Это исследование описывает выделение внутрилегочной артерии крыс и клеток гладкой мускулатуры сосудов. Было использовано несколько экспериментальных протоколов, таких как использование техники органной ванны для исследования сосудистого ответа внутрилегочной артерии. Внутрилегочные артерии и гладкомышечные клетки сосудов являются отличными моделями для изучения сосудистой физиологии и патофизиологии.
Адаптация этого метода может оценивать сосудистые реакции любых лекарств, экстрактов или фитохимических веществ. Установка изолированного внутрилегочного артериального кольца в органной ванне позволяет использовать изолированные внутрилегочные артерии для оценки роли препарата в модуляции различных заболеваний, включая легочную гипертензию. Экспериментальные протоколы технически осуществимы, но важные шаги сложны и необходимы для успеха, поэтому наличие визуальной демонстрации облегчает понимание и следование.
Продемонстрировать процедуру будет Киттивут То-он, студент магистратуры по физиологии из лаборатории сердечно-сосудистых исследований, кафедры физиологии, факультета медицинских наук Университета Наресуан. Начните с разрезания одной доли легкого 11-сантиметровыми ножницами и размещения ее на девятисантиметровой чашке Петри медиальной стороной или корнем легкого, обращенным вверх. Наблюдайте и идентифицируйте выравнивание вены, бронхов и артерий сверху вниз.
Разрезать бронх продольно ножницами. Затем используйте 11-сантиметровые щипцы, чтобы захватить кончик бронха. Аккуратно рассекните и удалите бронхи и вены из легкого.
Используйте щипцы, чтобы схватить кончик внутрилегочной артерии и аккуратно рассекнуть ее из легочной ткани ножницами. Держите изолированную внутрилегочную артерию в холодном растворе Кребса до тех пор, пока не будет установлен органная ванна. После выделения внутрилегочной артерии продольно разрезают главную ветвь внутрилегочной артерии 11-сантиметровыми ножницами и разрезают на двухмиллиметровые полоски.
Погружайте полоски внутрилегочной артерии в СД, затем инкубируйте полоски в течение одного часа при четырех градусах Цельсия в СД, содержащие один миллиграмм на миллилитр папаина, 0,04% BSA и 0,4 миллимолярного DTT. Затем инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут. Добавьте один миллиграмм на миллилитр коллагеназы типа IA в СД и снова инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут.
Переведите ткани в свежий СД и диспергируйте путем мягкой тритурации с помощью стеклянной пипетки Пастера. Продолжайте тритурацию до тех пор, пока изолированные клетки гладкой мускулатуры сосудов не станут видны в растворе для купания под микроскопом. Изолируйте внутрилегочную артерию, как было показано ранее, и разрежьте основную ветвь внутрилегочной артерии на кольца длиной около двух миллиметров.
Прикрепите кольца внутрилегочной артерии в камерах органной ванны, нанизав их на две проволоки из нержавеющей стали диаметром 40 микрометров. Прикрепите провода из нержавеющей стали, установленные с внутрилегочными кольцами артерий, к изометрическим датчикам силы, подключенным к устройству сбора данных и компьютерной системе, установленной с подходящим физиологическим программным обеспечением для записи и анализа данных. Затем осторожно поднимите напряжение внутрилегочного кольца до одного грамма.
Дайте сегментам сосуда уравновеситься в течение примерно 45 минут при напряжении покоя в один грамм. В течение периода уравновешивания убедитесь, что раствор Кребса регулярно меняется каждые 15 минут. После уравновешивания проверьте жизнеспособность сосудов, измерив их сужение сосудов до высококлеточного внеклеточного раствора калия.
Оценить наличие или отсутствие эндотелия путем вычисления реакции релаксации на ацетилхолин в кольцах, предварительно связанных с ПЭ. Механически удалите эндотелий, осторожно протерев внутреннюю часть сосуда небольшой проволокой, чтобы вызвать денудацию. Затем уравновешивайте артериальные кольца за 30 минут до начала тестовых экспериментов. Исследуйте релаксирующий эффект растительного экстракта путем предварительного согласования внутрилегочных колец артерий с ПЭ. Затем осторожно добавьте от 0,1 до 1000 микрограммов на миллилитр растительного экстракта кумулятивно к неповрежденным кольцам эндотелия и кольцам с оголенью эндотелия, чтобы вызвать вазорелаксацию и получить зависимую от концентрации кривую ответа.
Обеспечить, чтобы эффективный ДМСО, используемый в качестве растворителя, также оценивался аналогичным образом, чтобы служить отрицательным контролем. Оценить вазорелаксантный механизм действия растительного экстракта, как указано в тексте рукописи. Затем после того, как схватки стабилизируют ПЭ, добавляют кумулятивные концентрации растительного экстракта.
Представить эффекты растительного экстракта в виде процентного расслабления внутрилегочных колец артерии в присутствии ингибиторов по сравнению с ответом внутрилегочных колец без ингибиторов и построить кривую реакции концентрации. В интактной внутрилегочной артерии эндотелия растительный экстракт вызывал концентрационно-зависимый ответ вазорелаксации. Эрадикация эндотелия глубоко уменьшала вазорелаксацию, вызванную растительным экстрактом, что отражалось в увеличении EC50 в 2,2 раза, ингибирование eNOS и EDHF, очевидно, уменьшало реакцию вазорелаксанта на растительный экстракт.
Это сместило кривую реакции концентрации вправо и увеличило EC50 без изменения максимальных значений E. Напротив, Индометацин не показал никакого влияния на реакцию вазорелаксанта на растительный экстракт. В эндотелийно-оголенных внутрилегочных кольцах артерий блокаторы калиевых каналов, активированные кальцием, уменьшали вазорелаксантную реакцию на растительный экстракт.
В то время как блокаторы силовых или АТФ-чувствительных калиевых каналов не показали отклонений. Преинкубация растительным экстрактом ингибировала сокращение, вызванное хлористым кальцием. Кольца внутрилегочной артерии с эндотелием, предварительно инкубированные безкальцевым раствором Кребса и ПЭ, оказывали преходящее сокращение.
По сравнению с транспортным средством, растительные экстракты значительно уменьшали сокращение, вызванное ПЭ. Во время процедуры необходимо четко определить вену, бронхи и артерии на ранней стадии. Разрезание или повреждение артерии уменьшит ее длину и повлияет на сосудистые реакции. Этот метод может быть адаптирован для исследования соединений, которые могут служить прототипами для лечения заболеваний легочных сосудов, таких как легочная артериальная гипертензия.
