Метод визуализирует и количественно оценивает способность раковых клеток расслаиваться и вторгаться, тем самым имея возможность оценить их метастатическую агрессивность до образования действия или метастазирования. Что оценка основана на процессе расслоения как предпосылке для образования метастазов, тем самым получая информацию о метастатической агрессивности клеток относительно быстрым, легким и дешевым способом. Сначала потренируйтесь с различными индивидуальными шагами, прежде чем начинать фактический эксперимент.
Анализ CAM-Delam включает в себя несколько технических шагов, которые трудно объяснить в письменной форме и гораздо легче оценить и изучить с помощью визуальной демонстрации. Для начала поместите нужное количество яиц в лотки для яиц и высиживайте яйца цыплят горизонтально в инкубаторе для яиц. Затем стерилизуйте 30 весовых лодок и 30 небольших пластиковых коробок с прозрачными колпачками, распыляя 70% этанола.
Затем высушите весовые лодки и коробки в ламинарной вытяжке на ночь и храните в закрытой пластиковой коробке до дальнейшего использования на третий день инкубации. Стерилизуйте два литра дистиллированной или деионизированной воды на 30 инкубированных яиц, две пары ножниц и три пары щипцов. Сначала добавьте примерно 50 миллилитров стерилизованной воды в стерилизованные пластиковые коробки и закройте крышки.
На третий день инкубации разбейте яичную скорлупу острой частью ножниц и вырежьте прямое отверстие в скорлупе. Открыв яичную скорлупу вручную над весовой лодкой, соберите яичный белок, желток, и к нему прикрепят здоровый эмбрион в весовую лодку. Затем ищите неповрежденный эмбрион с бьющимся сердцем, неповрежденным желтком и развитыми кровеносными сосудами для эксперимента.
Затем аккуратно перенесите весовую лодку во внутреннюю увлажненную камеру и инкубируйте внутреннюю увлажненную камеру в инкубаторе яиц. Для приготовления силиконовых колец вырежьте силиконовую трубку с внутренним и внешним диаметром четыре миллиметра и пять миллиметров соответственно толщиной примерно в один миллиметр, предпочтительно с помощью бумагореза. Затем переложите силиконовые кольца на небольшие стеклянные бутылки.
Накройте их металлической фольгой и стерилизуйте с помощью автоклава или аналогичного. Храните стерильные силиконовые кольца при комнатной температуре. Культивируйте интересующие линии раковых клеток в соответствующей культуральной среде в клеточной культуре.
Затем приготовьте один миллилитр коллагена RPMI mix и держите его на льду. Затем попробуйте раковые клетки, чтобы изолировать клетки, сначала удалив питательную среду клеток и промыв. Затем добавляют три миллилитра раствора трипсина на чашку для культивирования клеток диаметром 15 сантиметров и инкубируют в течение двух-трех минут в инкубаторе клеточной культуры до тех пор, пока клетки не отсоединятся.
С помощью настольного инвертированного микроскопа можно увидеть отсоединенные клетки. Затем инактивируют трипсин, добавляя пять миллилитров полной среды RPMI в каждую чашку для клеточной культуры и собирают клеточную суспензию из всех тарелок для клеточных культур в 50-миллилитровую трубку. Чтобы подсчитать раковые клетки, добавьте 10 микролитров клеточной суспензии к 10 микролитрам 0,4% трипан синего пятна.
После смешивания образца путем пипетирования вверх и вниз несколько раз загрузите 10 микролитров клеточной смеси на камеру в слайд образца в счетчике ячеек. Затем центрифугируйте правильную объемную суспензию клеточной культуры в 50-миллилитровой трубке в 500 раз G в течение пяти минут. После выброса супернатанта смешайте клеточную гранулу с одним миллилитром коллагеновой смеси RPMI.
После того, как клетки смешиваются с пипеткой в один миллилитр, держите подготовленную клеточную суспензию на льду. На 10-й день инкубации выньте из инкубатора внутренние увлажненные камеры с инкубированными яйцами без скорлупы. После открытия внутренней увлажненной камеры поместите до шести силиконовых колец на CAM с помощью стерилизованных щипцов.
После того, как суспензия раковых клеток смешана путем пипетирования, чтобы получить равномерное распределение раковых клеток, добавьте 20 микролитров подготовленной суспензии раковых клеток внутри силиконового кольца. Закрыв внутреннюю увлажненную камеру, поместите ее в инкубатор для яиц. Через 14 часов, 1,5 дня, 2,5 дня и 3,5 дня инкубации выньте примерно семь внутренних увлажненных камер, открывая их крышки по одной.
С помощью ножниц рассекните культивируемые раковые клетки, прикрепленные к CAM, разрезав за пределами силиконового кольца. Затем немедленно перенесите изолированный образец CAM-Delam с помощью щипцов на 4%-ный параформальдегид в 0,1-молярный фосфатный буфер в чашку Петри для фиксации ткани и держите на льду или при четырех градусах Цельсия в течение одного часа. Затем удалите 4% раствор параформальдегида и добавьте 30% сахарозы в 0,1 молярный фосфатный буфер в образцы CAM-Delam и уравновесьте при четырех градусах Цельсия в течение одного часа.
Под рассеченным микроскопом аккуратно снимите силиконовое кольцо с помощью щипцов. Затем вырежьте образец CAM-Delam в прямоугольной форме с раковыми клетками посередине с помощью ножниц. Затем переложите образцы CAM-Delam в замороженную среду в чашке Петри, чтобы удалить избыток сахарозы, а затем во встраиваемые формы в замороженную среду с парой щипцов.
Под рассеченным микроскопом поместите образец CAM-Delam в U-образной форме в вертикальной реакции во встраиваемых формах с помощью любого игольчатого инструмента и храните образцы CAM-Delam при 80 градусах Цельсия. Затем разделите замороженные образцы CAM-Delam на 10 микрометров на пяти-шести последовательных слайдах с помощью криосекции. Сначала сделайте линию гидрофобным маркером на горках, где заканчиваются участки, и дайте им высохнуть в течение нескольких минут.
Затем поместите слайды в увлажненную камеру и накройте секции примерно 200-500 микролитрами блокирующего раствора и инкубируйте в течение 15-30 минут. После выливания блокирующего раствора замените его 100-150 микролитрами первичного антитела, разбавленного в блокирующем растворе, и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Аналогично, после выливания раствора первичного антитела перенесите слайды в стеклянные кюветы и промывайте не менее трех раз в течение пяти минут каждый в TBST.
Затем удалите избыток TBST с слайда и из гидрофобной барьерной области мягкой бумажной салфеткой и накройте слайд 100-150 микролитрами подходящего вторичного флуоресцентного антитела, разбавленного в блокирующем растворе в сочетании с DAPI. Высиживать горку в темноте при комнатной температуре в течение одного часа. После выливания раствора вторичных антител переложите слайды на стеклянные кюветы и промывайте не менее трех раз в течение пяти минут каждый в TBST.
Затем удалите излишки TBST с слайда и из гидрофобной барьерной области мягкой бумажной салфеткой. Затем установите слайды, положив одну-две капли флуоресцентной монтажной среды на слайд, и осторожно поместите стеклянную крышку, избегая пузырьков воздуха. Сфотографируйте участки с помощью эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного цифровой камерой, предпочтительно с увеличением 10 X, и проанализируйте участки, используя следующие категории оценки CAM-Delam, как описано в рукописи.
Использование внутренних увлажненных камер значительно улучшило выживаемость эмбрионов цыплят с менее чем 50% до 90% на 10-й день инкубации и примерно с 15% до 80% на 13-й день инкубации. Результаты показывают, что способность раковых клеток разлагать базальную пластинку и вторгаться в мезенхиму может быть разделена на четыре категории, включая неповрежденную базальную пластинку без видимых изменений, измененную, но неповрежденную базальную пластинку, поврежденную базальную пластину без клеточной инвазии и поврежденную базальную пластинку с клеточной инвазией. Окрашивание антител против фактора фон Виллебранда показывает, что CAM также утолщался с увеличением образования кровеносных сосудов, когда раковые клетки вызывали измененную или поврежденную базальную пластинку.
Однако ни один из этих двух фенотипов не наблюдался, когда CAM был неповрежден. Клетки PC-3U индуцировали поврежденный ламинин через 1,5 дня с прозрачной инвазией через 2,5 дня. Напротив, клетки U251 индуцировали незначительные изменения ламинина только через 1,5-3,5 дня, но никогда не вызывали видимого повреждения ламинина.
После лечения хлоридом кобальта неметастатические раковые клетки U251 приобрели способность индуцировать расслоение и инвазивные клетки, которые подавлялись при сочетании с ингибитором MMP GM6001. Не повреждать КАМ кончиком пипетки при посеве раковых клеток, так как такое повреждение мембраны уничтожит показания анализа. Будущая возможность заключается в оптимизации метода CAM-Delam для определения метастатических свойств в клинических образцах опухолей, которые могут в будущем дополнить используемую сегодня стадию метастазирования опухолевого узла.
