Этот метод может помочь решить проблемы с обычными методами выращивания микробов. Он обеспечивает недорогую, удобную в эксплуатации и надежную экспериментальную платформу для автоматизированного культивирования микробов и адаптивной эволюции. Эта технология автоматизирует операции и больше снижает трудозатраты.
И в то же время он имеет хорошую культуру производительности с надежными результатами и простыми операциями. Технология в основном используется в областях микробиологических исследований, таких как измерение кривой роста, адаптивная лабораторная эволюция и однофакторный многоуровневый анализ. Начинают подготовку эксперимента с подключения шприцевой иглы с внутренним диаметром 0,41 миллиметра и наружным диаметром 0,71 миллиметра к быстрому разъему А и флакону с реагентом.
Затем автоклавируйте все оборудование при 121 градусе Цельсия в течение 15 минут. Чтобы установить микрофлюидный чип, откройте дверцу операционной камеры и поднимите оптоволоконный зонд. После выравнивания отверстий электрического поля с помощью игл осторожно поместите чип на пьедестал чипа, затем вставьте две позиционирующие колонны в позиционирующие отверстия и опустите оптический волоконный зонд.
Затем подключите быстрый разъем A на чипе к соответствующему порту микробной системы микрокаплетной культуры или MMC в соответствии с номером положения, как описано в рукописи. Когда все будет готово, закройте дверцу операционной камеры. Культивируемую кишечную палочку MG1655 разбавляют со средой до OD600 от 0,05 до 0,1 до получения 10 миллилитров исходного раствора бактерий.
Чтобы инициализировать консоль MMC, перейдите на вкладку Инициализация. Когда появится интерфейс инициализации, установите температуру культивирования как 37 градусов Цельсия, а значение фотоэлектрического сигнала как 0,6. Инициализация займет около 20 минут.
Позже поместите стерилизованную бутылку с реагентом на чистую скамейку и затяните крышку. Используйте 10-миллилитровый стерильный шприц, чтобы ввести от трех до пяти миллилитров масла MMC из иглы шприца в боковую трубку в бутылку с реагентом. Затем наклоните и медленно поверните бутылку с реагентом, чтобы масло полностью проникло во внутреннюю стенку.
После введения пяти миллилитров исходного раствора бактерий в бутылку заполните флакон с реагентом, введя пять-семь миллилитров масла MMC. Вытащите независимый быстрый соединитель A бутылки с реагентом и вставьте быстрый соединитель A в быстрый разъем B бутылки для завершения операции впрыска образца. После этого откройте дверцу операционной камеры, чтобы поместить бутылку с реагентом в металлическую ванну.
Вытащите разъем C2 чипа и быстрый разъем A бутылки с реагентом. Подключите разъем боковой трубки бутылки реагента к разъему C2, а соединитель верхней трубки к разъему O2. Затем закройте дверцу операционной камеры.
Чтобы выбрать функцию измерения кривой роста, нажмите на Кривая роста в интерфейсе настройки параметров, введите число как 15. Затем включите переключатель обнаружения OD и установите длину волны 600 нанометров. Нажмите на вкладку Пуск, чтобы начать генерацию дроплетов.
Процесс займет 15 минут. Когда на главном интерфейсе появится всплывающее окно с запросом сообщения, откройте дверцу операционной камеры, чтобы вынуть бутылку с реагентом и подключить разъемы C2 и O2. После закрытия двери нажмите кнопку OK во всплывающем окне, чтобы автоматически культивировать капли и обнаружить значения OD.
Когда кривая роста достигнет стационарной фазы, нажмите кнопку «Экспорт данных», чтобы экспортировать данные OD. Выберите путь сохранения данных и экспортируйте значение OD, записанное за период культивирования, в формате CVS Чтобы построить кривую роста, используйте картографическое программное обеспечение, такое как Excel и Origin 9.0. Впрыскивайте необходимые объемы исходного раствора бактерий, свежей среды и масла MMC в отдельные стерилизованные флаконы с реагентами для исходного раствора бактерий в свежей среде, как объяснялось ранее.
Чтобы выбрать функцию адаптивной эволюции, нажмите на ALE в программном обеспечении. В интерфейсе настройки параметров включите переключатель обнаружения OD, затем задайте все параметры, описанные в рукописи, и перейдите на вкладку Пуск, чтобы начать генерацию дроплетов. Процесс займет около 25 минут.
В течение каждого периода субкультуры наблюдайте, значительно ли увеличились максимальные значения ОД капель. Если увеличение происходит и соответствует требованиям эксперимента, нажмите кнопку экспорта данных, чтобы экспортировать данные OD. Чтобы извлечь целевые капли из MMC, нажмите на вкладку скрининга, чтобы выбрать функцию извлечения капель.
Затем выберите опцию Собрать и щелкните количество целевых капель. Когда все будет готово, нажмите OK. Дождитесь появления всплывающего окна с запросом сообщения. Затем поместите быстрый разъем CF в трубку микроцентрифуги для сбора и нажмите OK. Через одну-две минуты, когда в программном интерфейсе появится новое окно с запросом сообщения, вставьте быстрый соединитель CF обратно и нажмите OK, чтобы MMC продолжала работать.
Когда следующая целевая капля достигнет сайта распознавания капель, соберите ее, как указано выше. Используйте 2,5-микролитровую пипетку, чтобы вынуть и поместить каплю на 90-миллиметровую твердую пластину, а затем равномерно распределить каплю стеклянным треугольным стержнем с боковым покрытием длиной три сантиметра, затем культивировать каплю в инкубаторе с постоянной температурой 37 градусов Цельсия в течение 72 часов. Позже выберите три-пять независимых колоний бактерий, чтобы культивировать каждую колонию отдельно в колбе с 50 миллилитрами свежей среды с 10 миллилитрами свежей среды в встряхивающем инкубаторе со скоростью 200 оборотов в минуту и 37 градусами Цельсия в течение 48-72 часов.
После инкубации следуйте соответствующим стандартным правилам для хранения раствора культивируемых бактерий в глицериновой трубке. Репрезентативный анализ показывает кривые роста 50 капель во всем процессе адаптивной эволюции. Было отмечено, что штамм метанола Escherichia coli или MeSV2.2 демонстрировал первоначальный медленный рост, за которым следовал быстрый рост.
Кривая роста шестой капли во всем процессе адаптивной эволюции была построена отдельно. Максимальное значение OD600 в первом поколении составляло 0,37, которое увеличилось до 0,58 в последний период субкультуры, что указывает на то, что штамм в капельной шестерке реализовал очевидную адаптивную эволюцию. Кроме того, сравнивались кривые роста штамма капли шесть и исходного штамма.
Штамм капельной шестерки демонстрировал более высокую максимальную удельную скорость роста и концентрацию клеток в стационарной фазе, чем исходный штамм. Самое главное – убедиться, что соединение чипа инструмента и флакона с реагентом правильное, что является каплями для нормального протекания операций. Этот метод дает исследователям новую идею для культивирования микроорганизмов, а также обеспечивает эффективную и недорогую платформу для адаптивной эволюции штаммов.
