Визуализация поглощения небольших внеклеточных везикул, также известных как sEV, различными клетками спинного мозга, может подтвердить успешную доставку sEV. Это позволяет проводить как механистические, так и терапевтические исследования интратекально вводимых sEV из различных источников в моделях роденов. Этот протокол может быть использован для визуализации поглощения sEV клетками в мягком спинном мозге и может помочь оценить роль sEV и его молекул-грузов в спинальных расстройствах, боли и воспалении.
Эта процедура будет продемонстрирована мной вместе с Сюань Ло и Чжучэн Линем, двумя аспирантами в лаборатории доктора Сины Аджит. Начните с размещения 18-миллиметровых покровных слипов в 12-луночную пластину, затем пластинчатые клетки нейро-2а в каждой скважине с общим количеством 1 миллилитра полного DMEM, содержащего 10% FBS и 1% стрептококка. Когда количество клеток беглости достигает 80-90%, изменяют среду на ДМЕМ экзосомную обедненную среду в каждую скважину добавляют один, 5 или 10 мкг меченых sEV.
В течение 1, 4 и 24 часов. Для дозы и времени зависит поглощение остальных скважин при равном объеме контроля красителя. Соберите мозги послеродовых детенышей в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую ледяной холодный раствор соли Хэнкса, дополненную 10 миллимолярными гепе, рассекните обе корковые доли и удалите мозговые огромождения.
Затем измерзать ткани стерилизованным лезвием. Переместите ткани в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую Pepane или дезоксирибонуклеус один диссоциационный буфер, и инкубировать в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия, закручивая трубку каждые 5 минут, аспирировать супернатант и добавлять 5 миллилитров полного DMEM в трубку. Чтобы инактивировать активность фермента, попробуйте тщательно оценить диссоциации тканей с помощью 5-миллилитровой стеклянной серологической пипетки и пламенной полированной пастбищной пипетки.
Пропустите клеточную суспензию через 40-микрометровый клеточный сетчатый фильтр, а затем центрифугируют клетки в 250 раз G в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия, аспирируют среду и видят клетки в 10 миллилитрах полного DMEM в колбе площадью 75 квадратных сантиметров. После 4 часов покрытия замените супернат и среду 15 миллилитрами свежей среды DMEM. Через 14 дней in vitro отсоединяют микроглию и олигодендроциты, переносят колбу на орбитальный шейкер при 320 об/мин в течение 6 часов.
Используйте 5 миллилитров фермента диссоциации клеток в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия. Чтобы трипсинизировать оставшиеся астроциты, инактивировать ферментативное действие, добавляют 5 миллилитров полного DMEM, а затем гранулируют клетки в 250 раз больше G в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Повторно суспендируете ячейки в полном DMEM и посмотрите, как ячейки на 12-миллиметровой крышке с номером 1,5 проскальзывают в 24-колодезной пластине.
С помощью PBS промыть ячейки 3 раза, а затем зафиксировать их формальдегидом 4% мощности или PFA в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре. Промыть неподвижные клетки 3 раза в течение 5 минут с PBS и процедить их, используя 0,1% Triton X 100 в PBS в течение 10-15 минут. Затем повторите стирку с PBS.
Используйте 5% нормальную козью сыворотку или NGS в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы блокировать клетки, инкубировать клетки neuro-2a с картой двусторонних антител и первичные астроциты с антителами GFAP в соотношении от 1 до 500 в свежих 5% NGS или PBS на ночь при 4 градусах Цельсия с легким встряхиванием. После промывки клеток 3 раза в PBS добавляют флуорофор конъюгированных вторичных антител в 5%NGS. Инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре, защищенной от света на коромысле.
Повторите промывку PBS и инкубируете клетку с 1 микрограммом на миллилитр DAPI в течение 10 минут при комнатной температуре. Еще раз промыть клетки 3 раза PBS. Используя антивядаю монтажную среду, установите крышку на слайды No 1, дайте им высохнуть в течение ночи в темноте и храните подготовленные стеклянные слайды при 4 градусах Цельсия до получения изображения на конфокальном микроскопе.
Рассекните спинной мозг и зафиксируйте его в 4% PFA в PBS при 4 градусах Цельсия в течение 24 часов. Предварительно защищают ткани в 30% сахарозе в PBS при 4 градусах Цельсия в течение 24 часов или до тех пор, пока ткани не опустятся, а затем хранят ткани при 4 градусах Цельсия до иммуногистохимии, впитают спинной мозг L4 L5 в соединение OCT, затем замораживают его на сухом льду до полного затвердения. Используйте криостат для секционирования тканей на 30 микрометров и сбора срезов в 24 скважины, содержащей PBS.
Промыть участки 3 раза по 5 минут каждый с 0,3% тритона в PBS, заблокировать неспецифические сайты связывания с помощью 5%MGS в 0,3% Triton PBS в течение 2 часов при комнатной температуре. Высиживать срезы на ночь при 4 градусах Цельсия на шейкере. Промыть секции 3 раза в течение 5 минут с 0,3% тритона в Pbs.
Затем добавляют соответствующую концентрацию вторичных антител. Согласно рукописи текста, инкубируют при комнатной температуре в течение двух часов, моют участки, используя только PBS и инкубируют их в 1 микрограмм на миллилитр DAPI в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем повторите промывки PBS под световым микроскопом, установите участки на прозрачный клеевой слайд тонкой кистью.
Смочите крышку с помощью монтажной среды и отвержьте на ночь в темноте при комнатной температуре, получите изображения под конфокальным микроскопом с соответствующими лазерами, Средний размер RA 2 6 4 0,7 производных sEV составил 140 нанометров, а пиковый размер частиц составил 121,8 нанометра. С наиболее обнаруживаемыми частицами, попадающими в диапазон размеров экзосом или sEVS. На высоте от 50 до 150 нанометров западное блоттирование sEV, клеточного лизата и экзодеплементированных сред показало, что образцы белков, полученные из sEV, содержат белки-маркеры sEV Alix CD81 и GAPDH.
Клеточный лизат обогащали эндоплазматическим щетикулумом, резидентным белком Calnexin, таким образом, Calnexin служил отрицательным маркером клеточного загрязнения, поскольку он отсутствовал в sEV. Было отмечено, что поглощение sEV происходило через 1 час, а для 1, 5 и 10 микрограммов sEV постинклюбационная флуоресценция могла быть обнаружена через 4 часа, для 4, 5 и 10 микрограммов sEV. Изучалось поглощение PKH 26 меченых sEV первичными астроцитами, и максимальная флуоресценция от поглощения sEVS в первичных корковых астроцитах происходила через 24 часа, когда были взяты PKH26-меченые sEV, а максимальная флуоресценция наблюдалась через 6 часов после инъекции в нейроны астроцитов и микроглиальные клетки.
Включение элементов управления, немаркированных sEV и управления красителем создает код для ветра ложноположительных недавних сигналов из-за теперь специфической маркировки Opry dance несвязанным красителем пятен побережья. Поглощение seV может быть подтверждено путем исследования биомолекулярного переноса груза в рецептуру и клетки и ткани и определения изменений в уровнях экспрессии биомолекул или генов-мишеней. Также могут быть проведены поведенческие исследования, чтобы исследовать функциональное влияние доставки sEV.
