Наш протокол важен, потому что он описывает поколение 3D-моделей опухолевых культур из первичных раковых клеток, и эта модель представляет реальную биологию опухоли лучше, чем клеточные линии. Этот подход применим к различным солидным опухолям. Это также экономически выгодно, так как может быть выполнено от начала до конца в типичной лаборатории клеточной биологии.
3D-модели опухолей, созданные с использованием этого подхода, поддерживают исследования чувствительности и резистентности опухолей к противораковой терапии или комбинации методов лечения. Этот подход генерирует 3D-модели из первичных раковых клеток. Таким образом, он может определить, какая терапия может быть эффективной для определенного пациента, и, таким образом, помочь персонализировать его или ее лечение.
Продемонстрировать процедуру будет Элла Ицхаки, аспирант из моей лаборатории. Для начала возьмите небольшую колбу T25 с одноклеточной адгезивной первичной клеточной культурой и удалите среду для клеточных культур. Промойте клетки PBS и добавьте один миллилитр 1x Accutase в течение трех минут при 37 градусах Цельсия, чтобы приготовить одноклеточную суспензию адгезивных первичных опухолевых клеточных культур с 75-100% слиянием.
Нейтрализуйте раствор Аккутазы, добавив пять миллилитров среды для культивирования клеток. Аспирируйте клетки с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров и поместите их в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте пробирку при 800 г в течение пяти минут при комнатной температуре.
Удалите среду для культивирования клеток и добавьте восемь миллилитров свежей среды для культивирования клеток поверх гранулы клеток, затем аккуратно перемешайте. Чтобы подсчитать жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра, возьмите аликвоту из 50 микролитров клеточной суспензии и смешайте ее с 50 микролитрами трипанового синего. Затем подсчитайте живые клетки и рассчитайте общее количество живых клеток в суспензии.
Далее подготовьте 3D-питательную среду. И после расчета количества клеток, необходимых для анализа, и общего требуемого объема, приготовьте клеточную суспензию с нужным количеством клеток в 200 микролитрах 3D-питательной среды. Аккуратно перемешайте пипеткой, чтобы обеспечить однородное распределение.
Перенесите суспензию в резервуар для пипетки, и добавьте по 200 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку сверхнизкой насадки 96-луночной пластины с многоканальной пипеткой. Центрифугируйте пластину при 300 г в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы усилить кластеризацию клеток, тем самым улучшая агрегацию клеток, и инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в 5%-ном инкубаторе, увлажненном углекислым газом. После повторного центрифугирования при 300 г в течение 10 минут при комнатной температуре осторожно удалите и выбросьте 50% среды и добавьте 100 микролитров свежей 3D-питательной среды, чтобы заменить существующий раствор.
Повторите этот шаг и поместите тарелку обратно в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% увлажненным углекислым газом. Осматривайте клетки под микроскопом каждые один-два дня, чтобы контролировать образование сфероидов. Измерьте диаметр сформированных сфероидов с помощью инструмента масштабирования в программном обеспечении для обработки изображений.
И как только диаметр сфероида достигнет 100-200 микрометров, проведите эксперименты по эффективности препарата. Для сбора сфероидов используйте пипетку объемом 1 000 микролитров, чтобы собрать сфероиды из каждой лунки и поместить их в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте коническую пробирку при 300 г в течение пяти минут при комнатной температуре, тщательно аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
Добавьте 0,5 миллилитра среды для культивирования клеток и хорошо и осторожно ресуспендируйте гранулу. Чтобы выполнить подсчет сфероидов, используйте табличку с 96 лунками и нарисуйте знак плюса на нижней стороне лунки, чтобы разделить скважину на квадранты. Добавьте в лунку 50 микролитров суспензии.
А с 10-кратным объективом подсчитайте сфероиды вручную под микроскопом. Подсчитайте сфероиды в каждом квадранте и рассчитайте общее количество сфероидов в лунке. Затем рассчитайте концентрацию сфероидов, удвоив количество сфероидов, подсчитав объем, и рассчитайте общее количество сфероидов во взвешенной суспензии.
В новой пробирке готовят сфероидную суспензию в концентрации 200 сфероидов на 200 микролитров питательной среды клеток. Для каждого медикаментозного лечения подготовьте запас сфероидов в разной пробирке. Рассчитайте общее количество, необходимое для каждого препарата, по количеству лунок, необходимых для повторов, и добавьте лекарство в пробирку до конечной необходимой концентрации.
Перенесите 200 микролитров сфероидной суспензии в лунки 96-луночной пластины со сверхнизкой насадкой и инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия в 5%-ном инкубаторе, увлажненном углекислым газом. После инкубации сфероидов с исследуемым препаратом в течение 24-72 часов центрифугируют пластину при 300 г в течение пяти минут при комнатной температуре и осторожно удаляют 170 микролитров среды для культивирования клеток, оставляя 30 микролитров на дне лунки. Приготовьте раствор МТТ и добавьте 70 микролитров раствора в каждую лунку до конечного объема 100 микролитров на лунку.
Конечная концентрация МТТ в лунке составит 0,05 миллиграмма на 100 микролитров. Кроме того, подготовьте заготовки с раствором МТТ без ячеек. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в 5%-ном инкубаторе, увлажненном углекислым газом, в течение трех-четырех часов, пока не будет наблюдаться изменение цвета раствора в лунках.
При наблюдении изменения добавьте в каждую лунку по 100 микролитров раствора Стопа, и аккуратно перемешайте содержимое лунок, не создавая пузырьков. Считайте поглощение пластины в считывателе параметров ИФА на длине волны 570 нанометров и фоновой длине волны от 630 до 690 нанометров. Чтобы рассчитать жизнеспособность клеток, рассчитайте конкретный сигнал для каждой скважины.
Затем вычислите среднее значение пустых скважин и вычтите это значение из каждой скважины. Рассчитайте среднее значение специфических сигналов в контрольных лунках, содержащих клетки, которые не были обработаны исследуемым препаратом. Наконец, рассчитайте жизнеспособность клеток в каждой лунке относительно лунок с необработанными клетками.
Здесь показано образование сфероидов из первичной культуры клеток рака толстой кишки с течением времени по количеству первоначально засеянных клеток. Из этого рисунка видно, что количество генерируемых сфероидов зависит от количества клеток, изначально засеянных в каждую лунку. Здесь показаны сфероиды из клеток первичного рака толстой кишки после 10 дней в культуре с начальным засевом клеток 2 000 на лунку.
При длительном культивировании сфероидов рака толстой кишки они начали прикрепляться друг к другу и образовывали скопления сфероидов и виноградоподобных структур, которые препятствовали однородной культуре и, таким образом, запрещали использование сфероидов в анализах МТТ. Показано влияние палбоциклиба, сунитиниба и их комбинации на сфероиды из первичных опухолевых клеток, включая рак толстой кишки и молочной железы. Анализ МТТ был проведен на сфероидах, полученных из клеток рака толстой кишки и молочной железы.
Сигналы МТТ были нормализованы до значений клеток, обработанных ДМСО. Значения представляют собой среднее значение от четырех до восьми реплик. Влияние различных методов лечения на рост клеток также оценивалось микроскопически на нулевой день и после трех дней лечения сфероидов, полученных из клеток рака толстой кишки и рака молочной железы.
На этом рисунке представлено влияние трастузумаба плюс винорелбин и 5-фторурацила плюс цисплатин на сфероиды, полученные при раке молочной железы с течением времени. Здесь показано изменение диаметра сфероидов относительно нулевого дня по продолжительности лечения. Каждая группа лечения включала от четырех до шести лунок с одним сфероидом в каждой лунке.
Среднее изменение представлено здесь. Сфероиды являются важными инструментами для многих исследований, помимо ответа на противораковое лечение. Эти исследования касаются, например, доставки лекарств и даже основных вопросов биологии, таких как межклеточные взаимодействия.
Очень важно начать процесс генерации сфероидов с одноклеточной суспензии. Также крайне важно использовать пластины со сверхнизким креплением со средой, содержащей 5%-ную базовую мембрану.
