Этот протокол помогает количественно проанализировать 3D-структуру нервно-мышечных соединений с разрешением, близким к электронной микроскопии, используя простую процедуру. Основным преимуществом этого протокола является то, что образцы мышц обрабатываются аналогичным образом и иммуномаркируются для конфокальной микроскопии и микроскопии ЗППП, что сокращает время для точной оценки структуры нервно-мышечного соединения на животных моделях. Морфологическая количественная оценка, которую мы разработали, может быть легко адаптирована для анализа других субклеточных структур.
Я рад представить доктора Мартину Маринелло, ученого из моей команды, которая покажет, как выполняются мышечные дразнилки и иммуноокрашивания, и даст некоторые рекомендации для успешного применения этого протокола. Я рад представить доктора Джереми Козетта из платформы визуализации Genethon, который будет показывать получение и анализ изображений с помощью конфокальных и STED-микроскопов. После эвтаназии начните дразнить передние мышцы большеберцовой кости небольшими пучками волокон шириной около одного миллиметра, используя два тонких зубчатых щипца.
Затем переложите эти мышечные пучки в 24-луночную пластину, содержащую 1% тритона X-100, приготовленного в PBS, и дайте ему осторожно перемешиваться в течение одного часа при комнатной температуре или пяти часов при четырех градусах Цельсия. После промывки образцов три раза в течение пяти минут PBS при комнатной температуре, инкубируйте образцы блокирующим раствором, состоящим из 4%BSA, приготовленным в PBS с 1% Triton X-100 в течение четырех часов при четырех градусах Цельсия при мягком перемешивании. Затем инкубируют образцы в течение ночи с тем же блокирующим раствором, содержащим первичные моноклональные антитела против нейрофиламента М или синаптического гликопротеина 2 для маркировки терминалей пресинаптического аксона или активных зон соответственно.
На следующий день промыть помеченные мышечные пучки три раза в течение пяти минут PBS под мягким возбуждением. Затем инкубируйте их с соответствующими вторичными антителами, помещая их на шейкер в течение двух часов при комнатной температуре. После повторного промывания мышечных пучков поместите их на горку с монтажной средой.
Затем поместите стеклянную крышку 1,5 класса сверху, а затем цилиндрические магниты с обеих сторон слайда, чтобы оказать давление и сплющить мышцы. Чтобы получить изображения с помощью конфокального микроскопа, запустите программное обеспечение микроскопа и выберите машину в качестве режима конфигурации и соберите стеки изображений нервно-мышечных соединений в каждой экспериментальной группе в соответствии с настройками, упомянутыми в текстовой рукописи. В конце сеанса нажмите «Открыть в 3D-просмотрщике» и выберите нервно-мышечное соединение, представляющее экспериментальную группу, чтобы визуализировать 3D-маркировку.
Чтобы рассчитать постсинаптическое нервно-мышечное соединение и объем пластины, площадь проекции максимальной интенсивности и относительную извилистость, перетащите макрос для количественной оценки объема нервно-мышечного перехода в окно Image J, а когда макрос откроется во втором окне, нажмите «Макросы и запустить макрос». Выберите собственную папку, содержащую соединительные вложенные папки для анализа, и нажмите кнопку Выбрать. Затем во всплывающем меню папки сохранения выберите папку хранилища и нажмите «Выбрать».
В новом всплывающем меню под названием «Тип изображения» выберите формат приобретений стека Z. Выберите канал RGB, соответствующий интересующему окрашиванию, и укажите размер пикселя X, Y и шаг Z. Если выбраны проприетарные форматы файлов, макрос напрямую считывает размер пикселя и шаг Z.
Чтобы количественно оценить накопление пресинаптического нейрофиламента, перетащите макрос для количественной оценки накопления нервно-мышечного соединения в окно Image J и нажмите макрос Macros and Run. Выберите соединительные вложенные папки, папку хранения и формат приобретений стека Z, как показано ранее. Затем во всплывающем окне «Информация о окрашивании» укажите пресинаптическую и постсинаптическую метку и цвет и нажмите OK.In всплывающем окне «Размер пикселя», укажите размер пикселя X, Y как 0,072 микрометра, шаг Z — 0,5 микрометра и нажмите «ОК». Если выбраны проприетарные форматы файлов, макрос напрямую считывает размер пикселя и шаг Z.
Чтобы рассчитать расстояние между полосами рецептора ацетилхолина, выберите меню «Количественная оценка» в верхней части центрального окна. Перейдите на вкладку Инструменты, выберите интенсивность и нажмите на значок профиля линии. Установите для параметра Oversampling значение one и установите флажок Сортировать каналы.
Перейдите на вкладку Открыть проекты и выберите отфильтрованное изображение для анализа. Затем щелкните значок линии рисования и проследите линию, пересекающую перпендикулярно несколько полос или соединительных складок. Нажмите на верхнюю часть первого пика и переместите указатель мыши, нажимая левую кнопку мыши, пока не будет достигнут следующий максимальный пик.
Обратите внимание на значение DX, которое соответствует расстоянию между двумя пиками. Щелкните правой кнопкой мыши, находясь на изображении правого окна, и выберите Сохранить ROIs. После нажатия на значок стрелки нажмите на ROI и удалите его, нажав на значок bin.
Чтобы рассчитать ширину полосы ацетилхолинового рецептора, выберите интенсивность в верхней левой панели под вкладкой инструментов, нажмите на значок определения FWHM и отметьте каналы сортировки. Затем нажмите на вкладку «Открыть проекты» и выберите отфильтрованное изображение для анализа. Далее нажмите на иконку прямоугольника рисования в верхнем меню правого окна.
Выберите горизонтальную или вертикальную полосу и нарисуйте прямоугольник перпендикулярно полосе. В центральном окне появится профиль. Нажмите на вертикаль или горизонталь меню «Средняя проекция», расположенного на левой панели, в зависимости от того, является ли ориентация полосы вертикальной или горизонтальной.
Нажмите на Статистику в центральном окне, чтобы прочитать значение FWHM, а затем сохраните и удалите ROI, как показано ранее. Постсинаптическая моторная концевая пластина, помеченная флуоресцентным альфа-бунгаротоксином, оказалась меньше и фрагментирована у мутантов двух линий мыши. Количественная оценка Z-стеков нервно-мышечного соединения с использованием настраиваемых макросов Image J выявила заметное уменьшение объема концевой пластины, проекции максимальной интенсивности и относительной извилистости в обеих моделях мышей с заболеваниями по сравнению с контрольной группой, что указывает на дефекты созревания нервно-мышечного соединения.
Количественная оценка распределения пресинаптических концевых ветвей аксона с использованием пользовательского макроса Image J выявила измененную картину распределения нейрофиламента M в двух животных моделях с повышенной иммуномаркировкой. Благодаря окрашиванию синаптическим везикуловым гликопротеином 2 у Smn 2 наблюдалось снижение на 43% коэффициента заполнения областей, содержащих рецептор ацетилхолина, с прилегающими активными зонами нервных окончаний. Аспект постсинаптических концевых пластин нервно-мышечного соединения был четко визуализирован флуоресцентной маркировкой альфа-бунгаротоксинов и анализом профиля интенсивности.
Оценка параметров нервно-мышечного соединения выявила увеличение расстояния соединительной складки и ширины полос рецепторов ацетилхолина в икроножной мышце мутантов. Для получения достоверных результатов крайне важно правильно дразнить мышцы, уделяя особое внимание приложенной силе отдельных мышечных пучков. Этот протокол может помочь получить более глубокую морфологическую характеристику нервно-мышечного соединения, которая ранее объяснялась только сложными и трудоемкими процедурами, такими как просвечивающая электронная микроскопия.
Процедура визуализации ЗППП проложила путь к исследованию новых идей относительно пре- и постсинаптических маркеров, которые способствуют патофизиологии заболеваний, влияющих на нервно-мышечное соединение.
