Наш протокол позволяет одновременно визуализировать динамику микроглии и активность нейронов у бодрствующих мышей. Он может быть широко применен для исследования наблюдательного поведения микроглии или взаимодействия с нейронами. Преимущество этого метода заключается в том, что артефакты движения не так легко загрязняют данные изображения из-за надежной фиксации головы.
Кроме того, восстановление после визуализации с высокой частотой кадров позволяет исключить артефакт движения из данных. В этом методе инъекция AAV и операция по имплантации черепного окна являются технически сложными. Неудачи являются обычным явлением в начале, поэтому, пожалуйста, не расстраивайтесь и больше тренируйтесь.
Чтобы подготовить инъекционный аппарат, поместите стеклянную пипетку, соединенную со шприцем Гамильтона 26-го калибра через трубку, на держатель пипетки стереотаксического инструмента. Затем наклоните держатель пипетки на 60 градусов вперед от вертикальной оси. Наполните стеклянную пипетку, шприц и соединительную трубку жидким парафином и поместите шприц на микроинжектор.
Введите анальгезию анестезированной мыши и прикрепите вспомогательные ушные планки. Затем зафиксируйте животное на стереотаксическом инструменте спинной стороной вверх. После удаления волос с места операции и дезинфекции операционной области сделайте двухсантиметровый разрез на коже головы по средней линии, обеспечив хорошее обнажение черепа над правой первичной зрительной корой.
Используйте щипцы, чтобы удалить надкостницу на обнаженном черепе. Просверлите череп по стереотаксическим координатам на три миллиметра сбоку от средней линии и на 5 миллилитров спереди от лямбда-линии, чтобы создать небольшое отверстие диаметром примерно 0,5 миллиметра. Затем поместите кусочек прозрачной пленки примерно два сантиметра на два сантиметра на открытый череп мыши.
Выдавите один микролитр капли раствора AAV на пленку с помощью пипетки. Продвиньте шприц. Поместите стеклянный наконечник пипетки в каплю раствора AAV на пленке и осторожно потяните шприц, чтобы аспирировать раствор AAV.
Далее вводят стеклянную пипетку на глубину 500 микрометров от поверхности мозга через отверстие, созданное в черепе. Затем введите 0,5 микролитра раствора AAV с помощью микроинжектора при объемном расходе впрыска два микролитра в час. Извлеките иглу и промойте поверхность мозга физиологическим раствором.
Создайте круглую канавку вдоль отметины на черепе с помощью сверления. Очистите мусор, чтобы обеспечить видимость черепа, и нанесите физиологический раствор, чтобы предотвратить нагрев во время сверления. Аккуратно прижмите центральный череп щипцами.
Глубина бурения достаточна, если он движется вертикально с небольшим сопротивлением. Когда бороздка достигнет достаточной глубины, вставьте кончик щипцов в нижнюю часть центрального фрагмента черепа. Осторожно поднимите и снимите его, чтобы обнажить поверхность мозга.
Используя иглу 27-го калибра, уколите и разорвите твердую мозговую оболочку на краю открытой поверхности мозга. Вставьте кончик щипцов через отверстие, сделанное на краю твердой мозговой оболочки, и снимите его, чтобы обнажить поверхность мозга. После диспергирования гемостатических волокон одно за другим в физиологическом растворе поместите гемостатические волокна вдоль краев отверстия, в котором присутствует пересеченная твердая мозговая оболочка.
Поместите черепное окно на открытую поверхность мозга, а затем приклейте его к черепу с помощью мгновенного клея, осторожно нажимая на окно. После этого нанесите мгновенный клей на весь обнаженный череп. Затем осторожно прикрепите головную пластину к черепу, чтобы найти черепное окно в центре квадратного отверстия головной пластины.
Как только клей достаточно затвердеет, нанесите стоматологический цемент на открытый череп, чтобы укрепить крепление между головой и лезвием головы. Чтобы установить изготовленное на заказ затеняющее устройство и ЖК-монитор для визуальной стимуляции, сначала расположите линзу так, чтобы она сфокусировалась на поверхности мозга, а затем установите это положение линзы в исходное положение Z. Сохраняйте координаты XY постоянными и поднимите линзу объектива.
Извлеките мышь и стереотаксический прибор из объектива. Прикрепите затеняющее устройство к верхней части головной пластины с помощью силикона, убедившись, что пространство между головной пластиной и затеняющим устройством хорошо закрыто. Залейте затеняющее устройство дистиллированной водой.
Затем зафиксируйте мышь стереотаксической рамкой под объективом. Аккуратно сбросьте фокальную плоскость на поверхности мозга, проверив глубину линзы объектива. Накройте линзу объектива черной алюминиевой фольгой, чтобы избежать светового загрязнения ЖК-монитора.
Установите 10-дюймовый ЖК-монитор на расстоянии 12,5 сантиметров перед глазами мыши, чтобы показывать визуальные стимулы. Настройте флуоресцентные фильтры сбора подачи для EGFP и R-CaMP и длину волны возбуждения до 1 000 нанометров. Получение изображений с пространственным разрешением 0,25 микрон на пиксель.
Найдите область визуализации, где R-CaMP-положительные нейроны и EGFP-положительная микроглия могут быть одновременно визуализированы. В слоях 2, 3. Получайте изображения с частотой кадров 30 Гц.
Одновременно с получением изображения подавайте мышь дрейфующие визуальные стимулы в 12 направлениях в шести ориентациях, от нуля до 150 градусов с шагом 30 градусов. После получения изображения извлеките мышь из предметного столика микроскопа. Отсоедините затеняющее устройство и стереотаксический инструмент от мыши и верните мышь в домашнюю клетку.
Используя этот протокол, инъекция AAV и имплантация черепного окна были выполнены в первичную зрительную кору восьминедельной трансгенной мыши, после чего были проведены две фотонные визуализации нейронной активности на основе R-CaMP и динамики микроглии в слоях 2, 3. Мышам были представлены визуальные стимулы решетки, а визуальные реакции в адендритном позвоночнике анализировались с использованием следов кальция. Микроглиальные процессы показали быструю динамику и изменили свою морфологию в течение 10 секунд.
Используя двухфотонную визуализацию в слоях 2, 3 первичной зрительной коры у 12-недельной трансгенной мыши, R-CaMP наблюдался в нейронах, наблюдаемых здесь в пурпурном цвете. EGFP наблюдался в микроглии, показанной зеленым цветом. Отдельные сигналы также наблюдались для EGFP и R-CaMP.
Успешная инъекция AAV имеет решающее значение для этого метода. Основными причинами неудачной инъекции AAV являются пипетки из часового стекла и повреждение тканей. Было установлено, что поведение наблюдения за микроглией и взаимодействие микроглии SNAP преобладают в различных патогенных механизмах, таких как болезнь Альцгеймера.
Наш метод полезен для исследований, ориентированных на эту область.
