С помощью этого протокола мы представили первый метод, способный одновременно профилировать несколько модификаций РНК в отдельных нейронах, открывая новые области исследования, включающие посттранскрипционную регуляцию в отдельных клетках. Используя оптимизированные условия пробоподготовки и тандемную масс-спектрометрию жидкостной хроматографии, более десятка модифицированных нуклеозидов могут быть обнаружены и количественно определены в одном нейроне за эксперимент. Отдельные клетки различны с точки зрения их функций, морфологии и их химических профилей.
Важно, чтобы мы могли измерить полную химическую мозаику этих клеток, включая их профили РНК, чтобы достаточное количество клеток могло понять их различия, как в здоровье, так и в болезни. Степень подготовки ганглиев до выделения одного нейрона зависит от предпочтений человека, выполняющего изоляцию. Попробуйте как более длительные, так и более короткие процедуры протеазы, чтобы определить подходящие условия.
Для начала поместите анестезируемую Aplysia californica вентральной стороной вверх в рассекающий лоток. Начните рассекать его хирургическими ножницами одним тупым кончиком, расположенным по направлению к животному и аккуратно сделав продольный разрез через ногу. После закрепления ростральной, каудальной и боковой сторон тела животного, чтобы обнажить внутренние органы и ганглии центральной нервной системы в полости тела, изолируйте основные ганглии центральной нервной системы от животного путем хирургического разрыва нервов и некоторых соединительных соединений, происходящих из ганглиев.
Погрузить ганглии в 10 миллиграммов на миллилитр протеазы XIV типа раствор из Streptomyces griseus и инкубировать от 30 минут до одного часа при 34 градусах Цельсия. Далее промыть ганглии шесть раз искусственным раствором антибиотика морской воды. Затем, используя полипропиленовую переносную пипетку, которая была разрезана до отверстия в пять миллиметров, переложите все ганглии в силиконовую форму с полимерным покрытием, наполненную искусственным раствором антибиотика морской воды.
Держите ганглии всегда погруженными в искусственную морскую воду. Далее, чтобы снять ганглиозные оболочки, зафиксируйте ганглии и используйте микросубницы и тонкие щипцы. При достаточно сильной ферментативной обработке используют стеклянные или металлические иглы для снятия обшивки.
Визуально идентифицируйте интересующие нейроны. Используя объединенный стеклянный капилляр или острые вольфрамовые иглы, тщательно изолируйте идентифицированную клетку от объемного ганглия. После втягивания около одного микролитра искусственной морской воды в пластиковую микропипетку переместите изолированную клетку в пробирку для ПЦР, содержащую четыре микролитра 0,365 молярного ацетата аммония.
Для заготовок соберите пять микролитровых аликвот искусственного раствора антибиотика морской воды из чашки, содержащей ганглий, и смешайте с буфером пищеварения. Лизируют изолированные нейроны путем повторной аспирации и обхода микропипеткой в 0,365 молярного ацетата аммония. Некоторые клетки могут разрываться не сразу.
Чтобы лизировать их, приложите давление по всему диаметру клетки с помощью объединенного стеклянного капилляра. Затем нагревайте образец в тепловом цикле, прежде чем добавлять 3,375 микролитра буфера сбраживания РНК в образец. Смешайте этот раствор с помощью микропипетки, вынув и дозировав раствор несколько раз.
Открутите любые капли жидкости, цепляющиеся за стенки трубки ПЦР, с помощью миниатюрной центрифуги. Затем инкубируют образцы в тепловом цикле при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов, после чего следует удержание при 10 градусах Цельсия с нагретой крышкой, установленной на On.Как только образцы остынут, немедленно переложите семь микролитров раствора в флакон автосамплера, оснащенный вставкой на 250 микролитра без образования пузырьков в трубке автосамплера. Чтобы подготовить систему жидкостной хроматографии к разделению канонических и модифицированных нуклеозидов, уравновешивайте колонку C18 с использованием 99% подвижной фазы A и 1% подвижной фазы B со скоростью потока 0,2 миллилитра в минуту в течение 12 минут при 36 градусах Цельсия.
Работайте масс-спектрометрическим прибором в положительном режиме с отводным клапаном, настроенным на отходы в течение первых двух минут анализа и на источник в течение оставшейся части пробега. Затем соберите масс-спектры в диапазоне m/z от 110 до 600. Выбор ионов для диссоциации, вызванной столкновением, при 35-40 электрон-вольтах в течение трех секунд цикла, используя предпочтительный список масс, построенный из базы данных, и окно изоляции 0,5.
Используйте активное исключение, чтобы исключить ионы из фрагментации после трех спектров. Установите динамическое получение спектров MS/MS для ионов с интенсивностью выше и ниже 50 000 при четырех Гц и одном Герц соответственно. И минимальный порог для выбора ионов в 1 990 отсчетов.
Для количественного анализа модификации РНК одного нейрона методом масс-спектрометрии построить калибровочные кривые с использованием извлеченных пиковых областей ионной хроматограммы, полученных для модифицированных нуклеозидных стандартов как минимум в пяти концентрациях, чтобы обеспечить интерполяцию неизвестных эндогенных концентраций анализируемых веществ. Анализ модификации РНК одного нейрона методом масс-спектрометрии включает ручную изоляцию идентифицированных нейронов в небольшие объемы образцов для переваривания лизиса и анализа LC-MS / MS. Анализ модификации РНК одного нейрона методом масс-спектрометрии обычно обнаруживал более десятка модификаций РНК в отдельных нейронах центральной нервной системы Aplysia californica, что представляет собой покрытие почти половины известного эпитранскриптома этого животного в одной клетке.
Результаты впервые показали, что профили модификации РНК отдельных клеток могут отличаться от объемных клеток в одной и той же ткани. Дальнейшая поддержка уникальных модифицированных нуклеозидных паттернов была получена от отдельной когорты животных, у которых были выполнены парные сравнения для 13 модификаций РНК, обычно обнаруживаемых как в отдельных нейронах, так и в объемной ткани. Модификации РНК в функционально разных клетках образовывали уникальные кластеры на графике оценки, в то время как гомологичные нейроны R2/LPl1 сгруппировались.
График загрузки показывает, что различия были обусловлены главным образом обилием позиционных изомеров метиладенозина, включая 2'O-метиладенозин и N1-метиладенозин. Внешние калибровочные кривые были сгенерированы для N1-метиладенозина, псевдоуридина, 2'O-метилгуанозина, 2'O-метиладенозина и N6-диметиладенозина. А количество каждого модифицированного нуклеозида в метацеребральных клетках и парах клеток R2/LPl1 определяли путем интерполяции.
Убедитесь, что минимальный объем искусственной морской воды переносится в трубку ПЦР вместе с одним изолированным нейроном. Это сводит к минимуму разбавление образцов, что в конечном итоге влияет на обнаружение анализируемого вещества. Этот протокол может быть использован для исследования распределения модификаций РНК в субклеточных структурах, таких как аксоны и дендриты, для улучшения понимания механизмов зависящей от активности локальной трансляции.
