563</td><td></td></tr><tr><td>High-speed 3/2way-8 valve manifold</td><td>Festo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inline Check Valve</td><td>Idex Health and Science</td><td>CV3320</td><td></td></tr><tr><td>5/32&quot; OD x 3/32&quot; ID Polyurethan tubes</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-156F-0</td><td></td></tr><tr><td>1/4&quot; OD X 0.17&quot; ID Polyurethan tubes</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-250PB-4</td><td></td></tr><tr><td>1/16&quot; PEEK tubings</td><td>Festo</td><td>P1533</td><td></td></tr><tr><td>1/32&quot; PEEK tubings</td><td>Idex Health and Science</td><td>P1569</td><td></td></tr><tr><td>PEEK tubing unions</td><td>Idex Health and Science</td><td>P881</td><td></td></tr><tr><td>Pulse Generator</td><td>HP</td><td>8110A</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Wire</td><td>Bob Martin Company</td><td>6061 ALUM</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Agilent</td><td>DSO3062A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tube</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>T75 culture flask</td><td>VWR</td><td>82050-862</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D3307</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral&amp;nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D1819</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D3329</td><td></td></tr></tbody></table>

microscale vortex-assisted electroporator for sequential molecular delivery

Fiziksel hücrelerine olmayan geçirgenler dışsal moleküler problar tanıtmak için çok güçlü bir tekniktir çünkü elektroporasyon, geçmiş yıllarda artan ilgi görmüştür. Bu çalışma, hassas ve moleküler bağlı bir parametre kontrol memeli hücreleri için birden fazla molekül teslimat gerçekleştirebilen bir mikroakışkan elektroporasyon platformu bildirir. Üniform bir boyut dağılımı ile hücreleri izole etmek için etme kabiliyeti verilen elektrik alanı gücüne göre elektroporasyon verimlilikte az varyasyona izin verir; Bu nedenle örnek canlılığı artırmıştır. Dahası, bu süreç de görselleştirme özelliği verimliliğin arttırılması için in situ moleküler hızlı teslimat parametre ayarlaması izin gerçek zamanlı flüoresan molekül alım işlemi, gözlem için izin verir. Bildirilen platformunun geniş yeteneklerini göstermek için, farklı boyutlarda ve elektrik ücretleri ile Macromolecules (örneğin, Dextran&#39;ın 3.000 ve 70.000 Da MW ile) vardıtest edilen tüm molekülleri için yüksek bir uygulama randımanı (&gt;% 70) ile metastatik meme kanserli hücrelere verilebilir. Geliştirilen platform-chip elektroporasyon teknikleri yararlı olabilir araştırma alanları genişleme kullanım potansiyelini kanıtlamıştır.

Geliştirilen paralel mikroakışkan Electroporator metastatik meme kanseri hücrelerini canlı olarak çeşitli boyutlarda ve elektrik ücretleri makromolekuller teslim. Başarılı moleküler teslimat yerinde niteliksel elektroporasyona yörüngedeki hücrelerinin floresan yoğunluğundaki değişmeler izlenerek tespit ve akış sitometresi analizi ile ölçümü ile teyit edilmiştir. 4A muamele edilen hücrelerin% 90 70000 Da nötr dekstran alımı olduğunu göstermektedir. İstatistiksel analiz için, her flüorofor için bir yoğunluk eşik işlenmemiş canlı hücrelerin çoğunluğu (&gt;% 99) eşiğinin altında sayılır şekilde kurulmuştur (Şekil 4 (c)). Verim hücre sayısına oranı olarak tanımlanmaktadır başarılı bir şekilde işlemden geçirilmiş hücrelerin toplam sayısı, ilgi konusu molekülleri yer kaplamaz. Şekil 4B, verimi büyük ölçüde moleküler bağlı olarak değişiklik göstermektedir değilağırlık veya elektrik ücretleri (&gt; 0.1 P). Test edilen dekstran molekülleri% 70 daha büyük verimlilik ile sitozolüne teslim edildi. Buna ek olarak, Şekil 4D ardışık iletim başarıyla molekül anyonik ve aynı molekül ağırlığı (Mw = 3,000 Da), nötr dekstranlar ile% 56 arasında bir ikili molekül temin verimi ile gerçekleştirildiğini gösterir. Hücreler işleyebilir mevcut sistem daha önce bildirilen sistemi 18 daha yüksek verim ve çok moleküllü iletim verimliliği 10-kat ve bu iyileşme (sırasıyla, anyonik ve nötral dekstran% 82 ve% 70), tek bir molekül teslimat etkilemez. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/51702/51702fig1highres.jpg" /> Şekil 1. (A) mikroakışkan elektroporasyon sisteminin şematik bir (C olarak gösterilen) hücreleri için girişler oluşan moleküller (M1 ve M2 olarak da belirtilmektedir) ve bir gömme solutiyon (F olarak gösterilen), atalet odaklama gerçekleşir, iki düz kanal, elektrot ve bir çıkış 10 elektroporasyon odaları. bir 1 uM FITC çözeltisi ve bir yıkama solüsyonu (DPBS) ile giriş (B) Çözüm değişimi gösterir gösteri etken solüsyon olduğu eşit alt gözlerin tümünde diziler enjekte edilebilir. Görüntü kontrast look-up tablosu (LUT) ayarlayarak tarafından geliştirilmiştir. Ölçek çubukları 250 mikron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51702/51702fig1large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/51702/51702fig2highres.jpg" /> Şekil 2. 10 pozitif (+) ve negatif elektrotlar, beş oluşan kısa darbeli yüksek voltaj uygulama için kullanılan 15 kutuplu bir elektrodun bir fotoğrafı, (-). Her bir pozitif elektrodun bir negatif elektrottan 2 mm aralıklarla yerleştirilmiş, ve E,Aynı polarite ach elektrot 1.35 mm aralıklı edilir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51702/51702fig2large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/51702/51702fig3highres.jpg" /> Şekil 3. Deney düzeneğinin şematik, (A) akışkan kontrol birimi (B) mikroakışkan Electroporator ve (C), elektrik ekipman kapsayan. Molekülleri, hücre ve temiz bir tampon ihtiva eden çözeltiler (A), tek tek şişeler basınçlıdır LabView kontrollü pnömatik akış sistemini kullanarak talep üzerine. Basınçlı şişe den olan solüsyon. Yüklü bir çek valf PEEK boru içinden mikroakışkan elektroporatörü içine enjekte edilir (B) ve (C) elektrik sinyalleri, f ile temas halinde 15 iğneli elektrotlar gönderilirelektroporasyon aşaması sırasında mikro-akışkan sisteminde iyice silinir çözelti. Programlanmış süresi ile elektrik darbeleri sinyal oluşturucu ve elektrik akımının büyüklüğünü yüksek voltaj amplifikatörü 100 V için yükseltilir kullanılarak üretilir. Tüm uygulanan elektriksel parametreler bir osiloskop kullanarak gerçek zamanlı olarak takip edilmektedir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51702/51702fig3large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/51702/51702fig4highres.jpg" /> Şekil 4. Temsilcisi veri akış sitometri. (A) başarıyla kontrol meslektaşı ile karşılaştırıldığında, 70.000 Da anyonik dekstran molekülü aldı MDA-MB-231 hücrelerinin Floresan sinyalleri. (B) verimlilikleri her transfer dekstran molekül için bağlı moleküler önemli göstermezlerdeğişimi (p&gt; 0.1). (C), elektroporasyon (kontrol) ile muamele görmemiş hücrelere göre profil, Örnek sitometri akışı. Başarılı moleküler teslimat gösteren floresan eşik kontrol örneklerinden sinyalleri eşiğinin altında bulunmaktadır, öyle ki veriler ayarlanır. Ardışık elektroporate edilmiş hücrelerde için veri sitometrisi (D) Örnek akışı. Sağ taraftaki çizim ve floresan görüntü çizgi sitometri akışı, yeşil, kırmızı ve sarı kutu sırası ile, 3000 Da-dekstran, nötr, sadece anyonik dekstran ve her ikisi de sadece dekstran molekülleri iken aşırı hücrelerinden floresan sinyalleri temsil eder. Ölçek çubuğu 100 m. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51702/51702fig4large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery at JoVE.com

Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Bir mikro-akışkan girdap eliyle elektroporasyon platformu kesin dozaj ve bağımsız kontrolü ile aynı hücre popülasyonlarına dağılımını çok sayıda molekülün ardışık olarak verilmesi için geliştirilmiştir. Sistemin büyüklüğü göre hedef hücre saflaştırma adımı önceki elektroporasyon moleküler verme etkinliğini ve işlenmiş hücre canlılığı arttırmak için destekli.

Microscale Vortex destekli Sıralı Moleküler Teslimat için Electroporator

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

microscale-vortex-assisted-electroporator-for-sequential-molecular

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.5K Görüntüleme.  Harvard University.  Bir mikro-akışkan girdap eliyle elektroporasyon platformu kesin dozaj ve bağımsız kontrolü ile aynı hücre popülasyonlarına dağılımını çok sayıda molekülün ardışık olarak verilmesi için geliştirilmiştir. Sistemin büyüklüğü göre hedef hücre saflaştırma adımı önceki elektroporasyon moleküler verme etkinliğini ve işlenmiş hücre canlılığı arttırmak için destekli. 

Video: Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Taking Advantage of Reduced Droplet-surface Interaction to Optimize Transport of Bioanalytes in Digital Microfluidics

Digital microfluidics (DMF), a technique for manipulation of droplets, is a promising alternative for the development of &#8220;lab-on-a-chip&#8221; platforms. Often, droplet motion relies on the wetting of a surface, directly associated with the application of an electric field; surface interactions, however, make motion dependent on droplet contents, limiting the breadth of applications of the technique.
Some alternatives have been presented to minimize this dependence. However, they rely on the addition of extra chemical species to the droplet or its surroundings, which could potentially interact with droplet moieties. Addressing this challenge, our group recently developed Field-DW devices to allow the transport of cells and proteins in DMF, without extra additives.
Here, the protocol for device fabrication and operation is provided, including the electronic interface for motion control. We also continue the studies with the devices, showing that multicellular, relatively large, model organisms can also be transported, arguably unaffected by the electric fields required for device operation.

The protocol for fabrication and operation of field dewetting devices (Field-DW) is described, as well as the preliminary studies of the effects of electric fields on droplet contents.

Azaltılmış Damlacık-yüzey etkileşiminden yararlanarak Dijital Mikroakiskan içinde Bioanalytes ulaşımı optimize etmek

Digital microfluidics (DMF), a technique for manipulation of droplets, is a promising alternative for the development of &#8220;lab-on-a-chip&#8221; ...

Mühendislik

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

Akustik Nanodispensing teknolojisini kullanarak yüksek verim DNA Plasmid multiplexing ve transfeksiyon

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Genetik

High Speed Droplet-based Delivery System for Passive Pumping in Microfluidic Devices

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery system. Passive pumping is the phenomenon by which surface tension induced pressure differences drive fluid movement in closed channels. The automated fluid delivery system consists of a set of voltage controlled valves with micro-nozzles connected to a fluid reservoir and a control system. These voltage controlled valves offer a volumetrically precise way to deliver fluid droplets to the inlet of a microfluidic device in a high frequency manner. Based on the  dimensions demonstrated in the current study example, the system is capable of flowing 4 milliliters per minute (through a 2.2mm by 260um cross-sectional channel). Based on these same channel dimensions, fluid exchange of a point inside the channel can be achieved in as little as eight milliseconds. It is observed that there is interplay between momentum of the system (imparted by a combination of the droplets created by the valves and the fluid velocity in the channel), and the surface tension of the liquid. Where momentum provides velocity to the fluid flow (or vice-versa), equilibration of surface tension at the inlet provides a sudden stop to any flow. This sudden stop allows the user to control the flow characteristics of the channel and opens the door for a variety of biological applications, ranging anywhere from reagent delivery to drug-cell studies. It is also observed that when nozzles are aimed at the inlet at shallow angles, the droplet momentum can cause additional interesting fluid phenomena, such as mixing of multiple droplets in the inlet.

A novel microfluidic system has been developed using the phenomenon of passive pumping and a user controlled fluid delivery system. This microfluidic system has the potential to be used in a wide variety of biological applications given its low cost, ease of use, volumetric precision, high speed, repeatability and automation.

Mikroakışkan Cihazlar Pasif pompalanması için Yüksek Hızlı Damlacık tabanlı Dağıtım Sistemi

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery ...

Biyoloji

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Biyomühendislik

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and morphology of the obtained microsphere. A microsphere copolymerized with an acrydite-DNA probe was successfully fabricated. Different methods such as asymmetric PCR, exonuclease digestion, and isolation on streptavidin-coated magnetic beads can be used to synthesize single-stranded DNA (ssDNA). However, these methods cannot efficiently use large amounts of highly purified ssDNA. Here, we describe a microsphere-PCR protocol detailing how ssDNA can be efficiently amplified and separated from dsDNA simply by pipetting from a PCR reaction tube. The amplification of ssDNA can be applied as potential reagents for the DNA microarray and DNA-SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment) processes.

This work provides a method for the fabrication of droplet-based microfluidic platforms and the application of polyacrylamide microspheres for microsphere-PCR amplification. The microsphere-PCR method makes it possible to obtain single-stranded DNA amplicons without separating double-stranded DNA.

Bir damlacık dayalı mikrosıvısal yaklaşım ve Microsphere-PCR güçlendirme tek iplikçikli DNA'Amplicons için

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Uzun Süreli Hücresiz Gen Ekspresyonunun İletimi için Çok Katmanlı Mikroakışkan Platform

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Kraniofasial mezenşimin, Elektroporasyon

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

Elektrik-Free, Sıralı Nükleik Asit ve Protein İzolasyonu

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is accompanied by high manufacturing costs, which has brought about an interest in using alternative methods for gene delivery. Electroporation is an electro-physical, non-viral approach for the intracellular delivery of genes and other exogenous materials. Upon the application of an electric field, the cell membrane temporarily allows molecular delivery into the cell. Typically, electroporation is performed on the macroscale to process large numbers of cells. However, this approach requires extensive empirical protocol development, which is costly when working with primary and difficult-to-transfect cell types. Lengthy protocol development, coupled with the requirement of large voltages to achieve sufficient electric-field strengths to permeabilize the cells, has led to the development of micro-scale electroporation devices. These micro-electroporation devices are manufactured using common microfabrication techniques and allow for greater experimental control with the potential to maintain high throughput capabilities. This work builds off a microfluidic-electroporation technology capable of detecting the level of cell membrane permeabilization at a single-cell level under continuous flow. However, this technology was limited to 4 cells processed per second, and thus a new approach for increasing the system throughput is proposed and presented here. This new technique, denoted as cell-population-based feedback control, considers the cell permeabilization response to a variety of electroporation pulsing conditions and determines the best-suited electroporation pulse conditions for the cell type under test. A higher-throughput mode is then used, where this 'optimal' pulse is applied to the cell suspension in transit. The steps for fabricating the device, setting up and running the microfluidic experiments, and analyzing the results are presented in detail. Finally, this micro-electroporation technology is demonstrated by delivering a DNA plasmid encoding for green fluorescent protein (GFP) into HEK293 cells.

This protocol describes the microfabrication techniques required to build a lab-on-a-chip, microfluidic electroporation device. The experimental setup performs controlled, single-cell-level transfections in a continuous flow and can be extended to higher throughputs with population-based control. An analysis is provided showcasing the ability to electrically monitor the degree of cell membrane permeabilization in real-time.

Sürekli akışlı, permeabilizasyon algılamalı mikro-elektroporasyon sisteminin imalatı ve işletilmesi

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

İnsan İdrarından Sürekli Hücre Dışı Vezikül İzolasyonu için Mikroakışkan Cihaz

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. Nevertheless, the current methodologies for isolating EVs present significant challenges, such as complexity, time consumption, and the need for bulky equipment, which hinders their clinical translation. To address these limitations, we aimed to develop an innovative microfluidic system based on cyclic olefin copolymer-off-stoichiometry thiol-ene (COC-OSTE) for the efficient isolation of EVs from large-volume samples in a continuous manner. By utilizing size and buoyancy-based separation, the technology used in this study achieved a significantly narrower size distribution compared to existing approaches from urine and cell media samples, enabling the targeting of specific EV size fractions in future applications. Our innovative COC-OSTE microfluidic device design, utilizing bifurcated asymmetric flow field-flow fractionation technology, offers a straightforward and continuous EV isolation approach for large-volume samples. Furthermore, the potential for mass manufacturing of this microfluidic device offers scalability and consistency, making it feasible to integrate EV isolation into routine clinical diagnostics and industrial processes, where high consistency and throughput are essential requirements.

Yazar Spotlight: Biyoreaktör Entegrasyonu için Asimetrik Alan Akış Fraksiyonasyonu

Extracellular vesicles hold immense promise for biomedical applications, but current isolation methods are time-consuming and impractical for clinical use. In this study, we present a microfluidic device that enables the direct isolation of extracellular vesicles from large volumes of biofluids in a continuous manner with minimal steps.

Çatallı A4F Mikroakışkan Cihaz ile Büyük Hacimli Örneklerden Hücre Dışı Veziküllerin Tek Adımlı İzolasyonu

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. ...