Этот метод qRT-PCR может решать вопросы, связанные с профилированием экспрессии микроРНК в сыворотке крови мышей в таких состояниях, как возрастно-зависимая почечная недостаточность. Метод позволяет обнаруживать экспрессию микроРНК с высокой точностью и чувствительностью с помощью простого процесса, который экономит время и предотвращает техническую ошибку. Для начала прорежьте кожу живота с помощью пинцета и хирургических ножниц.
Разрежьте мышцы брюшины от мочевого пузыря до нижнего левого края ребер. Поднимите брюшинную оболочку с помощью пинцета, а также сделайте боковой разрез в верхнем крае хирургическими ножницами. Продолжайте разрез вдоль нижнего края ребер.
Определите нижнюю полую вену с помощью двух увлажненных PBS ватных тампонов. Вставьте иглу весом 30 г, прикрепленную к 1-миллилитровому шприцу, в нижнюю полую вену и потяните шприц. Медленно вытащите иглу, чтобы избежать гемолиза.
Переложите кровь в 1-миллилитрную шпицевую трубку с гепарином и перемешайте путем инвертирования. Центрифугируйте трубку шпица в течение 10 минут при 3000 G при комнатной температуре. Перенесите супернатант в свежую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку.
Возьмите 200 микролитров образца сыворотки и добавьте 1000 микролитров реагента лизиса на основе фенола / гуанидина. Вращайте смесь в течение 5 секунд и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут. Добавьте 200 микролитров хлороформа и перемешайте, перевернув трубку 15 раз.
Инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 3 минут с последующей центрифугированием. Не нарушая гранулу, перенесите супернатант в свежую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку. Добавьте 450 микролитров 100% этанола и вращайте трубку в течение 5 секунд.
Затем загрузите 700 микролитров образца на спиновую колонну с мембранным креплением и центрифугируйте ее. Отбросьте сквозной поток и добавьте 700 микролитров Wash Buffer 1, входящего в комплект. Снова центрифугируйте и отбросьте сквозной поток.
Повторите промывку с 500 микролитрами Wash Buffer 2, чтобы удалить следы солей. Добавьте 500 микролитров 80% этанола, центрифугу и выбросьте проточную трубу из коллекторной трубки. Снова центрифугируйте спиновую колонну и перенесите колонну в свежую 1,5-миллилитровую коллекторную трубку.
Затем добавьте 14 микролитров воды, не содержащей РНКазы, и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре. Снова вращайте колонку в течение 1 минуты при 15000 g при комнатной температуре. Приготовьте раствор для мастер-смеси и добавьте 8 микролитров на лунку в 8-луночную ленточную трубу.
Добавьте 12 микролитров извлеченной общей РНК в каждую трубку и центрифугируйте трубку в течение 15 секунд при 2000 G при комнатной температуре. Поместите трубку в термоциклер и начните инкубацию для синтеза кДНК. После инкубации переложите кДНК в свежую микроцентрифужную трубку.
Разбавить кДНК десятикратно дистиллированной водой. Затем вихрь с последующим центрифугированием в течение 5 секунд при 2000 раз G при комнатной температуре. В микроцентрифужной трубке приготовьте раствор мастер-микса, как описано в текстовом протоколе, и вихрь раствора.
Добавьте 22,5 микролитра аликвоты в каждую лунку 96-луночной пластины, а затем 2,5 микролитра кДНК. Запечатайте пластину с помощью клейкой пленки и центрифугируйте пластину в течение 30 секунд в 1000 раз G.Поместите пластину в систему ПЦР в режиме реального времени. Измените параметры, указав имя эксперимента.
Затем выберите 96-луночные 0,2 миллилитра в качестве типа эксперимента, сравнительную КТ в качестве метода количественного определения, стандартную в качестве режима работы системы и реагенты SYBR Green в качестве реагентов для обнаружения целевой последовательности. Укажите имена для образца и целевой микроРНК в каждой лунке. Назначьте дубликаты образцов, выберите эталонный образец и эндогенный элемент управления, а также не выберите ни одного для красителя для использования в качестве пассивного эталона.
Для устранения перекрестного загрязнения реагентов настройте отрицательную обратную транскриптазу и нешаблонный контроль экспрессии миРНК. Затем убедитесь, что объем реакции установлен на 20 микролитров, а условия цикла ПЦР установлены на уровне 95 градусов Цельсия в течение 15 минут, затем 40 циклов денатурации при 94 градусах Цельсия в течение 15 секунд, отжига при 55 градусах Цельсия в течение 30 секунд и продления при 70 градусах Цельсия в течение 30 секунд. После завершения процесса нажмите «Анализ», чтобы проанализировать данные qRT-PCR.
Убедитесь, что пороговая линия, автоматически выбранная программой, подходит для каждой скважины. Проверьте пороговое значение цикла эндогенного контроля и целевых микроРНК, проанализированных в каждом образце. Определите значения КТ по пересечению кривой усиления и пороговой линии.
Данные qRT-PCR miRNA для модели возрастной почечной недостаточности показали, что по сравнению с контрольными мышами SAMR1 уровень miRNA-7219-5p в почках значительно увеличился у экспериментальных мышей SAMP1, в то время как уровень miRNA-7218-5p в почках снизился. Уровни экспрессии miRNA-223-3p не изменялись ни у одного из штаммов. Сывороточные уровни как miRNA-7219-5p, так и miRNA-7218-5p были значительно увеличены у мышей SAMP1, в то время как уровни miRNA-223-3p были неизменными.
Следует ввести иглу в нижнюю полую вену и извлечь кровь, не проникая в сосуд. Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы в профилировании экспрессии микроРНК в сыворотке мышей для широкого спектра патологических состояний.
