Этот метод позволяет исследователям систематически исследовать, как матричные сигналы влияют на фенотип клеток в 3D-культуре. Мы демонстрируем процедуру с использованием культур клеток GBM. Основным преимуществом данной методики является высокая пропускная способность реализации, которая позволяет экранировать множество матричных условий.
Этот метод может быть использован для разработки ткане-миметических матриц, которые сохраняют специфические функции в моделях клеточных культур, такие как лекарственная устойчивость опухолевых клеток, и потенциально идентифицируют новые терапевтические средства. Продемонстрировать процедуру будут Мэри Эпперсон и Келли Тамура, исследователи из лаборатории Seidlits. Начните с приготовления HEPES-буферного раствора, растворив порошок HEPES на 20-миллимоляре в сбалансированном растворе соли Хэнкса.
Отрегулируйте pH до семи после полной сорбации. В HEPES-буферном растворе растворяют тиолированную ГК таким образом, чтобы от 6 до 8% остатков карбоновой кислоты на каждой глюкуроновой кислоте модифицировали тиолом в концентрации 10 миллиграммов на миллилитр в буферном растворе. Перемешивайте со скоростью менее 1000 оборотов в минуту с помощью магнитной пластины перемешивания при комнатной температуре до полного растворения, обычно около 45 минут.
Пока ГК растворяется, готовят отдельные растворы по 100 миллиграммов на миллилитр норборнена ПЭГ 8 арм, 100 миллиграммов на миллилитр тиола ПЭГ 4 арм, четырехмиллимоляров цистеина или цистеинсодержащего пептида и четырех миллиграммов на миллилитр ЛАП в микроцентрифужных пробирках. Приготовьте четырехмиллимолярные растворы всех пептидов, которые будут привязаны к одному гидрогелю в этот момент. Смешайте отдельные растворы HA, PEG норборнена, ПЭГ-тиола и цистеин-тиолсодержащих пептидов для достижения конечных концентраций для конечных гидрогелевых матриц.
Перемешивайте со скоростью менее 1000 оборотов в минуту на магнитной пластине лестницы в течение не менее 30 минут, чтобы полностью перемешать. Выровняйте образцы с устройством освещения с любым другим светодиодом в одной колонне силиконовых форм или 384-луночной пластине. Откройте Параметры УФ-светодиода и введите значения интенсивности и освещенности.
Затем нажмите «Готово», чтобы начать освещение. После освещения, при размещении в одном углу, переместите плиту колодца в следующий угол и повторите. Чтобы осветить колодцы на другой половине пластины, поднимите пластину из держателя и поверните на 180 градусов.
Чтобы получить гидрогели с различной механикой, начните с очистки стеклянных слайдов и силиконовых форм с помощью ленты для удаления мусора. Прикрепите силиконовые формы к стеклянному слайду, прижмите вниз, чтобы обеспечить хорошее уплотнение, и вытесните любые пузырьки воздуха. Далее пипетка 80 микролитров раствора предшественника гидрогеля в каждую силиконовую форму на стеклянной горке.
Поместите стеклянный слайд на устройство освещения, выровненное с любым другим светодиодом в одной колонке. Подвергайте предшественников гидрогеля воздействию ультрафиолетового света в течение 15 секунд, чтобы сфотографировать перекрестную связь. Как только освещение прекратится, извлеките слайды и ослабьте гели из форм, проследив внутреннюю окружность формы тонким наконечником.
Удалите силиконовые формы пинцетом или щипцами. Заполните 12-луночную пластину двумя миллилитрами DPBS. Переместите сшитые гидрогели в отдельную пластину колодца, смачивая шпатель и осторожно отталкивая их от стеклянной горки.
Подготовьте нужные клетки в виде одноклеточного раствора. Соберите сфероиды глиобластомы, примерно 150 микрометров в диаметре, из культуры суспензии колбы Т-75 в 15-миллилитровую коническую трубку. Промойте колбу для культивирования пятью миллилитрами DPBS, чтобы удалить любые остаточные клетки и среды, и добавьте этот объем в коническую трубку.
Центрифугируйте коническую трубку, содержащую ячейки в 200 раз G, в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования удалите супернатант с помощью пятимиллилитровой серологической пипетки, заботясь о том, чтобы не нарушить клеточную гранулу и повторно суспендировать в пяти миллилитрах DPBS. Центрифуга в 200 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре для промывки клеток.
Аспирируйте супернатант пятимиллилитровой серологической пипеткой, следя за тем, чтобы не потревожить клеточную гранулу, а затем повторно суспендировать клетки в двух миллилитрах реагента диссоциации клеток. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10-15 минут. Добавьте три миллилитра полной среды и аккуратно пипетку три-пять раз, чтобы разбить сфероиды до одноклеточной суспензии.
Центрифугируйте одноэлементную суспензию в 400 раз G в течение пяти минут в грануляционные ячейки при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант пятимиллилитровой серологической пипеткой, заботясь о том, чтобы не потревожить клеточную гранулу. Повторное суспендирование клеток в одном миллилитре полной среды.
Удалите часть клеток для подсчета с помощью гемоцитометра. Разбавьте эту порцию в два раза трипан-синим, который пронизывает клетки с нарушенной жизнеспособностью. Подсчитывайте только живые, бесцветные клетки.
Определите количество клеток, необходимое для инкапсуляции. Перенесите объем среды, содержащей общее количество необходимых клеток, в стерильную 1,7-миллилитровую микроцентрифужную трубку. Открутите в 400 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре.
Аспирируйте супернатант с помощью микропипетки, заботясь о том, чтобы не потревожить клеточную гранулу. Повторно суспендируют клеточную гранулу в растворе предшественника гидрогеля, хорошо перемешивая путем пипетки вверх и вниз микропипеткой 1000 микролитров четыре-пять раз. Загрузите ячейки в повторный пипетку, чтобы дозировать 10 микролитров.
Чтобы избежать пузырьков и неравномерного дозирования, загрунтуйте повторный пипетку, дозировав еще один-два раза в контейнер для отходов. В каждую лунку из 384-луночной пластины дозируют 10 микролитров клеток, взвешенных в растворе гидрогеля из повторного пипетки. Используя светодиодную решетку, освещайте каждую скважину, содержащую ячейку, в течение 15 секунд для достижения желаемых механических свойств.
Добавьте 40 микролитров полной среды к каждой лунке, содержащей клетки. Добавьте 50 микролитров DPBS в неопытные сухие скважины, окружающие гели, чтобы свести к минимуму потери из-за испарения. Для клеток глиобластомы добавляют 40 микролитров препарата, содержащего среду, для достижения конечной желаемой концентрации, начиная с трех дней после инкапсуляции.
Добавьте 10 микролитров реагента CCK8 к каждой лунке, содержащей клетки. Инкубировать в течение одного-четырех часов, согласно инструкции производителя. Считывание поглощений на 450 нанометров для всех скважин после инкубации.
Опрос AFM микронных областей на поверхностях одиночных гидрогелей показал, что гидрогели с более мягкими средними модулями Юнга также имеют меньшие диапазоны модулей, чем более жесткие гидрогели. 3D-культуры клеток GS122, посеянных при плотности 2 500 000 клеток на миллилитр, продемонстрировали значительно более высокую жизнеспособность при оценке после семи дней в культуре по сравнению с культурой, посеянной при плотности 500 000 клеток на миллилитр. Клетки GS122 показали прирост выживаемости в состоянии восьми килопаскалей, когда пептиды, полученные из остеопонтина, были включены в матрицу, в то время как включение интегрин-связывающих сиалопротеина или пептидов, полученных из тенасцина С, обеспечило минимальные преимущества выживания, такие как культура и матрицы с пептидом имбиря RGD.
Напротив, ни один пептид не обеспечил прирост выживаемости в состоянии культуры 0,8 килопаскаля. Клетки GS122 и GS304 распространяются при культивировании в мягких или жестких гидрогелевых матрицах, включая RGD-содержащие пептиды. Клетки GS122 демонстрируют аналогичное отсутствие распространения как в 0,8, так и в 8 килопаскалях с остеопонтином.
Однако GS122 показал только повышенную устойчивость к темозоломиду в состоянии восьми килопаскалей. Наконец, эта миниатюрная платформа 3D-культур может быть использована для культивирования клеток человека из других типов опухолей, включая жизнеспособные органоиды терминально дифференцированных нейроэндокринных клеток рака предстательной железы. После этой процедуры дальнейшие методы, такие как секвенирование одноклеточной РНК, могут быть использованы для дальнейшей характеристики клеточных фенотипов.
