Этот протокол использует новый подход отбора проб хориона из вылупившихся бабочек для генетического анализа. Это может быть особенно полезно, когда другие методы отбора проб тканей непрактичны, недоступны или не разрешены. Этот протокол имеет относительно низкую общую стоимость использования легко приобретаемых материалов и нацелен на остаточный органический материал, что устраняет необходимость временного захвата или манипулирования и потенциального вреда живым организмам для приобретения генетических образцов.
Общий протокол прост и прост в освоении, но требует ловкости и строгого внимания к деталям, в частности, для успешного обнаружения, идентификации и удаления очень маленьких целевых образцов, чтобы избежать перекрестного загрязнения между событиями сбора образцов. Начните с тщательного изучения и сбора полного списка необходимых принадлежностей, связанных с коллекцией. Если сбор проб происходит в нескольких местах или несколькими отдельными лицами или группами, соберите и организуйте все необходимые материалы в отдельные развертываемые подразделения.
Транспортировка материалов для общинных ученых или другого персонала, ответственного за сбор на местах. Если персонал не является местным, тщательно упакуйте расходные материалы в отдельную картонную транспортную коробку с полной транспортной этикеткой и отправьте их. После получения принадлежностей для сбора, включая ящик для сбора снастей, внимательно изучите список ламинированных поставок и проведите полную инвентаризацию.
Сообщите руководителю проекта, если какие-либо поставки отсутствуют. Предварительно засыпьте 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки 180 микролитрами лизисного буфера. Нанесите предварительно напечатанную уникальную идентификационную этикетку на каждую микроцентрифужную трубку и поместите все трубки в 64-луночную коробку для хранения микроцентрифужных трубок.
Надежно закрепите крышку после загрузки. Убедитесь, что все цифровое оборудование полностью заряжено, а все запасные батареи упакованы. Частично наполните небольшой охладитель льдом для полевого хранения и местной транспортировки собранных образцов.
Упакуйте все принадлежности для сбора в ящик для сбора снастей или аналогичный прочный атмосферостойкий контейнер для безопасной транспортировки и консолидированного хранения. Ознакомьтесь с протоколом сбора неразрушающих генетических образцов и подробными сведениями, прежде чем отправиться в поле. Прибыв на полевой участок, используйте карандаш или всепогодную ручку, чтобы записать время суток, дату, общее название объекта, конкретное название или описание местоположения полевого участка, показания GPS, если таковые имеются, а также полное имя и роли всех лиц, присутствующих в погодоустойчивом полевом блокноте.
Найдите подходящую среду обитания для присутствия личиночного растения-хозяина видоспецифической целевой бабочки. С помощью смартфона или камеры сделайте подробные фотографии всех полевых участков, мест сбора образцов, растений-хозяев и другой соответствующей информации. Используйте смартфоны или другие камеры, которые записывают GPS-координаты.
Всесторонне ищите все личиночные части растения-хозяина, такие как листья, цветочные почки, цветы или развивающиеся плоды, которые, как известно, были отобраны взрослыми бабочками-самками для вылупившихся яиц. Для большинства Lycaenidae ищите белые вылупившиеся яйца с отчетливым отверстием в центре, напоминающим пончик, из которого появилась новорожденная личинка. Ищите невылупившиеся яйца, которые имеют более темный цвет, часто зеленый или голубоватый, и будут полностью неповрежденными без отверстия посередине.
Как только вылупившееся яйцо будет найдено, наденьте нитриловые перчатки. Используя стерильные и заостренные щипцы, возьмите и осторожно вытащите вылупившееся яйцо с растения-хозяина и поместите его непосредственно в меченую микроцентрифужную трубку, предварительно заполненную буфером лизиса. Аналогичным образом, другие образцы тканей могут быть использованы и обработаны.
Убедитесь, что весь собранный материал полностью погружен в буфер лизиса в каждой 1,5-миллилитрной микроцентрифужной трубке. Коснитесь нижней части трубки на твердой поверхности, чтобы при необходимости повторно погрузить любые образцы. При сборе нового образца выбросьте использованные нитриловые перчатки и замените их чистой парой.
После каждого сбора яиц тщательно очищайте кончики щипцов, окунув или облив их во флакон с 95% этанолом из бутылки для выжимания или используя спиртовые салфетки. Соберите не менее пяти образцов на участок растения-хозяина на участке, каждый образец содержит от одного до 20 яиц, стремясь к более чем 50 яйцам в общей сложности в месте, если оно доступно. Соберите от одного до 20 инкубационных яиц с нескольких растений на одном участке хозяина в одну микроцентрифужную трубку и плотно закройте крышку.
Для видов бабочек, использующих более крупные травянистые или древесные виды-хозяева, соберите несколько яиц из разных мест на одном и том же растении, если участки хозяина ограничены. В записной книжке для защищенных от атмосферных воздействий запишите присвоенную уникальную идентификационную метку вместе с типом образца, приблизительным количеством инкубационных яиц и сведениями о сборе. Поместите закрытую микроцентрифужную трубку с образцом обломков яиц обратно в ящик для хранения микроцентрифуги с 64 скважинами.
Храните ящик для хранения в холодильнике со льдом, находясь в поле. Поместите все остальные принадлежности для сбора в ящик для сбора снастей для безопасного и консолидированного хранения и транспортировки между объектами. Из этих 160 образцов ДНК была успешно извлечена из 88 со средней концентрацией 1,67 нанограмма на микролитр, а самый высокий выход ДНК составил 26,8 нанограмма на микролитр.
Концентрации ДНК по типам тканей подтвердили, что образцы, содержащие один фрагмент яйца, имели только один случай яйца, а образцы, содержащие несколько случаев яиц, имели по крайней мере два случая с числом случаев от двух до 20, в среднем до 5,3 на образец. Материалы для сбора до 563 образцов были отправлены восьми природоохранным и общественным ученым из девяти штатов по всему ареалу видов в восточной части Северной Америки. Материалы были отправлены в течение трех месяцев в течение 2021 года до местного пикового времени полета.
В общей сложности было получено 160 образцов ткани calephelis iris. Крайне важно свести к минимуму перекрестное загрязнение между образцами, обеспечить полное погружение собранного образца в буфер лизиса и точно записать уникальную идентификационную этикетку и данные сбора для каждого образца. Этот протокол позволил широко развернуть и использовать ученых сообщества для неразрушающего отбора проб существующих популяций редкой бабочки, чтобы помочь провести широкий спектр анализа генетической структуры.
