Целью этой процедуры является сравнение стандартного устройства биопленки с крышкой колышка с полипропиленовым устройством глубокой биопленки с помощью кристаллического фиолетового окрашивания и тестирования чувствительности к противомикробным препаратам. Стандартное устройство для биопленки с колышковой крышкой имеет 96 колышков и помещается поверх стандартной 96-луночной микротитровой пластины, что позволяет проводить эксперименты с биопленкой с высокой пропускной способностью. Крышка колышка обеспечивает поверхность для роста биопленки, а биопленки, выращенные на колышках, могут быть дополнительно проанализированы в последующих экспериментах.
Тем не менее, пластины используют максимальный объем 200 микролитров, что затрудняет изучение образования биопленки и биомассы с использованием экспериментов, которые требуют большего количества биопленки. Здесь мы описываем устройство глубокой биопленки для выращивания статических биопленок. В устройстве для биопленки глубокой скважины используется микротитровая пластина глубиной 96 скважин, оснащенная полугонтовой 96-луночной ПЦР-пластиной в качестве крышки колышка.
Этот метод позволяет получить максимальный объем пластины 750 микролитров, обеспечивает большую площадь поверхности колышка для роста биопленки и является более дешевым по сравнению со стандартным устройством биопленки. Мы опишем и сравним протоколы кристаллического фиолетового окрашивания биопленок для определения биомассы биопленки, а также определения минимальной концентрации эрадикации биопленки, также известной как MBEC. Показан схематический обзор эксперимента, который будет описан.
Переносите желаемые бактериальные штаммы из криоконсервированного бульона непосредственно на питательную агаровую пластину. Инкубируйте агаровые пластины на ночь с оптимальными условиями деформации. На следующий день прививайте одну колонию в пять миллилитров питательных сред и выращивайте культуры в инкубаторе в течение ночи.
Пластины биопленки будут заполнены, как показано на рисунке. Заполните наружные скважины 750 микролитрами стерильной воды, а отрицательные контрольные скважины – 750 микролитрами стерильных питательных сред. Заполните оставшиеся лунки 675 микролитрами стерильной питательной среды.
Стандартизируйте ночные культуры до оптической плотности при 600 нанометрах 1,0. Создайте десятикратный ряд разбавления до тех пор, пока не будет достигнуто разбавление от 10 до минус трех. Инокулируют среды скважинами с 10 до минус трех разбавленных культур для окончательного бактериального разбавления от 10 до минус четырех и конечного общего объема в скважине 750 микролитров.
Осторожно вставьте крышку колышка в пластину биопленки. Инкубируйте пластины в оптимальных условиях деформации с максимальным встряхиванием 160 об/мин в течение 24 часов. Осторожно снимите крышку колышка с пластины роста биопленки и промойте биопленки в новой глубокой пластине скважины, заполненной 800 микролитрами стерильных PBS на скважину.
Перенесите крышки колышков на новую глубокую пластину скважины, содержащую 800 микролитров на лунку весом 0,1% по объему кристаллического фиолетового цвета и дайте окрашивать в течение пяти минут. Снова промойте крышки в свежей глубокой луночной пластине, заполненной PBS, чтобы удалить лишние пятна. После того, как крышки высохнут в течение 10 минут в шкафу биобезопасности, очистите колышки в глубокой пластине скважины, заполненной 800 микролитрами 30% аскетической кислоты на скважину в течение пяти минут.
Снимите крышку колышка и тщательно перемешайте, чтобы равномерно распределить пятно. Перенесите 200 микролитров из устройства биопленки глубокой скважины в стандартную 96-луночную микротитровую пластину и считывание оптической плотности на 550 нанометрах. Антимикробные пластины будут подготовлены, как показано на рисунке.
Наполните наружные скважины 750 микролитрами стерильной воды, а положительные и отрицательные контрольные скважины 750 микролитрами ростовой среды. Заполните оставшиеся лунки 750 микролитрами нужного серии антимикробного разведения. Осторожно снимите крышку колышка с устройства и промойте в стерильной глубокой пластине скважины с 800 микролитрами на лунку PBS.
Перенесите крышку колышка на антимикробную пластину и инкубируйте в течение желаемого периода времени воздействия. Асептически снимите крышки колышков с антимикробной экспозиционной пластины и промойте в стерильной глубокой плите, заполненной PBS. Снимите крышку колышка с PBS и перенесите на новую глубокую пластину скважины, содержащую 750 микролитров восстановительной среды на скважину.
Обжаривайте пластину ультразвуком на водяной бане в течение 30 минут. Снимите крышку колышка и замените ее стандартной непривязанной крышкой микротитров с плоским верхом, чтобы избежать загрязнения. Инкубировать в оптимальных условиях деформации в течение ночи.
На следующий день переложите 200 микролитров с пластины глубокой скважины на стандартную микротитровую пластину и считывайте оптическую плотность на 600 нанометров. Кристалло-фиолетовое окрашивание является эффективным и широко используемым методом аппроксимации биомассы бактериальных биопленок. Кристалло-фиолетовое окрашивание стандартных и глубоких скважинных устройств показало, что оба вида бактерий выращивали значительно больше биомассы на устройстве глубокой скважины по сравнению со стандартным устройством с кишечной палочкой, образующей в 2,1 раза больше биомассы по сравнению со стандартным устройством биопленки, и Pseudomonas aeruginosa, образующей в 4,1 раза больше биомассы.
Эти результаты соответствовали нашей гипотезе о том, что увеличение площади поверхности устройства биопленки глубокой скважины позволит увеличить накопление биомассы. Несмотря на большую изменчивость технических реплицированных значений CV-окрашивания для обоих штаммов, растущих на устройстве глубокой скважины, не было отмечено статистически значимых различий для биологических реплик обоих видов с использованием парного двустороннего ANOVA или Т-теста студента со значениями P, превышающими 0,05. Это открытие показывает, что образование биопленки устройствами глубоких скважин образуют воспроизводимые биопленки, аналогичные стандартным устройствам.
Наши результаты после стандартизации биомассы биопленки для объема и площади поверхности колышка между стандартными и глубокими скважинными устройствами показали небольшое, но значительное предпочтение материала между двумя протестированными видами бактерий. На полипропиленовом глубоком скважинном устройстве Pseudomonas aeruginosa продемонстрировала 1,4-кратное относительное увеличение образования биомассы, а Escherichia coli продемонстрировала 1,52-кратное относительное снижение образования биомассы с обратным эффектом, наблюдаемым на устройстве стандарта полистирола. Эта разница в предпочтениях видов бактерий к материалу колышка биопленочного устройства указывает на то, что результаты не могут быть перекрестно сопоставлены между устройствами биопленки.
Антимикробный вызов 24-часовых биопленок был протестирован с использованием четвертичного соединения аммония бензалкония хлорида, который, как известно, является эффективным ингибитором образования бактериальной биопленки, но менее эффективным противомикробным средством для эрадикации биопленки. Наши результаты показали, что значения BZK BMEC, полученные из устройства биопленки глубокой скважины, увеличились в среднем в шесть раз для Escherichia coli и в восемь раз для Pseudomonas aeruginosa по сравнению с ростом на стандартном устройстве биопленки. Результаты BZK MBEC были более изменчивыми, как и ожидалось, поскольку он является менее эффективным противомикробным препаратом для эрадикации биопленки и привел к диапазону значений Escherichia coli MBEC на обоих устройствах из-за пары выделяющихся колышков биопленки, которые выживали при более высоких концентрациях.
Мы также сравнили дезинфицирующий отбеливатель, который, как известно, является очень эффективным противомикробным средством для уничтожения бактериальной биопленки. Отбеливатель продемонстрировал несколько более высокое значение MBEC при тестировании в стандартном устройстве по сравнению с устройством глубокой скважины для обоих видов, что привело к четырехкратному увеличению Escherichia coli и двукратному увеличению Pseudomonas aeruginosa соответственно. Однако эти различия находились в пределах диапазона воспроизводимой погрешности между устройствами и демонстрировали гораздо меньшую изменчивость, чем BZK, подтверждая, что отбеливатель является более эффективным противомикробным средством для эрадикации биопленки.
Основным ограничением каждого устройства биопленки будет различный пластиковый состав колышков и результирующая изменчивость в прилипании и образовании биомассы различных видов бактерий к этим поверхностям. Кроме того, химические взаимодействия и совместимость между различными противомикробными препаратами и материалом пластикового колышка должны быть приняты во внимание перед выполнением описанного протокола. В заключение, этот протокол и результаты наших сравнений биомассы на глубокой скважине и стандартных устройствах биопленки показывают, что оба они способны культивировать надежные биопленки Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa с устройством глубокой скважины, обеспечивающим значительно большую биомассу на площадь поверхности колышка, чем стандартное устройство.
Устройство глубокой биопленки предлагает жизнеспособную, доступную альтернативу для статических, высокопроизводительных исследований культивирования и скрининга биопленки, которые требуют большего количества биопленки для последующего анализа. Из-за различий в композициях пластиковых материалов между каждым устройством, значения биомассы биопленки CV и MBEC не могут быть напрямую сопоставлены между устройствами. Однако если эксперименты последовательно проводятся на одном и том же устройстве, результаты, полученные между изолятами и противомикробными препаратами, сопоставимы.
Устройство для глубокой биопленки рекомендуется для лабораторий, которые хотели бы изучать биопленки в анализах с высокой пропускной способностью с использованием недорогих материалов.
