Biz yönteminin gelişmesine yol açan tartışmalar için Anne-Marie Dion-Cote teşekkür ederim. JK ve RB FQNRT doktora alimler vardır, M.-MG Vanier CIHR âlimi, ve J.-YM bir FRSQ kıdemli araştırmacıdır. Bu çalışma, Fen Bilimleri ve JY Mühendislik Araştırma Konseyi fonları tarafından desteklenmiştir. M.

1.. Rekombinan bakulovirüslerin üretimi Bakulovirüsler esas olarak sadece hafif bir değişiklik ile, üreticinin protokolüne uygun olarak Invitrogen&#39;in Bac-to-Bac Baculovirus Expression System kullanılarak üretilir: <ol><li> Bir modifiye pFastBac1 vektörü (Gibco, yaşam) GST ve O&#39;nun etiketleri (Şekil 2) içeren oluşturuldu. PET-52b (+) vektörü (Novagen) multiklonlama bölgesine (MCS), bir 10xHis-etiketi ihtiva eden, pFastBac1-Strep-10xHis oluşturmak için bir pFastBac1 vektörünün MCS sokulmuştur. PET-52b (+) MCS dizisi 5 &#39;ucunda bir BglII kısıtlama sitesi&#39; ucu ve 3 &#39;bölgesinde bir Hind III sınırlandırma sitesi&#39; ucuna eklenmesi, Xbal ve HBLP kısıtlayıcı siteleri arasında amplifiye PCR oldu. PCR ürünü daha sonra BamHI ve BglII kısıtlama dizilerin uyumluluk kullanılarak BamHI ve Hindlll kısıtlama pFastBac1 sitesi arasında klonlandı. Amaç ifade sağlayan bir pFastBac1 oluşturmak için olduğu içinve streptavidin-10xHis etiketleri ile rekombinant protein, pET-52b (+) BamHI kısıtlama alanı MCS sekansı kullanılmadı. Ayrıca, Xbal kısıtlama alanı zaten pFastBac1 bir MCS ve pET-52b MCS ile eklenen, bu (+) &#39;de siteler arasında meydana gelen kısıtlama sitelerinin fazlalık önlemek için kullanılmamıştır. PreScisson Proteaz tanıma sitesi (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) ile GST kodlayıcı sekans daha sonra pFastBac1-Strep-10xHis içine sokulmuştur. PGEX-6P-2 (GE Healthcare) için GST cDNA sekansı PCR sırasıyla 5 de, Ncol ve Kpnl sınırlandırma bölgelerini içeren bir primer &#39;ve 3&#39; ekstremite ile büyütülmüştür. Ncol mevkisi bir başlangıç ​​kodonu ve buna ek olarak değil, aynı zamanda bir GST Alanin sağlar. PCR ürünü daha sonra streptavidin-etiketinin silinmesi ile sonuçlanan, Ncol ve Kpnl kısıtlama siteleri arasında pFastBac1-Strep-10xHis klonlanmıştır. Bu şekilde elde edilen yeni bir füzyon vektörü pFastBac1-GST-10xHis seçildi. </li><li> Pr için cDNA kodlama CloneGST (N-terminal) ve His-etiketi (C-ucu) arasındaki pFastBac-GST-10xHis vektörü içine ilgi otein. C-terminal His-tag ile füzyon izin vermek için cDNA durdurma kodonunu ortadan kaldırmak için dikkat edin. </li><li> E. Transform (Adım 1.2 &#39;de elde edilmiştir) rekombinant pFastBac ile coli DH10Bac bacmid üretir. Koloniler Bluo-gal ve IPTG (10 ug / ml tetrasiklin, 50 ug / ml kanamisin, 7 ug / ml gentamisin, 100 ug / ml Bluo-ihtiva-eden seçme plakaları üzerinde 30 ° C &#39;de 37 ° C ve birkaç saat gece boyunca büyümeye izin verin Gal, 40 ug / ml IPTG). </li><li> Seçim ve beyaz fenotip onaylamak için seçme plakaları üzerinde (adım 1.3) 2 beyaz koloniler restreak. </li><li> 10 ug / ml tetrasiklin, 50 ug / ml kanamisin, 10 ug / ml gentamisin aşama 1.4 &#39;dan iki beyaz koloniler ile ve bunların 37 ° C de bir gece boyunca çalkalama altında (250 rpm) büyümesine izin ihtiva eden LB içinde 2 ml inoküle </li><li> Bacmid DNA&#39;yı saflaştırmak amacıyla, aşama 1.5 bakterileri peletçözeltisi 300 ul I hücreleri tekrar süspansiyon ve çözelti II 300 ul (Qiagen&#39;den Maksiprep kit) ekleyin. , Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe 3 M KOAc, pH 5.5 içinde 300 ul ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edilir. 4 ° C, 10 dakika boyunca yüksek hızda örnekleri santrifüj. Yüzer için izopropanol 800 ul eklenir ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edilir. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj örnekleri ve% 70 etanol içinde 500 ul ile pelet yıkayın. Pelet kuruması ve Tris-EDTA pH 8.0, 40 ul steril koşullar altında yeniden süspanse edin. Bacmid DNA, 4 ° C &#39;de muhafaza edilmelidir </li><li> Üreticinin protokolünde tarif edildiği gibi baculovirüsler oluşturmak. Bakulovirüsler ışıksız bir ortamda 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 2. Rekombinant Protein Expression <ol><li> Arıtma için en verimli bakülovirüsü seçmek ve protein ifade zirve ulaşıldığında ne zaman izlemek için bir mini-enfeksiyon deneyi a gerçekleştirmeks aşağıdaki gibidir: 2 Sf9 x 10 7 bakulovirüsün 133 ul (1/150) ile (% 10 FBS ve% 1 P / S ile tamamlanır) Grace ortam içinde 27 ° C &#39;de kültür hücreleri enfekte Infect. 0, 24, 48, 1.5 ml&#39;lik alikotları toplamak ve 72 saat post-enfeksiyon. Pelet hücreleri ve anti-tag antikoru kullanılarak western blotting ile, ilgi konusu proteinin ekspresyonu düzeyini analiz. </li><li> Virüs ve ortam arasında 1/150 oranı ile bir ortamın 500 ml, ml başına 1.0 x 10 6 Sf9 hücrelerini içeren bir değer değiştirici enfekte etmek için aşama 2.1 &#39;den en verimli bakulovirüs kullanın. Enfekte olan hücreler, 27 ° C &#39;de süspansiyon içinde büyümeye ve en yüksek protein ekspresyon (yukarıdaki aşama 2.1&#39; de tespit edildiği üzere) ulaşıldığında hücreleri hasat olsun. Tanelenmiş hücreler daha fazla kullanıma kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 3. Çözünür hücre lisatı hazırlanması Aşağıdaki kuluçka adımlarının tüm hafif dönme altında 4 ° C&#39;de gerçekleştirilmektedir. <ol><li> Lyse SGST bağlayıcı tampon (150 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 0.05 Triton-X-100, 1 mM 250 mM NaCI nihai konsantrasyon için PBS1X de DTT ve proteaz inhibitör ~ 20 ml ilgi proteini eksprese eden hücreler f9 kokteyli (Roche). bir buzlu su banyosu içinde, bir Dounce homojenleştirici, sonikasyon 3x 30 saniye her biri (% 70 üretim) ile çözeltinin Dounce 20x ve 20x yeniden Dounce. </li><li> (İsteğe bağlı). DNA ya da RNA kontaminasyonu çıkarmak için 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 1 mM MgCI2 ve 7 nükleaz (2.5 U / ml) benzonaz toplam hücre lizatı inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 18,000 rpm&#39;de santrifüje Süpernatant tutun. </li><li> (İsteğe bağlı). Santrifüj süpernatan tekrar 4 ° C&#39;de 18,000 rpm&#39;de 30 dakika boyunca berrak lizat çözünür alır. Tıkanmasını önlemek için, 0.2 ya da 0.45 um&#39;lik bir filtreden süpernatantı geçirir. </li></ol> 4. GST Boncuk Protein bağlanması <ol><li> GST boncuk 1 ml Çözünür hücre lisatı inkübe (iki kez yıkanmışGST 10 mi yumuşak döndürülerek 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca tamponu) bağlayıcı. </li></ol> Yorum: Kuluçka süresi, proteinin stabilite ve bağlanma verimliliği göre optimize edilmesi gerekmektedir. <ol start="2"><li> Hızlı 700 rpm&#39;de spin ve ilişkisiz proteinleri içeren süpernatant kaldırmak (bu daha fazla analiz için muhafaza edilebilir). GST Yıkama tamponu ile GST-bağlı protein (Şekil 3B, şerit 1) yıkayın (GST 350 mM NaCl finali ile bağlama tamponu). </li><li> Adımı tekrarlayın 4.2 2x. Son yıkamadan olarak, mümkün olduğu kadar supernatant çıkarın. </li><li> Isı-şok proteinleri 8 arasında spesifik olmayan bağlanmanın olmaması için 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca (10 mi GST bağlama tamponu içinde) 5 mM ATP ve 15 mM MgCl2 ile boncuk inkübe edin. GST yıkama tamponu ile boncuk üç kez yıkayın. </li></ol> 5. GST PreScisson Dilinim <ol><li> GST boncuk santrifüj, süpernatant kaldırmak ve P5 buf ile GST boncuk yıkayınfer (50 mM NaHPO 4 pH 7.0, 500 mM NaCl,% 10 gliserol,% 0.05 Triton-X-100, 5 mM imidazol). </li><li> 3 saat için gece boyunca 4 ° C den P5 tamponu PreScisson enzimi ile GST-boncuk inkübe (100 ul fraksiyon olarak GST boncuk bölün ve P5 tampon 100 ul seyreltilmiş enzim, 4-8 adet (2-4 ul) ekleyin.) </li></ol> Yorum: PreScisson aşamasının Kuluçka süresi molekül ağırlığı hem de protein kararlılığına göre optimize edilmesi gerekmektedir. Bozunma görülmektedir, bu, bir gece boyunca inkübasyon süresi, 2 saat içinde en az yerine göre azaltılabilir. <ol start="3"><li> Hızlı spin ve süpernatant toplamak. P5 100 ul ekleyerek sonra bu adımı iki kez tekrarlayın boncuklara tampon ve tüm kısımlar (Şekil 3B, şerit 2) havuz. </li></ol> Yorum: Kalan boncuklar bölünme etkinliğinin analizi için kullanılabilir (Şekil 3B </strong&gt;, şerit 3). Genellikle, proteinin% 70-80 bölünmektedir. 6. Protein bağlayıcı TALON Metal Afinite Reçine&#39;ye <ol><li> 1 ml&#39;lik fraksiyonlar halinde 3 yukarıdan elüsyon bölün ve döndürme altında 1 saat boyunca (P5 tamponu ile iki kez yıkanmış) 100 ul Talon metal afinite reçinesi ile kuru boncuk her inkübe edin. </li></ol> Yorum: Bir çok paylarda elüsyon bölme bağlayıcı / yıkama verimliliği artırır. <ol start="2"><li> P30 tamponu (30 mM imidazol, son konsantrasyon ile P5 tamponu) ile reçine 5 dakika yıkanır. </li><li> Adımı 6.2 2x tekrarlayın ve tek bir tüp içinde boncuk havuzu. Son yıkamadan önce, mümkün olduğu kadar supernatant çıkarın. </li></ol> Yorum: Bu TALON bağlı numune (Şekil 3B, şerit 4) karşılık gelmektedir. 7. Saflaştırılmış Protein elüsyonu <ol><li> P5 ile birlikte dönüş altında 5 dakika için protein bağlı TALON reçine inkübe00 tampon maddesi (500 mM imidazol, son konsantrasyon ile P5 tamponu). Tampon ve 01:01 h / h arasında boncuklar arasında bir oranı kullanarak (Eğer kuru boncuk 200 ul almıştı Örneğin, siz P500 200 ul eklemek gerekir). Bu adımı iki kez tekrarlayın ve ayrı ayrı her akıtılan kısmını tutmak (; Şekil 3B, 5-7 kuşak), yıkama 1 (E1) adında yıkama 2 (E2 ve elüsyon 3 (E3)). </li></ol> Yorum: Kalan boncuk elüsyon verimi (Şekil 3B, şerit 8) analizi için kullanılabilir. Tipik haliyle, proteinin% 60-80 toplam akıtılır. <ol start="2"><li> Coomassie mavisi (Şekil 3B) veya görüntüleme için SYPRO protein boyası ile bir SDS-PAGE ve leke üzerinde standart BSA konsantrasyonu her fraksiyonun yaklaşık 20-40 ul yükleme göre saflaştırılmış protein miktarını ve kalitesini analiz edin. </li></ol> Yorum: İlgilenilen proteini aynı zamanda bir uçtan bir uca tespit edilebiliranti-GST ve anti-His antikorları (Şekil 3C) kullanılarak saflaştırma prosedürü hayatları boyunca. 8. Saflaştırılmış proteinin depolanması <ol><li> 4 ° C sıcaklıkta, uygun bir saklama tamponu ile saflaştırılmış proteinin (örneğin 20 mM Tris asetat pH 8.0, 200 mM KAc,% 10 gliserol, 1 mM EDTA, 0.5 mM DTT) Dialyze Bu, diyaliz sırasında, saflaştırılmış proteinin çökeltilmesi için kontrol etmek önemlidir. Genellikle çalkalama döndürme altında 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca 2x dialyze. </li><li> Saflaştırılmış protein (10-20 ul) az miktar yapın ve 30 dakika boyunca kuru buz üzerinde dondurma. -80 ° C&#39;de alikotları saklamak ve birçok çözülme / donma döngüleri kaçının. </li></ol>

<ol>
	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

Burada sunulan GST-His rekombinant proteinlerin saflaştırma protokolü boyutları geniş bir aralığının saflaştırılması için uygundur: başarıyla Li Rad51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa) ve dengesiz yüksek molekül ağırlıklı protein saflaştırılmış Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Ayrıca, bu protokol ile saflaştırılmış proteinler 6 biyokimyasal aktif edildi. Bu yöntemin başarısı, sadece arzu edilen protein ekspresyon, çözünürlük ve stabilite bağlıdır. Bu tür E gibi diğer konaklarda ekspresyon için moleküler biyoloji vektörler coli veya maya, kolayca yaygın olarak kullanılan GST ve O&#39;nun etiketleri kullanılarak değiştirilebilir. Bu, çoğu moleküler biyoloji laboratuvarları için bu tekniğin uygulanabilirliği ve maliyet etkinliğini vurgulamaktadır. Avantajlar çeşitli recombinan bakteriyel veya memeli hücreleri üzerinde enfekte hücreleri seçmek için bir karar etkilenirt protein ekspresyonu ve saflaştırılması. Örneğin, metilasyon, fosforilasyon ve ubikitinilasyonu gibi çeviri sonrası tadilatları güçlü bir proteinin 10 enzimsel işlevini etkileyebilir. Bu nedenle, bir proteinin fizyolojik özelliklerini incelemek için, bu tür Sf9 enfekte edilmiş hücreler gibi dönüşüm sonrası modifikasyonu sağlayan bir sistem, kullanımı tercih edilir. Enfekte olmuş memeli hücre sistemi sistemi ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az maliyetli hücreler ve herhangi bir transfeksiyon yöntemi gerektirmektedir gibi memeli hücreleri üzerinde Sf9 ortamını kullanmanın bir diğer avantajı, örneğin, ekonomik bir nitelik taşımaktadır. Yöntemin basitliği az ekipman ile bir laboratuar için avantajlı olan standart laboratuar ekipmanı ile son derece saflaştırılmış bir biçimde bir protein veya protein kompleksi elde etmeye yardımcı olur.

Rekombinant proteinlerin saflaştırılması biyokimya temel soruları için önemlidir. Iyon değişim kromatografisi ve boyut dışlama kromatografisi gibi protein saflaştırma geleneksel yollar olduğu, örneğin izoelektrik noktası ve ücret ya da boyutu gibi hedef proteinin fiziksel özelliklerine dayanır. Bu ikinci protein özellikleri önemli ölçüde geleneksel protein saflaştırma stratejilerinde kirletici proteinleri şansını arttırır proteinlerin çeşitli tarafından paylaşılır. Bu sorun, zaman alıcı, birden çok arıtma sütun kullanımı ile engellenebilecektir. Aynı zamanda, ikinci kromatografi yöntemler pahalı deney düzeneği gerektirir. Olguların çoğunda etiket ilgi protein benzersiz olacak gibi afinite etiketi arıtma güçlü, hedef-özgüllük artar. Son zamanlarda yapılan araştırmalarda, Flag-ya da HA-afinite saflaştırma yaygın olarak kullanılmaktadır. Mevcut rec aksineTek etiketleri kullanıldığı ombinant protein saflaştırma protokolleri, iki etiketlerin benzersiz bir bileşimini kurulmuştur. Önerilen yöntem, miktar ve istenen proteinin saflığı arasında optimum bir oranı için, ilgi konusu proteinin C-terminalinde N-terminalinde bir His-tag, bir GST-füzyon etiketinin içerir. GST glutatiyon Sefaroz taneleri üzerinde saflaştırma için yüksek verimli bir uzun etiketi (29 kDa) &#39;dir. Ayrıca, KDV kullanarak bizim yöntem 1 maliyet etkinliğini garanti. (Sadece iki amino asit ilavesi ile sonuçlanan tanıma sekansı LeuGluValLeuPheGln / GlyPro ile) PreScisson enzimi ile GST kapalı yarmak için bir olasılık, bir çok avantajı vardır, örneğin, bu strateji allosterik bir engel nedeniyle fizyolojik protein fonksiyonlarının değişiklikler önler. Diğer protein ucuna kaynaşmış His-tag, küçük bölünmüş GST yıkandıktan, hem de bozulmuş proteinlerin ve diğer protein saflığını daha da arttırmak için ikinci bir arıtma adımında karşılık vermektedir<html> kirleticiler. His-saflaştırma adımı kolonu (TALON reçinesi) için GST geçiş Ek olarak, iletişim kuralı, bir diyaliz adımı gerektirmez. Bu tür saflaştırma işlemlerinde yaygın kirletici maddeler ısı şok proteinlerinin (HSP) &#39;dir. MgCI2 ve ATP ile bir kuluçkalama adımının eklenmesi bu kirleticilerin çıkarılması (Şekil 1) sağlar. Hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC), ilgi konusu saflaştırılmış proteinin yüksek verim elde etmek için pahalı enstrümantasyon bağlıdır sıradan yöntemlerdir. Burada mevcut toplu arıtma protokolü, aksine, manuel ve pahalı bir enstrümantal kurulum gerektirmez. Protein yüksek verim protokolünü ölçeklendirme ulaşılabilir. Aynı zamanda, toplu arıtma protokolü ile, elüsyon hacmi FPLC ve HPLC ile verilmezse protein konsantrasyonu arttırmak için ayarlanabilir. ntent &quot;&gt; Aynı zamanda, toplu GST-His arıtma protokolü ile, ~ 10-300 kDa bir boyut aralığı ile proteinler saflaştırılabilir. en büyük avantajlarından biri, aynı anda birkaç proteinleri saflaştırmak gerçeği ile verilir Örneğin, bir vahşi tip ve mutant protein hem de. sunulan protokol başarı sadece, ilgi konusu proteinin ekspresyon seviyesi ve çözünürlüğüne bağlıdır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E.Coli &lt;/em&gt;DH10Bac (competent)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxi Prep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Solution I and II</td></tr><tr><td>Ultra Pure Bluo-Gal</td><td>Gibco (Life)</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gibco (Life)</td><td>15529019</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 infected cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>PreScission enzyme</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Grace&#039;s infected medium supplemented</td><td>Gibco (Life)</td><td>11605-094</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum characterized</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td><td>Gibco (Life)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione Sepharose resin</td><td>GE bioscience</td><td>17075605</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Talon resin</td><td>Clontech</td><td>635504</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>BioShop</td><td>288324</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco (Life)</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal GST-antibody</td><td>Production in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 6X-His-antibody</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer (tight)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td><td>Fisher</td><td>Model 150</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis bag (50 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>2115217</td><td></td></tr></tbody></table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

In vitro protein biyokimyasal karakterizasyonu için in Enzymology anahtar tahliller, ilgi konusu saflaştırılmış proteinin yüksek konsantrasyonlarını gerektirmektedir. Protein saflaştırma protokolleri etkinlik, basitlik ve maliyet etkinliğini 1. birleştirmek gerekir. Burada, bir N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST) ve her ikisi de 2,3-kaynaşmış, bir C-terminal 10xHis etiketi 4 dayanan rekombinant protein için yeni bir küçük ölçekli bir afinite arıtma sistemi gibi GST-His yöntemi tarif ilgilenilen proteine. İkinci yapı, protein ekspresyonu için Sf9 5 enfekte olmuş hücrelerin enfeksiyonu için, baculovirüsler oluşturmak için kullanılır. KDV arıtma verimliliği sağlamak için hizmet veren, oldukça uzun bir etiket (29 kDa) &#39;dir. Bununla birlikte, proteinin fizyolojik özelliklerini etkileyebilir. Bu nedenle, bu daha sonra 6 PreScisson enzim kullanılarak protein kesilir. , En fazla saflık sağlamak ve bölünmüş GST çıkarmak için, biznispeten küçük bir His-Tag göre ikinci bir afinite saflaştırma adımı ilave edildi. Önemli olarak, bizim teknik bu nedenle, bozulmuş proteinlerin çıkması ve etkili bir araçtır, proteinin, iki ucunu yan iki farklı etiketler dayanan, tam uzunluklu proteinlerin zenginleştirir. Burada sunulan yöntem, FPLC gibi pahalı bir enstrümantal kurulum, gerektirmez. Ayrıca, ısı şoku proteini kirleri ve nükleik asitler kontamine kaldırmaya nukleaz tedavisi kaldırmak için MgCl2 ve ATP yıkar dahil. Özet olarak, yandan kuşatan iki farklı etiketler kombinasyonu N-ve C-terminal ve etiketler biri kapalı parçalama yeteneği, ilgi konusu bir yüksek derecede arıtılmış ve tam-boy proteinin kurtarma garanti eder.

GST-His saflaştırma protokolü etkinliğini göstermek amacıyla, Rec14, bir S. arıtıldı 32.9 kDa protein pombe. Rec14 cDNA, sırasıyla N-ve C-termini, (Şekil 1A) GST-ve His-etiketi ekleme olanak veren bir modifiye pFastBac1 vektörü içinde klonlandı. Rekombinant bakulovirüs hazırlanabilir ve protein ifadesi için SF9 enfekte hücreleri enfekte etmek için kullanıldı. Çözünür hücre lizatları GST taneleri ile kuluçkalandı ve bağlanmış proteinleri PreScisson proteaz ile GST bölünmesi ile elüt edilmiştir. Elde edilen Rec14-His protein TALON reçine ve bağlı-proteinler üzerinde saflaştırılarak afinite 500 mM imidazol içeren TALON tampon maddesi ile elüt edilmiştir oldu. Saflaştırılmış Rec14-His depolama tamponu içinde diyaliz edilmiş ve -80 ° C&#39;de (Şekil 1 B) &#39;de muhafaza edilmiştir. Rec14 rekombinan bakulovirüs, ya da kontrol olarak sahte-enfeksiyonlu ile enfekte edilmiş Sf9 hücrelerinden çözünür ve toplam hücre lizatlan, COOM ile analiz edilmiştirbize GST-Rec14-His proteininin ifadesi (Şekil 3A) onaylamak için izin assie mavi boyama,. Saflaştırma işlemi sırasında, çok sayıda numune yöntemin verimliliği takip için analiz edilmiştir. Coomassie blue lekeleme (Şekil 3B), bu örneklerin analizi saflaştırma birinci adım boyunca, GST-Rec14 doğru nedeniyle Rec14 füzyon (32.9 kDa) için ~ 60 kDa kadar bir görünür molekül ağırlığına sahip, GST boncuklara bağlı olduğunu göstermektedir GST (29 kDa) ile (hat 1). GST PreScisson ayrılmasından sonra, 37 kDa (şerit 2) etrafında GST içermeyen Rec14-His göç eder yarılmış GST GST boncuklar (25 kDa civarında şerit 3) üzerinde görüntülenebilir süre. Yine de GST boncuklar (yol 3), dikkate değer zenginleştirme bağlı kaldı GST içermeyen Rec14 bir kısmı olmasına rağmen Rec14-His (Coomassie blue lekeleme görünür herhangi bir kirletici madde ile şerit 2) elde edildi. Bu adım PreScisson ile proteinin inkübasyon süresi artırılarak geliştirilebilir. Talon için Rec14-His bağlı Analiziboncuklar (adım 7.1 sonra, şerit 4) GST saflaştırma aşama (şerit 2) sonra akıtılan proteinleri ile karşılaştırıldığında, Rec14-His büyük bir bölümü TALON boncuklara bağlı olduğunu göstermektedir. Pek çok kez yıkamadan sonra, Rec14-His elüt edilmiş ve toplanmıştır. Üç elüsyonlar yapılmıştı. Bu analiz, yüksek saflık ortaya çıkarmıştır Rec14-His (Coomassie lekeleme testi ile görülen herhangi bir kirletici madde, 5-7 hatlar) ve ilk yıkama in Rec14-His en büyük konsantrasyonu. Boncuklar üzerinde bağlı olarak, sadece az sayıda Rec14-His tespit edilebildiğinden TALON tanelere elute edilen fraksiyonlar (kuşak 5-7) karşılaştırılması yıkamadan sonra (kuşak 8), elüsyonun etkinliğini göstermektedir. Şekil 3B&#39;de kullanılan örnekler prosedür (Şekil 3C) boyunca Rec14 takip etmek için anti-GST ve anti-His antikorları ile Western blot analizine tabi tutulmuştur. Anti-GST blot bir GST-Rec14 ve tek başına GST, GST saflaştırma aşama (şerit 2) için elüe proteinlerinde mevcut olduğunu gösterir ve thkirletici da His-tag afinite saflaştırma aşaması ile çıkarıldı. Bu leke bize de GST verimli PreScisson tedavisi ve His-etiketi saflaştırma aşama (kuşak 4-8) ile Rec14 kaldırılmış olduğu izlemeye olanak sağlar. Anti-His blot Rec14 tespit amaçlamaktadır. Biz böylece GST-Rec14-His ve Rec14-His tamamen parçalanır ve GST boncuklar (şeritli 11) kaldırıldı olmadığını teyit edebilirsiniz. Ayrıca, yüksek bir konsantrasyonda, Rec14 (şerit 13) toplamak gibi görünüyor. Özet olarak, sunulan sonuçlar S. arıtılması için GST-His arıtma etkinliğini göstermek pombe&#39;de Rec14. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50320/50320fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50320/50320fig1.jpg" /> Şekil 1. PFastBac (Baculovir klonlanmıştır GST-His afinite iki aşamalı saflaştırma yöntemi şematik özeti. A. GST-Rec14-His konstrukt. GST-Rec14-His bize ifade vektörü) B. İki adım yakınlık arıtma Sf9 çözünür hücre lizatından:. GST-bağlama GST&#39;nin PreScisson ayrılmasını takiben, TALON bağlayıcı ve imidazol ile yıkama <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/50320/50320fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50320/50320fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50320/50320fig2.jpg" /> Şekil 2. PFastBac1-GST-10xHis şematik. KDV (yeşil), PreScisson proteaz sitesi (açık mavi), multiklonlama sitesi (kırmızı) ve 10-His etiketi (koyu mavi) gösterilir. Alt durumunda PET-52b kaynaklanan nükleotid dizileri (+). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/50320/50320fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50320/50320fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50320/50320fig3.jpg" /> Şekil 3,. Rec14. A&#39;nın GST-His arıtma Örnek sonucu. Total protein fraksiyonu mock ile muamele edilmiş Sf9 hücrelerinden (dizi 2 ve 3) ve çözülebilir hücre lisatı (şerit 4 ve 5) arasında Coomassie boyama (dizi 2 ve 4) ya da GST-Rec14-His bakulovirüs (yol 3 ve 5) ile enfekte edildi. Rec14-His ve GST sırasıyla yaklaşık 32.9 kDa ve 29 kDa arasında bir molekül ağırlığına sahip ve GST-Rec14-His füzyon proteini, yaklaşık olarak 61.9 kDa bir molekül ağırlığına sahiptir. B. Coomassie için (protein saflaştırma yöntemi her adımını gösteren boyama 8 anti-GST (şerit 1) ve anti-His (yol 9-16) antikorlar ile saflaştırma prosedürü takip fraksiyonların ayrıntılı bir açıklama PROSEDÜR) C. Western blot.upload/50320/50320fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Bu protokol, eşsiz bir şekilde bölünebilir GST-tag ve küçük bir His-tag birleştirilmesiyle yeniden birleştirici proteinlerin saflaştırılmasını sağlayan bir yüksek verimli ve düşük maliyetli, küçük ölçekli protein saflaştırma yöntemi göstermektedir.

GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

gst-his-purification-two-step-affinity-purification-protocol-yielding

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

41.9K Görüntüleme.  Hôtel-Dieu de Québec.  Bu protokol, eşsiz bir şekilde bölünebilir GST-tag ve küçük bir His-tag birleştirilmesiyle yeniden birleştirici proteinlerin saflaştırılmasını sağlayan bir yüksek verimli ve düşük maliyetli, küçük ölçekli protein saflaştırma yöntemi göstermektedir. 

Video: GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, particle size and shape, and surface-to-volume ratio of macromolecules. The technique is applicable to a very wide variety of solution conditions spanning a broad range of concentrations, pH values, ionic strengths, temperatures, additives, etc., but the sample is required to be monodisperse. This caveat led to the implementation of liquid chromatography systems on SAXS beamlines. Here, we describe the upstream integration of size-exclusion (SEC) and ion-exchange chromatography (IEC) on a beamline, different methods for optimal background subtraction, and data reduction. As an example, we describe how we use SEC- and IEC-SAXS on a fragment of the essential vaccinia virus protein D5, consisting of a D5N helicase domain. We determine its overall shape and molecular weight, showing the hexameric structure of the protein.

The determination of the solution structure of a protein by small angle X-ray scattering (SAXS) requires monodisperse samples. Here, we present two possibilities to ensure minimal delays between sample preparation and data acquisition: online size-exclusion chromatography (SEC) and online ion-exchange chromatography (IEC).

Bir SAXS beamline Online Boyut dışlama ve İyon değişim Kromatografi

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Biyokimya

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, the calcium (Ca2+)-permeable cation channel, transient receptor potential (TRP), binds tightly to the scaffold protein, inactivation-no-after-potential D (INAD), and forms a large signaling protein complex with eye-specific protein kinase C (ePKC) and phospholipase C&#946;/No receptor potential A (PLC&#946;/NORPA). However, the biochemical properties of the Drosophila TRP channel remain unclear. Based on the assembling mechanism of INAD protein complex, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous TRP channel. First, the purified histidine (His)-tagged NORPA 863-1095 fragment was bound to Ni-beads and used as bait to pull down the endogenous INAD protein complex from Drosophila head homogenates. Then, excessive purified glutathione S-transferase (GST)-tagged TRP 1261-1275 fragment was added to the Ni-beads to compete with the TRP channel. Finally, the TRP channel in the supernatant was separated from the excessive TRP 1261-1275 peptide by size-exclusion chromatography. This method makes it possible to study the gating mechanism of the Drosophila TRP channel from both biochemical and structural angles. The electrophysiology properties of purified Drosophila TRP channels can also be measured in the future.

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Based on the assembling mechanism of the INAD protein complex, in this protocol, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous Drosophila TRP channel.

Endojen Drosophila Geçici Reseptör Potansiyel Kanallarının Saflaştırılması

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

Çözünen Taşıyıcı Taşıyıcıların İfade Edilmesi ve Saflaştırılması için Stratejiler

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

Yazar Spotlight: Kodon İçin Optimize Edilmiş Genler Kullanılarak İnsan Çözünen Taşıyıcı Taşıyıcılarının İfadesi ve Saflaştırılması 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Hsp104 saflaştırılması, Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Biyoloji

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bir SAXS beamline Online Boyut dışlama ve İyon değişim Kromatografi

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

Endojen Drosophila Geçici Reseptör Potansiyel Kanallarının Saflaştırılması

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Hsp104 saflaştırılması, Protein Disaggregase

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma