Этот протокол обеспечивает альтернативный метод in vivo для изучения роли роста опухоли эмбрионального смертельного нокаута гена. Преимущество этого метода заключается в том, что нокауты генов, которые обычно являются эмбриональными летальными, могут быть выполнены в опухолях, полученных из генетически модифицированной мышиной модели, для изучения их эффектов потери функции in vivo. Этот метод может быть применен к заболеваниям, которые требуют изучения in vivo роли эмбриональных основных генов, недостижимых из традиционных моделей мышиного нокаута генов.
Создание модели на животных требует времени, и требуется эмпирическое тестирование для определения оптимального MOI для аденовирусной инфекции, чтобы обеспечить достижение соответствующей рекомбинации. Для начала определите мышь с нужным генотипом. Когда опухоленосная мышь достигнет своей гуманной конечной точки, усыпьте мышь и используйте стерильный нож скальпеля для удаления опухоли.
Рассечение опухоли на три секции в разрезах в стиле хлебной буханки с помощью скальпельного ножа для генерации сегментов ткани для фиксации формалина парафином, встраивания раннего формирования культуры и мгновенного замораживания для аналитического анализа. Окрашивание пятимикрометрового формалин-фиксированного, парафинового внедренного участка ткани гематоксилином и эозином. Как только патологоанатом подтвердит опухоль, выполните иммуногистохимическое окрашивание для подтверждения диагноза опухоли.
Поместите только что собранную злокачественную опухолевую ткань оболочки периферического нерва в 10 миллилитрах ледяного стерильного PBS на льду, а затем перенесите ее в стерильную рабочую зону для создания культур раннего прохождения. Измельчите опухолевую ткань на два-четыре миллиметровых кусочка и тритурируйте от восьми до 10 раз в обработанной 10 квадратных сантиметрах чашке для культивирования тканей, содержащей 10 миллилитров питательной среды. Культивируют эти ткани в высокоуглековую питательную среду DMEM-10, дополненную 10 наномолярными неурегулинами-1 бета и двумя микромолярными форсколином.
Засейте ранопроходимые опухолевые клетки с плотностью от 1,5 раз 10 до шестой клетки на одну обработанную тканевую культуру размером 10 квадратных сантиметров чашку, содержащую питательную среду DMEM-10. Через 12-16 часов промыть адгезивные культуры двумя-четырьмя миллилитрами DPBS и заразить клетки аденовирусом примерно по 400 бляшек на клетку в 10 миллилитрах DMEM без сыворотки. После 48 часов инфекции кратко проверьте клетки на наличие сигнала EGFP на флуоресцентном микроскопе, чтобы обеспечить эффективное заражение примерно 50-100% положительными клетками, а затем FACS сортирует EGFP-положительные инфицированные клетки.
После сортировки FACS дайте клеткам восстановиться в инкубаторе культуры тканей в течение не менее 24-48 часов, а затем подготовьте клетки к анализу на основе клеток in vitro или трансплантации in vivo. Подтвердите делецию Erbb4, выполнив ПЦР с использованием геномной ДНК, выделенной из части отсортированных EGFP-положительных клеток. Выполните анализы пролиферации в течение следующих семи дней на отсортированных опухолевых клетках, покрытых 96-луночной пластиной, используя автоматизированный цитометр на основе изображений.
Окрашивайте клетки крючками и йодидными красителями пропидия и захватывайте изображения клеток с помощью автоматического считывателя пластин, чтобы подсчитать количество живых и мертвых клеток в каждой скважине. Выделяют общую РНК из отсортированных опухолевых клеток с использованием стандартного кислотного гуанидинийфенола и метода на основе хлороформа. Откройте программное обеспечение для выполнения выравнивания последовательности РНК в соответствии с программными шагами с использованием настроек по умолчанию.
Выберите метод анализа, поиск РНК, а затем выберите эталонный геном мыши. Загрузите файл BED, если он предоставлен ядром виртуализации. Загрузите файлы виртуализации FASTQ и присвойте им уникальные имена реплик.
Группа реплицирует файлы FASTQ и назначает их набору репликаций. Для статистического и нормализующего анализа для идентификации дифференциальных сигналов экспрессии генов с надежной статистической мощностью откройте программное обеспечение для анализа и выберите файлы GFP FASTQ в качестве набора контрольных данных. Затем выберите DESeq2 в качестве статистического метода и метода нормализации и запустите сборку и анализ.
Используйте наборы данных генной онтологии, интегрированные в инструменты анализа функционального обогащения открытого доступа, для выполнения анализа функционального обогащения на идентифицированном статистически значимом Erbb4-опосредованном ERBB4 DEG для определения биологической и pathway значимости потери гена Erbb4. Введите опухолевые клетки в седалищный нерв анестезированной мыши для оценки потенциала роста аллотрансплантата in vivo в постинфицированных клетках. Как только опухоль достигнет необходимого размера, рассекните опухоль от усыпленной мыши на два-три участка, как было продемонстрировано ранее.
Зафиксируйте один участок ткани в 4% параформальдегида на ночь, а затем встройте неподвижный участок в парафин. После создания участков толщиной в пять микрометров из ткани FFPE установите участок на слайдах и подтвердите наличие опухолевых клеток в трансплантированной ткани с помощью H & E и иммуноокрашивания, как было продемонстрировано ранее. Чтобы подтвердить различия в экспрессии in vivo Erbb4 между двумя экспериментальными условиями, окрасьте закрепленную формалином парафиновую ткань специфическими антителами Erbb4.
Проанализирована трансдукция злокачественных клеток опухолевой ткани оболочки периферического нерва аденовирусом. Клетки, экспрессирующие EGFP, были обнаружены с помощью флуоресцентной микроскопии, а общее количество клеток определяли с помощью фазово-контрастной микроскопии. После cre-опосредованной абляции гена, в зависимости от эффективности трансфекции, генотипирование ПЦР показало полный нокаут гена и гетерогенную популяцию индуцированных и неиндуцированных клеток по сравнению с контрольной трансдукцией.
Характерная гистопатология, обнаруженная в ортотопических аллотрансплантатах злокачественных опухолевых тканей оболочки периферических нервов по сравнению с опухолями, полученными из оригинальных генетически модифицированных моделей животных, продемонстрировала разницу в морфологии клеток. Абляция Erbb4 уменьшала клеточную плотность и клеточную пролиферацию в адено5-ЦМВ-кре-абляционных клетках, контролирующих адено5-ЦМВ-GFP-трансдуцированные клетки. Экспрессия Erbb4 в опухолевых клетках, трансдуцированных adeno5-CMV-Cre, или вирусом EGFP, была снижена в результате адено5-CMV-Cre трансдуцированных аллотрансплантатов по сравнению с контрольными аденотрансплантатами, обработанными адено5-ЦМВ-ЭГФП.
Плотность сосудов оценивали с помощью обнаружения иммунореактивности для CD31, и репрезентативные результаты показали заметное снижение плотности сосудов в аллотрансплантатах адено5-ЦМВ-Cre-трансдуцированных клеток по сравнению с контрольными адено5-ЦМВ-EGFP-трансдуцированными клетками. После абляции генов клетки могут быть использованы для многих различных типов клеточных анализов, таких как пролиферация, миграция, 3D-рост или изменения микроокружения, а также для ортотопических инъекций in vivo.
