Этот протокол позволяет изготавливать костные аналоги, не требуя нагрева или токсичных химических веществ. Таким образом, формируются костные структуры с потенциалом для восстановления костного дефекта в клинических условиях с использованием собственных клеток пациента. Основным преимуществом методики является то, что костные чернила могут быть напечатаны живыми клетками для формирования любой сложной костно-подобной структуры и для прямой дифференцировки в сторону костиобразующей линии.
Кроме того, лекарства могут быть загружены в костные чернила для одновременного улучшения заживления ран, регенерации костей и для лечения таких патологий, как рак. Демонстрировать процедуру будут Гаган Джаландхра, кандидат наук в моей лаборатории, и доктор Сара Романаццо, которая работала со мной и доктором Джаландхрой над различными проектами, включая разработку этой технологии. Начните с добавления смеси порошка гидрофосфата кальция и карбоната кальция в тигель циркония таким образом, чтобы он был заполнен не более чем на 75%.
Переложите тигель в печь, нагрейте его до 1 400 градусов Цельсия со скоростью пять градусов Цельсия в минуту и подержите три часа. Погасите реакцию, сняв тигель из печи и оставив на вершине огнеупорный блок. Дайте ему полностью остыть перед обработкой.
Используйте ступку и пестик, чтобы разбить и измельчить альфа-трикальцийфосфатный жмых таким образом, чтобы полученные гранулы имели максимальный размер 200 микрометров. Добавьте в измельченную смесь три миллиметровых стабилизированных циркониевых шарика, а затем 100% этанол. Закрепите крышку и измельчите в течение двух часов со скоростью 180 оборотов в минуту.
Соберите суспензию и отделите шарики, используя 100% этанол для промывки. Высушите суспензию в духовке при 120 градусах Цельсия в течение 24 часов. Добавьте высушенный порошок в банки для измельчения с одним миллиметром циркониевых шариков и 100% этанолом в тех же весовых соотношениях, что и на первом этапе.
Измельчайте в течение двух часов со скоростью 180 оборотов в минуту. Затем отделить и высушить в духовке. Достаньте образец из духовки.
Чтобы сделать костяные чернила, добавьте 630 микролитров глицерина и 130 микролитров полисорбата 80 в шаровую банку. Затем добавьте в раствор 100 миллиграммов двухосновного фосфата аммония и два грамма порошка альфа-трикальцийфосфата и непрерывно перемешайте шпателем, чтобы соединить. Добавьте 25-миллиметровый циркониевый шарик, закрепите крышку и поместите его внутрь планетарной мельницы на 60 минут со скоростью 180 оборотов в минуту, остановившись на полпути, чтобы соскрести по бокам банки шпателем с помощью шпателя.
Загрузите чернила в шприц на один миллилитр. Внесите 10%-ный раствор желатина типа А в 1X PBS, как описано в тексте рукописи. Поместите коническую колбу на мешалку.
Затем добавьте 5,796 миллилитров метакрилового ангидрида и продолжайте помешивать в темноте при 50 градусах Цельсия в течение 90 минут. Погасите реакцию, разбавляя содержимое конических колб в два раза PBS. Декантировать в 50 миллилитровые трубки и удалить непрореагировавший метакриловой ангидрид центрифугированием при 3000 RCF при комнатной температуре в течение трех минут и сбором супернатанта.
Диализуйте супернатант внутри 14 килодалтонов, отрезав целлюлозные диализные трубки против деионизированной воды при температуре 40 градусов Цельсия в течение пяти дней, осторожно перемешивая. Заменяйте деионизированную воду каждый день. Подготовьте к хранению, декантируя в 50-миллилитровые трубки, закрепляя колпачок и помещая его в холодильник на 12 часов.
Затем заморозьте образцы с использованием жидкого азота и немедленно лиофилизируйте в течение пяти дней при минус 54 градусах Цельсия и 0,4 миллибара. Храните полученную пену в морозильной камере при минус 20 градусах Цельсия. Чтобы синтезировать микрогели GelMA, сделайте 10% веса по весу раствор GelMA в PBS, взвесив лиофилизированный GelMA, добавив его в трубку с PBS и нагревая на водяной бане при 50 градусах Цельсия до полного увлажнения.
Добавьте в стакан 37 миллилитров масла на один миллилитр раствора GelMA, убедившись, что он заполнен не более чем на 65%. Установите систему двойного стакана на конфорке с магнитным перемешиванием, поместив стакан, содержащий масло, внутрь большего стакана. Нагревать до 40 градусов Цельсия при перемешивании.
Загрузите раствор GelMA в шприц и добавьте его по каплям в перемешивающее масло через фильтр 0,45 микрометра. Дайте эмульсии уравновеситься в течение 10 минут. Уменьшите температуру эмульсии до 15 градусов Цельсия до термической.
Стабилизируйте сферы, добавив измельченный лед в пространство между двумя стаканами. Добавьте ацетон в вращающуюся эмульсию GelMA. Декантируйте содержимое стакана в 50-миллилитровые трубки, обязательно промыв стенки стакана ацетоном.
Дайте ему отдохнуть в течение 20 минут, чтобы обезвоженные микрогели осели на дно. Откажитесь от супернатанта и дважды промойте микрогели ацетоном. Залейте в одну трубку, доливайте ацетоном и обрабатывайте ультразвуком в течение 10 секунд.
Опять же, дважды промыть его ацетоном. Хранить в ацетоне при комнатной температуре до тех пор, пока не потребуется печать. Чтобы подготовить микрогелевую суспензию GelMA к печати, сформулируйте 1% весовой раствор GelMA в DMEM, как описано в текстовой рукописи.
Испарите ацетон из обезвоженных микрогелей и взвесьте полученный порошок в пробирку. Добавляют ацетон и переносят в стерильную среду. Чтобы сформировать микрогелевую суспензию, испарите ацетон из порошка внутри шкафа биобезопасности.
После выпаривания добавляют DMEM, 1% раствор GelMA в DMEM и 2,5% раствор инициатора LAP для достижения окончательной фракции упаковки 30% Позволяет полностью гидратировать в течение не менее 12 часов при комнатной температуре. Культивируйте мезенхимальные стволовые клетки жирового происхождения в ДМЭМ с низким содержанием глюкозы, дополненные 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа до слияния. Удалите мезенхимальные стволовые клетки жирового происхождения из колбы культуры тканей, удалив среду и промыв стерильным PBS.
Гранулируйте ячейки центрифугированием при 150 RCF при комнатной температуре в течение пяти минут. Подсчитайте клетки и рассчитайте, по крайней мере, от 5 х 10 до пяти клеток на каждый миллилитр микрогелей GelMA. Выделите необходимый объем клеточной суспензии в отдельную трубку и гранулу, как показано ранее.
Осторожно удалите как можно больше супернатанта с помощью пипетки, оставив только ячейку гранулы. Добавьте необходимый объем микрогелевой суспензии в гранулу и аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение. Загрузите ячейку, нагруженную микрогелевой суспензией, в реактор с помощью пипетки.
Используя один миллилитр шприц, оснащенный иглой 23 калибра, нанесите костные чернила, сшивите клетку и нагруженный костями микрогель GelMA с помощью ультрафиолетовой сшивающей лампы на 405 нанометров в течение 90 секунд. Немедленно переложите микрогелевую суспензию на пластину подходящего размера, содержащую полный DMEM. Инкубировать при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
Замените питательную среду через 24 часа, затем каждые 48-72 часа по мере необходимости. Костяные чернила были проанализированы методом сканирующей электронной микроскопии для определения их микроструктуры, которая показала образование кристалла гидроксиапатита после схватывания чернил, особенно заметного в сухих условиях. В этом исследовании клетки смешивали с микрогелями GelMA и держали в культуре до пяти дней, либо только в суспензии микрогеля, либо в системе COBICS.
Клетки показали хорошую жизнеспособность в присутствии костных чернил, как в первый, так и в пятый день, подтверждая, что продукты выщелачивания чернил не наносят вреда клеткам. Крайне важно контролировать скорость перемешивания при синтезе микрогеля, так как небольшие изменения перемешивания могут вызвать различия в размерах. Также важно обеспечить однородное распределение клеток внутри микрогелевой суспензии.
Тот же протокол может быть использован для печати внутри желатиновых микрогелевых суспензий, которые действуют как жертвенные опоры, оставляя после себя автономные костные конструкции. Но использование GelMA открывает путь для многофазных конструкций одного горшка, таких как остеохондральные или костные сухожильные интерфейсы.
