Ксенотрансплантат, полученный от пациентов с рыбками данио, является мощной доклинической моделью для прогнозирования профиля химиочувствительности онкологических больных in vivo. Протокол описывает генерацию модели, начиная с хирургического образца пациента. Ксенотрансплантируя небольшой фрагмент ткани, а не изолируя клетки в эмбрионы рыбок данио, можно поддерживать микроокружение опухоли, что является решающим шагом для прогрессирования опухоли и ответа на химиотерапию.
Большим преимуществом модели является ее способность предсказывать прогноз пациента в клинически значимые сроки всего за одну неделю, выступая в качестве инструмента для персонализированной медицины. Начните обработку образца с промывания всей опухолевой ткани, собранной у пациента, пятью миллилитрами свежей опухолевой среды. Проведите пипеткой вверх и вниз 10 раз с помощью пластиковой пипетки Пастера.
Тщательно аспирируйте и выбросьте моющее средство, прежде чем повторить стирку три раза. Погрузите образец в один-два миллилитра свежей опухолевой среды. Разрежьте образец опухоли на кусочки кубика размером от одного до двух миллиметров с помощью лезвия скальпеля, а затем поместите их в стерильную пятимиллилитровую пластиковую пробирку с опухолевой средой.
Установив измельчитель тканей McIlwain на толщину 100 микрометров, поместите кусочки опухоли на круглый пластиковый стол измельчителя и измельчите их. Поверните стол на 90 градусов и повторите измельчение. Соберите измельченные фрагменты опухоли в 15-миллилитровую пластиковую пробирку, содержащую опухолевую среду.
Центрифугируйте измельченные фрагменты опухоли в дозе 300 г в течение трех минут перед аспирацией и выбросом надосадочной жидкости. Инкубируйте фрагменты с раствором клеточного следа или с помощью альтернативного флуоресцентного трекера клеток, такого как CM-DiI или Deep Red, в течение 30 минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Во время инкубации аккуратно ресуспендируйте фрагменты каждые 10 минут.
В конце окрашивания удалите любой свободный краситель, добавив опухолевую среду, дополненную не менее 1% белка. Объем будет в пять раз превышать объем окрашивания. Центрифугируйте фрагменты при 300 г в течение трех минут и выбросьте надосадочную жидкость.
Добавьте один миллилитр фосфатного буферизованного физиологического раствора Dulbecco или DPBS и повторите этот этап промывки три раза. После этого суспендируйте фрагменты в пяти миллилитрах DPBS в 60-миллиметровой чашке Петри. Чтобы установить ксенотрансплантаты, полученные от пациентов, или zPDX, обезболивают эмбрионы через два дня после оплодотворения.
В чашке Петри, имеющей три агарозных цилиндра, положите эмбрион рыбки данио-рерио на цилиндр, обнажив одну сторону. Удалите излишки раствора, чтобы сохранить эмбрион в тонкой пленке. С помощью стерильных щипцов перенесите кусочек окрашенных фрагментов опухолевой ткани из 60-миллиметровой чашки Петри в 1%-ную агарозную подложку, где откладывается эмбрион.
Затем возьмите ткань и поместите ее на желток эмбриона, прежде чем протолкнуть ее в перивителлиновое пространство с помощью стеклянной микроиглы, вытянутой теплом. Добавьте несколько капель E3 1% пенициллинового стрептомицина в эмбрион, чтобы вернуть его в жидкость. После повторения имплантации опухолевой ткани всем эмбрионам извлеките агарозные подложки из чашки Петри и инкубируйте эмбрионы при 35 градусах Цельсия.
Через два часа после имплантации проверьте эмбрионы на наличие правильных ксенотрансплантатов с положительным окрашиванием с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. Отбрасывайте мертвые эмбрионы и эмбрионы без опухолевых фрагментов полностью внутри перивителлинового пространства. После этого случайным образом распределите эмбрионы по шести многолуночным планшетам, поровну разделенных на группы в соответствии с планом эксперимента.
Разбавьте препараты, смешав их с E3 1%-ным стрептококком, чтобы приготовить коктейль FOLFOXIRI. После двух часов имплантации удалите среду из каждой лунки и добавьте лекарственный коктейль. Поместите эмбрионы в инкубатор при температуре 35 градусов Цельсия на три дня с ежедневной сменой среды для обновления лекарств.
Для визуализации делайте снимки под 40-кратным объективом конфокального микроскопа. Используйте разрешение 1024 на 512 пикселей с шагом Z в пять микрометров. Все изображения zPDX, полученные для анализа апоптоза, обнаруженного в циано, показали, что комбинированная терапия увеличивала апоптоз клеток по сравнению с контрольной группой.
В тематическом исследовании сообщалось, что статистически значимое увеличение доли апоптотических клеток в имплантированных ксенотрансплантатах было выявлено в группе, получавшей FOLFOXIRI, по сравнению с контрольной группой. В протоколе показан пример с использованием ткани рака поджелудочной железы, но ксенотрансплантаты, полученные от пациентов данио-рерио, могут быть получены из разных типов рака. Кроме того, поскольку модель имеет низкое этическое воздействие, ее легко использовать для скрининга новых лекарств in vivo.
Этот метод является технически сложным и требует опытного оператора. Предыдущий опыт в манипулировании эмбрионами рыбок данио-рерио и микроинъекциях ускорит обучение этой технике.
