Использование постнатальной электропорации in vivo для изучения морфологии нейронов мозжечковых гранул и развития синапсов

Протокол изучает гранулярные нейроны мозжечка на разных стадиях развития, чтобы визуализировать ключевой морфологический рост. Преимущества метода включают в себя клеточное нацеливание, быструю экспрессию трансфицированных конструкций и разреженную маркировку клеток, что позволяет изучать клеточные автономные эффекты. Начните с вырезания 11,2-миллиметрового сегмента из наконечника загрузочной пипетки и поместите отрезанную часть на наконечник шприца Hamilton в качестве прокладки, чтобы ограничить глубину впрыска до 1,5 миллиметра.

Закрепите прокладку на наконечнике шприца с помощью клея или парапленки. Чтобы изучить морфологию одиночных электропорированных CGN из сагиттальных срезов мозга экспериментального щенка, сделайте снимки Z-стека с размером 0,5 микрометра на стек на конфокальный микроскоп. Изображение по одной ячейке на окно изображения, чтобы упростить анализ изображений и 3D-реконструкцию.

Проанализируйте длину нейрита и образование дендритного когтя вслепую, используя простой индикатор нейритов. Загрузите одноканальные Z-stack изображения электропорированных CGN на Фиджи и нажмите «Плагины»Сегментация«и Simple Neurite Tracer«Выберите «Создать новый 3D-просмотрщик»из выпадающего меню. Прокрутите до основания дендрита, соединяющегося с клеточной сомой и начните путь, нажав на соединение.

Вручную проведите трассировку пути, щелкнув участки, где сигнал заполнения ячейки наиболее яркий, и нажав клавишу Y, чтобы сохранить трассировку. Проведите до конца дендрита и подтвердите путь, нажав F.В качестве альтернативы проведите до основания когтя. Далее проведите коготь от основания конструкции до конца самого длинного нейрита.

Отследите вторичные и третичные ветви, удерживая нажатой клавишу Control в Windows или ALT в macOS и щелкнув путь. Подтвердите путь, нажав клавишу F.Обратите внимание, что измерения следов видны в отдельном окне. Сложите все размеры ветвей когтя, чтобы получить общую длину каждого когтя.

В репрезентативном анализе проекционные изображения электропорированных CGN от 3 до 14 дней после инъекции показали прогрессирующее снижение количества дендритов. CGN претерпели фазу дендритного роста с последующим уточнением с 3 DPI до 7 DPI, что привело к обрезке более 50% избыточных дендритов. Это событие совпадает с постепенным удлинением оставшихся беседок при образовании когтевидных структур в конце каждого дендрита, что указывает на то, что эти процессы развития происходят одновременно.

При 7 DPI когти были обнаружены примерно на 75% дендритов. Каждый меченый CGN был реконструирован в NMRS для количественной оценки общей площади и объема сомато-дендритной поверхности. Существенной разницы в размере CGN на протяжении всей разработки не наблюдалось.

Несмотря на то, что при 7 DPI CGN показали значительное снижение объема на 20% по сравнению с 3, 5 и 10 DPI. Самое главное в процедуре – точно локализовать мозжечок перед инъекцией. Метод может быть адаптирован для генетического манипулирования генами in vivo для изучения их роли в развитии гранулярных нейронов путем трансфекции либо шРНК, либо миРНК, либо Cre Recombinase.