Это первый оптимизированный протокол для выделения высококачественных ядер для экспериментов по секвенированию одноядер с использованием замороженного мозга африканской бирюзовой рыбы-убийцы, новой модели позвоночных для исследований старения. Этот протокол очень мягко изолирует ядра, что отличает его от более жестких протоколов, оптимизированных для других организмов с более миелинизированным мозгом, что приводит к деградации ядер при использовании в киллифиш. Этот метод будет играть важную роль в том, чтобы помочь нам понять старение мозга на уровне одной клетки.
Он должен хорошо транслироваться в другие ткани, требующие более мягкой изоляции ядер. Этот протокол удобен для пользователя. Самой сложной задачей является градиентное центрифугирование для удаления мусора, при котором лучше быть медленным и точным, чем быстрым и грязным.
Демонстрировать процедуру будут Ари Адлер и Брайан Тифи, техник исследовательской лаборатории и постдокторант из лаборатории Бенаюн. После вскрытия киллифиша разморозьте замороженную ткань мозга на льду в течение 10 минут и обработайте мозг в одном миллилитре ледяного буфера лизиса ядер в двухмиллилитровом гомогенизаторе. Во время лизирования образца держите гомогенизатор на льду и избегайте образования пузырьков.
Нарежьте ткань, как описано в рукописи, и дайте образцу отдохнуть на льду в гомогенизаторе в течение двух минут. Затем процедите образец через 70-микрометровый клеточный фильтр в 15-миллилитровую коническую трубку, предварительно покрытую 5% BSA. Добавьте четыре миллилитра буфера промывки ядер в образец, пипетируя буфер промывки над 70-микрометровым клеточным фильтром, и перемешайте, осторожно перевернув трубку пять раз.
Используя качающийся ротор ковша, центрифугируйте образец при 500 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте супернатант, осторожно налив его в емкость для жидких отходов. Держите образец в вертикальном положении и извлеките оставшийся буфер промывки с помощью пипетки P1000.
Немедленно повторно суспендируют ядра в одном миллилитре промывочного буфера ядер с широким отверстием пипетки P1000. Затем доведите образец до пяти миллилитров, добавив четыре миллилитра ядер промывного буфера и перемешайте, как было продемонстрировано ранее. Гранулируйте ячейку центрифугированием.
Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте ядра в одном миллилитре буфера промывки ядер с широким наконечником пипетки. Теперь перенесите ядра в проточную цитометрическую трубку. Добавьте 300 микролитров раствора для удаления мусора в клеточную суспензию и тщательно перемешайте ее, пипетируя широким наконечником отверстия, пока смесь не станет однородной.
Держите трубку под небольшим углом и аккуратно наложите один миллилитр буфера промывки ядер поверх раствора ядер с помощью пипетки P1000. Центрифугируйте образец в качающемся роторе ковша при 3000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Полностью откажитесь от двух верхних фаз с помощью пипетки P1000.
Переложите нижний слой в 15-миллилитровую коническую трубку, предварительно покрытую 5% BSA. Затем доведите объем до 15 миллилитров с буфером промывки ядер и перемешайте, трижды перевернув трубку. Центрифугируйте трубку при 1000G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия в качающемся роторе ковша.
Осторожно удалите супернатант и немедленно повторно суспендируйте гранулу в 150 микролитрах буфера промывки ядер с помощью широкого наконечника пипетки. Переключитесь на стандартный наконечник пипетки с отверстием, установленный на 300 микролитров. Пипетка всего образца, а затем прикрепите 40-микрометровый фильтр на наконечнике к концу наконечника пипетки.
Отфильтруйте образец, принудительно вытеснив образец через фильтр в низко связывающую ДНК 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку. В трубке FACS повторно суспендировать 10 микролитров отфильтрованного образца ядер в 90 микролитрах рекомендуемого буфера проточной цитометрии. Окрашивают образцы йодидом пропидия в конечной концентрации один микрограмм на миллилитр.
После настройки рабочей области, как описано в рукописи, запустите поток, нажав значок воспроизведения в правом нижнем углу. Проверьте наличие пузырьков или сгустков воздуха в образце, используя область бокового рассеяния по сравнению с HDRT. Кроме того, проверьте боковой точечный и прямой точечный график, чтобы убедиться, что события накапливаются в пределах окна.
Для увеличения изображения дважды щелкните боковую область рассеяния по сравнению с графиком PerCP-Vio700-A. Нажмите кнопку на верхней левой панели инструментов с перпендикулярной линией, чтобы выбрать ворота квадранта. Затем щелкните в любом месте боковой области рассеяния по сравнению с графиком PerCP-Vio700-A, и квадранты появятся внутри графика.
Щелкните в любом месте разделительных линий квадранта и проведите курсором, чтобы изменить расположение квадранта. Расположите квадранты так, чтобы верхний левый квадрант содержал мусор, а верхний правый квадрант содержал ядра. Нажмите на квадратный, серый, значок I, чтобы открыть окно свойств.
Перейдите на вкладку функции региона и установите зеленую галочку рядом с верхним элементом, указывая, что выбран весь участок. Под списком функций нажмите на количество на микролитр, чтобы создать зеленую галочку. Нажмите кнопку ОК, и в каждом квадранте будет отображаться количество на микролитр метрики.
Выберите Количество и процент всего на вкладке функций региона, чтобы при необходимости просмотреть необработанные подсчеты и проценты. Нарисуйте полигональные ворота вокруг этой популяции, нажав кнопку полигона на верхней левой панели инструментов. Затем щелкните один раз и проведите мышью, чтобы нарисовать линейный сегмент ворот.
Нажмите еще раз, чтобы закончить и начать следующий, а затем двойной щелчок, чтобы закончить ворота. Щелкните границу ворот и проведите мышью, чтобы изменить положение ворот. Щелкните вершины ворот, чтобы изменить форму, и отобразится счетчики на микролитр закрытой популяции.
Здоровые ядра, появившиеся в виде синглетных ядер с интактными мембранами, подходят для последующего анализа. Однако нездоровые ядра характеризуются поврежденными ядерными мембранами, что приводит к слипанию ядер и может способствовать фоновым сигналам в последующих приложениях. Ядра находятся в синглетной и мультиплетной формах в правом верхнем квадранте, с синглетами в качестве нижнего облака событий, за которым следуют дублеты и триплеты в порядке возрастания.
Обломки отмечены событиями в двух крайних левых квадрантах в низкокачественной подготовке ядер, где этап удаления мусора был опущен. Мусор составляет более 40% событий. Однако в качественном эксперименте мусор составляет менее 15% всех событий.
Крайне важно полностью удалить средний слой после стадии центрифугирования удаления мусора для уменьшения загрязняющих фоновых Ядер РНК, выделенных с использованием этого протокола, которые могут быть использованы для секвенирования одноядерной РНК или секвенирования ATAC для получения транскриптомной и эпигенетической информации на уровне одной клетки. Этот метод позволит исследователям исследовать регуляцию генов мозга на уровне одной клетки у африканской бирюзовой киллифиш, естественно недолговечного модельного организма позвоночных для исследований старения.
