Различные сегменты яйцеводов имеют различные физиологические функции и дифференциально подвержены патологическим изменениям. Идентификация различных сегментов в очень маленьком мышином яйцеводе является сложной задачей, как и получение хорошего выхода хорошо дифференцированных клеток путем диссоциации тканей. В этом видео мы продемонстрируем, как размотать яйцевод мыши, распознать различные сегменты, чтобы их можно было анализировать по отдельности, и, наконец, как получить относительно высокий выход дифференцированных диссоциированных клеток.
Лучшее понимание окружающей среды, специфичной для ампулы, может улучшить методы экстракорпорального оплодотворения. Кроме того, сравнивая инфундибулум с другими сегментами, мы можем лучше понять склонность инфундибулы к злокачественной трансформации. Процедура одноклеточной диссоциации высвобождает стромальные, а также эпителиальные клетки из яйцевода.
Наш метод также дает возможность отдельно анализировать вклад иммунных, гладкомышечных и эпителиальных клеток в физиологию и патологию яйцевода. Работа под рассеченным микроскопом поначалу может быть затруднена. Я бы посоветовал практиковать с большей трубкой, такой как матка, чтобы убедиться, что ваши инструменты адекватны для микродиссекции яйцевода.
Начните с прикрепления куска зубного воска к чашке Петри с помощью клея и дайте ему высохнуть. Затем продезинфицируйте блюдо 70% этанолом. Теперь поверхность готова к рассечению.
Обездвижите чашку Петри, содержащую зубной воск, на холодной платформе под рассеченным микроскопом, когда она будет готова к рассечению. Продезинфицируйте вентральную поверхность животного 70% этанолом. Затем вскрывают брюшную и тазовую полость стерильными рассеченными ножницами.
Переместите желудочно-кишечный тракт в одну сторону, чтобы найти дорсальную двурогую матку. Следуйте за каждым маточным рогом рострально, чтобы найти каждый яйцевод и яичник, которые окутаны жировой подушкой матки чуть ниже почки. Затем иссекайте оба боковых яйцевода с яичниками и часть дистального рога матки, все еще прикрепленную с помощью ножниц для рассечения.
Отрежьте каждый боковой рог матки примерно одним-двумя сантиметрами рога, все еще прикрепленными к спиральному яйцеводу и яичнику. Погрузите ткань сразу в два миллилитра холодной рассеченной среды, затем прикрепите ткань матки к стоматологическому воску стерильной иглой 25 калибра, чтобы закрепить ткань для рассечения. Очистите и рассекните жировую прокладку яичников и соединительную ткань, чтобы четко визуализировать яйцевод.
Используйте один миллилитр шприца, чтобы дозировать одну-две капли стерильного 1%-толуидинового синего раствора красителя и инкубировать в течение 30 секунд до одной минуты. Смойте холодным DPBS, а затем удалите всю жидкость. Слегка вытяните завязь из спирального яйцевода.
Разрезать на бурсальной мембране в широкой связке, чтобы удалить яичник из яйцевода без ущерба для трубной ткани. Найдите дистальный фимбриальный конец яйцевода, найденный латерально к маточному трубному соединению. Аккуратно потяните трубку и отрежьте мезосальпинкс пружинными микроножницами, чтобы размотать яйцевод.
Отрежьте трубку, чтобы получить инфундибулярную область. Затем иссекают ампуллярную область, разрезая между вторым и третьим оборотами. Наконец, отрежьте оставшуюся часть до маточных труб, которое является истмической областью.
Немедленно заморозьте рассеченные сегменты ткани в жидком азоте, а затем добавьте 200 микролитров реагента для экстракции холодной РНК и смесь шариков гомогенизации один к одному в ткань для выделения РНК. Начиная с краевой области, перерезайте трубку продольно пружинными ножницами и используйте щипцы в качестве рычага для обнажения просветного эпителия. Измельчите разрезанные участки и оставшийся яйцевод примерно на один-два миллиметровых сегмента.
Затем добавьте к ткани пять миллилитров теплого неферментативного диссоциативного буфера и высиживают при 37 градусах Цельсия. Здесь показаны флуоресцентные и фазово-контрастные изображения клеточного кластера, положительного на окклюдин, ядра и ацетилированный тубулин. Красный обозначает окклюдин, синий обозначает ядра, а зеленый обозначает ацетилированный тубулин.
Реснитчатая апикальная граница остается неповрежденной на протяжении всего протокола и выдерживает дальнейшее переваривание одиночных клеток. На этих репрезентативных изображениях показаны объединенные, красный, синий, фазовый контраст и зеленый каналы. После кратковременной проназной инкубации большинство клеток единичны.
Окрашивание йодидом пропидия показывает примерно 93% жизнеспособность в Brightfield, красный канал PI положительный и слияние. Вставка при слиянии показывает неповрежденную реснитчатую границу на одной диссоциированной клетке. Такие клетки имеют активно бьющиеся реснички.
Вся РНК оценивалась на выход и качество с помощью микрообъемного спектрофотометра и биоанализатора. Результаты показывают, что этот метод дает от 800 до 1 200 нанограмм РНК на сегмент, за исключением инфундибулярных образцов, где объединение двух животных может быть необходимо для соответствующего выхода для последующих анализов. Представленные результаты для инфундибулума объединены из двух животных, в общей сложности четыре инфундибулярных региона.
Этот протокол успешно достигает чистой РНК, проанализированной с помощью микрообъемного спектрофотометра и биоанализатора. Образцы имеют коэффициент поглощения 260 на 280 нанометров между 1,8 и 2, типичный для чистых видов нуклеотидов РНК. Биоанализ образцов показал высокую целостность РНК с оцененным числом целостности РНК выше семи, подходящим для последующей экспрессии и анализа секвенирования.
Не забудьте сохранить один-два сантиметра маточного рога, чтобы прикрепить трубную систему к платформе рассечения. Кроме того, использование красителя толуидинового синего помогает в быстром раскручивании яйцевода. Чем быстрее раскручивается, тем лучше сохранность и наименьшее количество деградации РНК.
Этот метод достаточен для получения РНК соответствующего качества для секвенирования РНК, что позволяет проводить секвенирование отдельных сегментов. Диссоциация клеток подходит для секвенирования одной клетки или проточной цитометрии, что позволяет проводить более точный анализ сегментов и клеток. Метод поможет вывести поле за пределы анализа всей трубки, который маскирует различия на уровне сегмента или одной клетки.
