Протокол направлен на нормализацию сбора культивируемой среды и анализ хромосомной плоидности на основе неинвазивного хромосомного скрининга NICS преимплантационных эмбрионов человека. Основным преимуществом NICS является простота в эксплуатации, а не микроманипуляции с TiDieR, экономия времени и эффективное снижение потерь инвазивного биопсийного образца. Метод отбора проб очень гибкий.
Здесь мы предлагаем вам два различных варианта: один для рутинного последовательного культивирования эмбрионов, а другой для одного этапа. Это основные коллеги нашей команды, д-р Ясинь Яо и д-р Сяохуэй Чжу в основном отвечают за подготовку библиотеки и секвенирование регенерации NICS. Мы с доктором Цзялинь Цзя завершаем эмбриологическую работу и собираем образцы.
Профессор Лю – руководитель нашей группы. Она также является автором-корреспондентом этой статьи. Для начала подготовьте реактивы и инструменты.
Перед применением предварительно подогреть и сбалансировать от 20 до 30 микролитров питательной среды и гиалуронидазы. Затем поместите питательную среду и гиалуронидазу на рабочую поверхность в вытяжной шкаф. Быстро перенесите переваренные OCCC в чашку для культивирования для обработки ооцитов и залейте минеральным маслом в каждую лунку.
Осторожно аспирируйте и освободите ооциты от пяти до 10 раз, чтобы удалить остаточные гранулезные клетки вокруг ооцитов. Повторите этот шаг в оставшихся трех лунках, чтобы полностью удалить гранулезные клетки. Оцените полноту удаления гранулезных клеток с помощью микроскопа.
Затем проводят интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоида, также называемую ИКСИ, и переносят эмбрион в питательную среду. Подготовьте от 20 до 30 микролитров микрокапель среды культуры бластоцист для каждого эмбриона. Залейте эмбрионы минеральным маслом в чашке для культивирования тканей на второй день и инкубируйте при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа и 5% кислорода.
После переноса эмбриона на третий день в промывающую микрокаплю осторожно аспирируют и выпускают эмбрион в микрокапле по три капли последовательно с помощью пипеток. Затем переносят эмбрион в питательную среду бластоцисты. Подготовьте микрокапли для промывки и микрокапли культуры.
Во второй половине четвертого дня пересадить эмбрион в предварительно подогретые микрокапли питательной среды и аккуратно промыть каждый эмбрион поочередно тремя микрокаплями с помощью пипеток. Перенесите каждый эмбрион в уникальную предварительно подогретую одну микрокаплю питательной среды для забора образца. Культивирование эмбриона бластоцисты перед криоконсервацией.
Для проведения витрификации перед криоконсервацией эмбриона подготавливают микрокапли культуры и переносят эмбрион в предварительно подогретые микрокапли питательной среды объемом от 10 до 15 микролитров. И аккуратно промыть каждый эмбрион поочередно тремя микрокаплями пипеткой утром пятого дня. Как было показано ранее, каждый эмбрион переносят в уникальную предварительно подогретую одну микрокаплю питательной среды для забора образца.
И культивировать эмбрион бластоцисты при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа перед криоконсервацией. Затем осторожно отрегулируйте ICM на значительном расстоянии от целевой точки лазерного луча, который фокусируется на клеточном соединении трофэктодермы, чтобы создать небольшое отверстие в трофэктодерме для высвобождения жидкости из полости бластоцеля. Чтобы собрать образец, разморозьте буфер в наборе при комнатной температуре и ненадолго центрифугируйте.
Затем переносят питательную среду от каждого культивируемого эмбриона в ПЦР-пробирку, не содержащую РНКазы-ДНКазы, содержащую пять микролитров клеточного лизисного буфера. Подготовьте реактивы и инструменты. После количественного определения геномную ДНК разводят до концентрации 50 пикограмм на микролитр с питательной средой.
После тщательного перемешивания кратковременно центрифугируйте пробирку при 200 G в течение пяти секунд. После центрифугирования питательной среды в микроцентрифуге в течение 30-60 секунд пипеткой 10 микролитров питательной среды со дна пробирки разбавляют контрольную и свежую питательную среду в новую ПЦР-пробирку объемом 0,2 миллилитра. Добавьте один микролитр смеси ферментов МТ и тщательно перемешайте пипетированием.
Затем сразу же центрифугируйте в течение двух-трех секунд. Поместите пробирку для ПЦР в предварительно нагретую станцию подготовки смешанных образцов и запустите программу лизиса. После того, как буфер pre-lib разморозится и перемешан, немедленно центрифугируйте его в течение двух-трех секунд при 200 G. Приготовьте мастер-смесь для реакции prelibrary, добавив два микролитра пребиблиотечной ферментной смеси к 60 микролитрам пребиблиотечного буфера.
Тщательно перемешайте реакцию и ненадолго центрифугируйте. Добавьте 60 микролитров реакционной смеси в предварительно обработанный образец среды. Тщательно перемешав его с помощью пипетирования, немедленно центрифугируйте в течение двух-трех секунд при 200 G. Поместите пробирку для ПЦР в предварительно нагретую станцию подготовки проб.
Запустите предбиблиотечную программу и подержите при четырех градусах по Цельсию. Приготовьте мастер-смесь для библиотечной реакции, добавив 1,6 микролитра библиотечной ферментной смеси к 60 микролитрам библиотечного буфера. Тщательно перемешайте реакцию и центрифугируйте, как показано ранее.
Добавьте 60 микролитров библиотечной реакционной смеси и два микролитра праймера для штрих-кода в каждый продукт, входящий в библиотеку. Затем тщательно перемешайте реакцию и центрифугите, как показано на рисунке. После центрифугирования поместите ПЦР-пробирку в амплификатор.
Запустите программу подготовки библиотеки, а затем удерживайте ее при температуре четыре градуса по Цельсию. Подготовьте реактивы и инструменты. Добавьте подготовленные 1X подготовленные мега бусины в библиотечный образец.
Количественно оцените очищенные библиотеки, как описано в текстовой рукописи, и используйте 10 нанограммов каждого библиотечного образца для объединения. Обратитесь к руководству пользователя по виртуализации и выполните анализ данных после завершения виртуализации. Введите имя пользователя и пароль на странице входа для анализа данных в ChromGo.
После входа в систему нажмите Create Submission (Создать отправку) на вкладке NICS. Затем выберите NGS для Platform, Illumina для Corporation и NICSInst для Reagent. Введите информацию о проекте в поле под идентификатором проекта.Задайте параметры анализа и загрузите файлы.
После успешной загрузки всех файлов секвенирования нажмите кнопку Отправить, чтобы начать анализ. Отправленные проекты перечислены на вкладке «Просмотр отправленных материалов». Нажмите кнопку Показать в поле Отчет, чтобы просмотреть сводную таблицу анализа NICS.
Нажмите кнопку Экспортировать отчет, чтобы сохранить отчеты. У пациенток было получено шесть бластоцист, и NICS была выполнена на всех шести эмбрионах с четвертого по пятый день среды. Хромосомные аномалии, вызванные сбалансированной транслокацией родителей, были обнаружены в пяти хромосомах с помощью анализа NICS, поэтому они не использовались для переноса.
Результаты NICS двух эмбрионов показали, что один и тот же кариотип 45 XN и делеция хромосомы 18 были делециями хромосомы 18. Короткое плечо кариотипа 46 XN делеции первого участка хромосомы было только коротким плечом делеции участка хромосомы. Результаты NICS показали кариотип 46 XN с длинным плечом делеции участка хромосомы 18 и коротким плечом дупликации одного участка хромосомы.
Несмотря на то, что кариотипы представляли собой пятую хромосомную дупликацию и показали восемь мозаичных различий, анализ NICS позволил провести скрининг всех 24 хромосом на анеуплоидию. Этот процесс обеспечивает новый метод переноса одиночных нормальных бластоцист кариотипа. При проведении этой процедуры важно помнить о полном удалении кумулярных клеток, чтобы избежать контаминации материнского происхождения, и собрать питательную среду и стадию экспозиции бластоцисты, когда содержание ДНК достаточно для амплификации.
Используя технологию NICS, настоящее исследование оптимизировало этапы подготовки WGA и библиотеки WGS примерно за три часа и выбрало неинвазивный результат CCS примерно за девять часов. После разработки методика предоставила клиницистам в ВРТ новый способ сочетания морфологической оценки с NICS для переноса аплоидного эмбриона с хорошей морфологией в матку, что может улучшить текущие показатели беременности и живорождения.
