Наша цель состоит в том, чтобы выделить конкретные подгруппы ЯК-МСК человека и проанализировать их основные характеристики в соответствии с их одноклеточными транскриптомными факторами. Мы пытаемся ответить на вопрос, какие признаки и функции являются отличительными для различных субпопуляций UC-MSC. Самыми последними разработками в нашей области являются открытие гетерогенности смешанных популяций МСК, в основном с помощью секвенирования РНК одиночных клеток.
Мы идентифицировали три субпопуляции в ЯК-МСК человека, включая клетки с высоким уровнем MFGE8 BAMBI. Эта подгруппа демонстрирует отчетливый фенотип, уникальный транскриптомный профиль, ограниченный адипогенный потенциал и сниженную иммуносупрессивную активность при волчаночном нефрите. Эти результаты углубляют понимание ЯК-МСК и помогают выбрать оптимальные подгруппы для лечения конкретных заболеваний.
Мы прокладываем путь к пониманию реальных функций не только BAMBI MFGE8 и ЯК-МСК, но и двух других подгрупп, особенно их роли в лечении различных заболеваний. Мы продолжим уделять особое внимание началу применения подгрупп ЯК-МСК человека для лечения множественных иммуноопосредованных заболеваний и изучению их молекулярных механизмов в лечении этих заболеваний. Чтобы выделить BAMBI с высоким MFGE8 высоким UC-MSCs, культивируйте UC-MSC с плотностью примерно от 5 до 10 умножить на 10 в степени 6 клеток в полном DMEM.
Добавьте 0,5 миллимоляра ЭДТА на пять минут для диссоциации клеток. Затем добавьте полный DMEM и переложите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Пипеткой вверх и вниз клеточной суспензии несколько раз, чтобы получить одноклеточную суспензию.
Возьмите 10 микролитров клеточной суспензии. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и рассчитайте общее количество собранных клеток. После подсчета центрифугируйте необходимое количество ячеек при 300 G в течение пяти минут.
Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре полной среды до достижения концентрации от 5 до 10 умножить на 10 в степени 6 клеток на миллилитр, и поместите трубку на лед. Далее разделите собранные клетки на четыре микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Добавьте первичные антитела в разведении 1:100 в пробирки MFGE8 и BAMBI.
Тщательно перемешайте содержимое и выдержите клетки при комнатной температуре в течение 15 минут. После инкубации добавьте PBS для промывания меченых клеток. Центрифугируйте пробирки при 300 G в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость перед тем, как снова суспендировать гранулу в одном миллилитре готовой среды.
Добавьте конъюгированные флуоресцентные вторичные антитела в разведении от 1 до 1000 к ресуспензионным клеткам. Тщательно перемешайте и выдержите трубки при комнатной температуре в темноте четыре минуты. После инкубации добавьте PBS и центрифугу для промывки меченых клеток.
Суспендируйте гранулы в 500 микролитрах готовой среды и отфильтруйте их через сетчатое фильтр с ячейками 70 микрометров, чтобы удалить комки и мусор. Переложите фильтрат в пробирку объемом 15 миллилитров для сортировки проточной цитометрией. Запустите пробирку с пустыми клетками в качестве отрицательного контроля без добавления антител.
Отрегулируйте параметры прямого и бокового рассеяния на проточном цитометре, чтобы установить шкалу стробирования для неокрашенной популяции. Затем запустите меченные одним антителом MFGE8 и BAMBI в качестве стробирующего контроля, чтобы определить, где начинается положительный результат на графике. Запустите пробирки с экспериментальными образцами, чтобы отсортировать популяцию клеток с высоким уровнем MFEG8 BAMBI и собрать отсортированные клетки.
Поместите отсортированные МСК в 24-луночный планшет и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. После того, как отсортированные клетки прошли через два прохода, проведите анализ проточной цитометрии, чтобы подтвердить чистоту отсортированной популяции. Культивируемые ЯК-МСК были сильно положительными в отношении экспрессии CD44, CD73, CD90 и CD105 и отрицательными в отношении экспрессии CD14, CD34, CD45, CD79 и HLA DR.
МСК с высоким уровнем MFEG8 BAMBI были отсортированы из культивируемых UC-MSC человека, и было подтверждено, что их повышенные уровни экспрессии BAMBI и MFEG8 сохраняются через три-четыре пассажа. Частота МСК с высоким уровнем MFEG8 BAMBI варьировала в зависимости от донора и метода диссоциации.
