Утолщение субхондральной кости, или склероз, является одним из признаков остеоартрита, как у животных моделей, так и у людей. В настоящее время выраженность гистологического субхондрального утолщения кости в основном определяется визуальной оценкой на основе полуколичественных систем классификации. Это исследование направлено на разработку воспроизводимого и легко выполняемого протокола для количественного измерения толщины субхондральной кости в мышиной модели ОА колена, вызванной дестабилизацией медиального мениска.
Мы создали мышиную модель остеоартрита коленного сустава путем хирургической дестабилизации медиального мениска, которая выполняется под хирургическим микроскопом и стерильным состоянием. Гистологический процесс коленных суставов мыши включает фиксацию тканей, декальцинацию, обрезку, обработку, встраивание, сечение и окрашивание с последующей микроскопической визуализацией. Изображение на экране показывает остеоартрит коленного сустава мыши с поражением суставного хряща, образованием остеофита и утолщением субхондральной кости Количественное измерение остеоартритной субхондральной кости с помощью программного обеспечения ImageJ.
Загрузите ImageJ с imagej.nih.gov/ij. Откройте ImageJ. Перейдите на вкладку Файл и нажмите кнопку Открыть, чтобы открыть гистологическое изображение.
Найдите адрес каталога файла, выберите файл рисунка и нажмите кнопку Открыть. С помощью инструмента «Прямая линия» набросайте одну единицу длины, микрометр, и нажмите «Анализировать», а затем «Задать масштаб». Установите известное расстояние и пропорции пикселей равными единице и нажмите Ok.ImageJ может преобразовать длину пикселя в единицу длины, микрометр.
Установите измеряемый коэффициент в область. Нажмите «Анализировать», затем «Установить измерение» и установите флажок «Область и предел порога» в новом окне. Этот шаг настраивает ImageJ для измерения области параметров в пределах выбранного порогового значения.
Определена общая область субхондральной кости, представляющая интерес, как показано в радио, которое охватывает субхондральную кортикальную пластинку и часть нижележащей трабекулярной кости, прилегающую к кортикальной пластине. Набросайте контур общей субхондральной области кости с помощью инструмента выделения под главным окном изображения. Инструменты выбора дают системе пороговое значение для ограничения измерения после выбора порога.
Щелкните Анализ, затем Измерение. Откроется окно результатов с измерением площади. Нажмите «Изменить», затем «Очистить снаружи», чтобы исключить область за пределами общей области субхондральной кости.
После нажатия кнопки Очистить снаружи видна только общая площадь субхондральной кости. Нажмите «Изображение», затем «Настроить», затем «Порог цвета», чтобы открыть окно цветового порога. Нажмите кнопку Оригинал в нижней части порогового цветового окна, чтобы восстановить исходное состояние изображения.
Используйте инструменты выделения, чтобы нарисовать небольшую коробочку в области костного вещества. Щелкните Параметр образца в нижней части окна, чтобы определить область костного вещества. Выбранная область костного вещества превратится в красную.
Нажмите кнопку Выбрать в нижней части окна цветового порога, чтобы создать порог измерения области. Нажмите «Анализ», затем «Измерение» в главном меню ImageJ. Результат измерения площади костного вещества будет отображаться в окне результатов.
Сохраните данные общей площади субхондральной кости и площади костного вещества. Меж- и внутринаблюдательная изменчивость и воспроизводимость определялись анализом коэффициентов корреляции Пирсона. Значимость различий между исследовательскими группами определялась с помощью студенческого t-теста или одностороннего ANOVA, за которым следовал пост-специальный тест.
На этом рисунке показаны верхние и нижние панели. На верхней панели показаны микрофотографии гистологических изображений из групп Sham и DMM для визуальной оценки субхондральной классификации костей. Нижние панели показывают микрофотографии гистологических изображений из групп Sham и DMM для количественного субхондрального измерения кости с помощью ImageJ.
Поля, очерченные пунктирной желтой линией, выполненной с помощью Adobe Illustrator, определяют общую область подхондральной кости, представляющую интерес. Область костного вещества внутри коробок выделена оранжевым цветом. Замечательное утолщение субхондральной кости в медиальном мыщелке бедренной кости и медиальном плато большеберцовой кости можно количественно оценить с помощью программного обеспечения ImageJ.
На этом рисунке тесты вариаций между наблюдателями указывают на высокую воспроизводимость между наблюдателями как для первого, так и для второго измерения толщины субхондральной кости в медиально-большеберцовом плато и медиальных областях мыщелка бедренной кости, представляющих интерес. На этом рисунке внутринаблюдательные вариационные тесты указывают на высокую воспроизводимость между измерениями толщины первой и второй субхондральной кости в медиальном плато большеберцовой кости и медиальных областях мыщелка бедренной кости, представляющих интерес. В таблице 1 приведен сравнительный анализ воспроизводимости между визуальной классификацией и количественным измерением толщины субхондральной кости с помощью ImageJ.
Тест коэффициента корреляции показывает, что количественное измерение было относительно более воспроизводимым, чем система визуальной оценки. На этом рисунке показан сравнительный анализ чувствительности визуальной градации и количественное измерение толщины субхондральной кости с помощью ImageJ в медиальном мыщелке бедренной кости и медиально-большеберцовом плато. Гистологические изображения для визуальной оценки были разделены на три группы.
Количественное значение толщины субхондральной кости от всех трех наблюдателей для изображений DMM с нулевой визуальной оценкой было значительно выше, чем у изображений Sham с нулевой визуальной оценкой, что указывает на то, что количественное измерение более чувствительно, чем визуальное градация к легкому утолщению субхондральной кости. Недавно разработанный протокол количественного измерения толщины остеоартритной субхондральной кости более чувствителен к легким субхондральным изменениям кости, чем широко используемые системы визуальной классификации. И этот протокол может быть использован для выявления ранних остеоартритных субхондральных изменений костей и для оценки эффективности in vivo лечения остеоартрита в сочетании с классификацией хряща остеоартрита.
