Наш протокол проводит различие между областями, богатыми коллагеном, и областями, в которых отсутствует коллаген, в отделах печени. Таким образом, его можно использовать для более детального изучения процессов фиброгенеза. Основное преимущество методики заключается в использовании поляризационной микроскопии для локализации богатых коллагеном участков в отделах печени.
Наши протоколы могут дать отличное представление о развитии фиброза печени, а также могут быть приняты для других мягких тканей, таких как легкие, после определенных оптимизаций. Для начала удалите замороженные участки печени от минус 80 градусов по Цельсию, и разморозьте их при комнатной температуре в течение двух минут. Зафиксируйте участки ледяным холодным 4%-ным параформальдегидом в PBS в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия с последующей промывкой пять раз PBS.
После последней промывки протрите избыток PBS вокруг участка печени с помощью ткани и отметьте границу примерно два на четыре сантиметра вокруг раздела печени гидрофобной маркерной ручкой. Накройте образец PBS, затем загрузите образец на ступень AFM и накройте его головкой AFM. В программном обеспечении атомно-силовой микроскопии или AFM перейдите на вкладку настройки и отметьте галочку при автосохранении, чтобы автоматически сохранить все файлы.
Затем укажите имя файла и каталог для сохранения файлов измерений, перейдя на вкладку настройки и нажав на сохранение настроек. Подойдите к поверхности ткани с помощью консольного устройства AFM, включив лазер и нажав на клавишу подхода. После того, как подход будет завершен, втяните консольный наконечник, щелкнув по клавише втягивания один раз, которая втягивает консоль в верхний конец пьезодиапазона.
При необходимости перестройте детектор с помощью ручек на головке AFM. Выключите лазер. Подсказка теперь находится в центре внимания цели.
Затем наложите на оптическое поле микроскопа карты измерений AFM, щелкнув вкладку «Аксессуары» и выбрав прямую оптическую калибровку. В последующем окне щелкните далее, чтобы сделать серию изображений консольного сканера определенной области. Нажмите кнопку Далее еще раз, чтобы перейти к следующему окну.
На первом изображении нажмите на центр наконечника консольного устройства вручную, чтобы отобразить положение наконечника в программном обеспечении. Кругом, изображающим положение наконечника, можно манипулировать по размеру, указывая его радиус для повышения точности. Нажмите кнопку «Калибровка», чтобы автоматически определить положение кончика консольного наконечника на всех изображениях.
Подтвердите точность обнаружения наконечников, просмотрев изображения. Нажмите кнопку Далее, а затем завершите, чтобы завершить оптическое наложение. Затем переместите рабочую область, чтобы расположить богатую коллагеном область внутри зеленого поля, видимого на вкладке средства просмотра данных, используя поляризованное изображение.
Выберите область, богатую коллагеном, определив область под вкладкой сетки, а затем создав прямоугольник на вкладке средства просмотра данных, используя длительное нажатие левой кнопки мыши внутри указанного зеленого поля. Нажмите на подтверждение новой области сканирования, чтобы установить выбранную область в качестве области измерения. Задайте параметры цикла обратной связи.
Установите I на 50 герц и P на 0,001. Затем установите заданное значение в один нано Ньютон. Выберите относительное значение заданного значения в соответствии с механическими свойствами исследуемых материалов и жесткостью консольного аппарата.
Укажите только базовую линию, чтобы она правильно соответствовала кривым силы. Затем выберите длину консольного движения по оси Z в соответствии с топографией поверхности образца. Установите для движения Z постоянную продолжительность.
Установите время продления на одну секунду с задержками расширения и втягивания равными нулю. Установите частоту дискретизации на уровне 5 000 герц. Отметьте галочку перед замкнутым контуром Z, чтобы автоматически отрегулировать расстояние между образцом и консольным наконечником во время измерений.
Затем отключите моторизованное управление ступенью, сняв флажок кнопки включения. Включите лазер и подойдите к образцу с помощью кантилевера. Нажмите на начать сканирование, чтобы собрать кривые расстояния силы.
Анализируйте полученные данные с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом AtomicJ. Загрузите кривые силы в программу, щелкнув по значку кривых силы процесса и карт. Затем в помощнике по обработке добавьте карты для анализа, нажав на кнопку добавить.
После загрузки карт нажмите далее. Укажите параметры обработки в следующем окне. Для автоматической оценки точки контакта между образцом и консолью с помощью набора параметров кривой подгонки используйте автоматическую оценку точки контакта.
Определите точку контакта между консолью и образцом классическим методом сфокусированной сетки. Выбрать метод оценки в качестве модельно-независимого метода, чтобы получить наилучшее определение точки контакта на основе качества измеряемых кривых силы, которое необходимо эмпирически определить при оптимизации анализа данных. Подойдите к кривой отступа силы, используя классическую модель в качестве классической L two для подгонки модели.
Установите подгонку модели к кривой вывода. Установите коэффициент Пуассона равным 0,45, как рекомендуется для мягких тканей, таких как печень. Установите подгонку кривой, используя базовую степень три и степень контакта единицы.
Изменение степени подгонки полиномов на основе масштаба отклонений кривых от модели. Выберите модель, используемую для соответствия кривым вывода в качестве модели Снеддона. Заполните радиус сферического наконечника до 2,9 микрометров.
Загрузите константу пружины и invOLS из файлов данных, включив чтение, затем нажмите «Готово». После анализа данных пройдитесь по силовым кривым. Исключите силовые кривые, где консольно приблизилась к поверхности отдела печени неправильно.
Эти кривые имеют высокий уровень шума и аберрантные формы. После этого данные можно скопировать или экспортировать. В этом исследовании умеренно фиксированные участки печени, полученные от контрольных мышей и мышей с легким и прогрессирующим фиброзом, вызванным инъекцией тетрахлорметана, были исследованы с помощью AFM.
Области, близкие к центральным венам, соответствующие областям, где обычно образуются коллагеновые волокна у мышей с тетрахлорметаном, были проанализированы в контрольной печени. Распределение модулей Юнга было воспроизводимым в разных областях в контрольной печени и областях, богатых коллагеном, в пределах одного участка печени. У мышей, получавших тетрахлорметан, карты жесткости, соответствующие перицентральным областям коллагеновых отложений, показали значительно более высокие значения модулей Юнга по сравнению с эквивалентными областями у контрольных мышей.
Более того, наблюдалось значительное увеличение значений модулей Юнга при более длительном лечении. Также оценивалось влияние длительного хранения участков печени на механические свойства коллагеновых волокон. Измерения AFM показали значительно более низкие значения модулей Юнга в богатых коллагеном областях для участков, хранящихся в течение трех месяцев, по сравнению с теми, которые были получены в течение двух недель.
Время фиксации сечения печени во многом определяет механические свойства печеночного отдела. Мы рекомендуем строго соблюдать временные интервалы, указанные в протоколе. После определенных оптимизаций в протоколе данный метод может быть использован для любых мягких тканей, демонстрирующих значительное отложение коллагена, которое обнаруживается с помощью поляризационной микроскопии.
Данная методика предоставляет исследователям единый и удобный протокол для изучения механизма печени при здоровых и больных.
