Этот протокол может помочь улучшить выход предсердий из перфузированного сердца мыши. Основным преимуществом этого метода является то, что предсердный и желудочковый миоциты могут быть выделены одновременно при одном и том же состоянии пищеварения. Этот метод может дать представление о механизмах сердечных заболеваний на клеточном и субклеточном уровне.
После усыпления восьми-10-недельного самца черной шестимышки C57 используйте тканевые щипцы, чтобы подтянуть кожу мечевидного. Затем с помощью тканевых ножниц сделайте незначительный боковой разрез через кожу. Выполните тупое рассечение между кожей и фасцией.
Вытяните кожный разрез по направлению к подмышечным впадинам в форме V с обеих сторон и продолжайте разрез через грудную клетку. Затем, используя тканевые щипцы, зажмите грудину и отклоните грудную клетку вверх, чтобы полностью обнажить сердце и легкие. Используя изогнутые щипцы, отклейте перикард.
Если вилочковая железа покрывает большие сосуды, используйте два изогнутых щипца, чтобы разорвать вилочковую железу в обе стороны, а затем осторожно потяните основание сердца к хвосту, пока аорта и ее ветви не будут видны как Y-образный кровеносный сосуд. Трансекция аорты в левой общей сонной артерии, затем перерезание брахиоцефальной артерии. Иссекните сердце и немедленно погрузите его в чашку Петри, содержащую раствор Тирода, чтобы промыть и откачать остаточную кровь.
Затем переложите сердце на другую чашку Петри, содержащую раствор одного. Под стерео микроскопом, используя тонкие ножницы радужной оболочки глаза, обрежьте любую лишнюю ткань. Выталкивайте пузырьки воздуха из шприца.
Затем с помощью двух прямых щипцов выполняют ретроградную канюляцию аорты, заботясь о том, чтобы весь процесс канюляции выполнялся под поверхностью жидкости. Отрегулируйте глубину канюляции так, чтобы кончик канюли находился в восходящей аорте, следя за тем, чтобы не проникнуть в аортальные клапаны. Затем с помощью предварительного узла 3-O швом прижим аорту до выемки канюли.
Осторожно введите один раствор из шприца, чтобы вымыть остаточную кровь. Затем подключите канюлированное сердце к аппарату Лангендорфа, следя за тем, чтобы не вводить пузырьки воздуха в сердце. После подключения канюлированного сердца к аппарату Лангендорфа перфузируйте сердце раствором один в течение примерно двух минут.
Используя одноразовую стерильную полиэтиленовую пипетку, наберите около 2,5 миллилитров раствора три и предварительно согрейте его на водяной бане для последующего использования. Затем, чтобы переварить ткани, перфузируйте сердце оставшимся раствором тремя в течение примерно 11-12 минут. После первых двух минут перфузии с раствором три рециркулируйте перфузированный раствор в резервуары перфузата перистальтическим насосом для повторного использования до завершения пищеварения.
Когда сердце становится опухшим, становясь слегка бледным и дряблым, используя зубчатые щипцы, аккуратно защемляют миокард. Если виден отпечаток, прекратите пищеварение и отсоедините сердце от аппарата. Чтобы выделить артериальные и желудочковые миоциты, используйте щипцы для удаления желудочков и предсердий и поместите их в разные чашки Петри.
Затем добавить предварительно подогретый раствор тремя в оба блюда. Используя тупые щипцы, тритурируйте ткани в мутную текстуру, затем аккуратно пипетируйте ткань для равномерного пищеварения без введения пузырьков воздуха. Чтобы остановить оставшуюся активность фермента, используя пипетку, переместите мутную переваренную ткань в раствор четыре, затем центрифугу в течение 20 секунд при 192 разах G. После удаления супернатанта повторно суспендируйте клеточный осадок в растворе пять.
Чтобы избежать парадокса кальция и перегрузки кальцием, повторно вводите кальций поэтапно, постепенно добавляя в клеточную суспензию в общей сложности 50 микролитров по 100 миллимоляров на литр хлорида кальция. После того, как весь хлорид кальция был добавлен, храните клетки в растворе Tyrode для исследования зажима пластыря. Глубина канюляции связана с перфузией предсердий и их придатков.
Когда кончик канюли находится на восходящей аорте, оба предсердных придатка раздуваются, что указывает на достаточную перфузию предсердий. Однако, когда кончик канюли находится у корня аорты, оба предсердных придатка увядаются, что указывает на недостаточную перфузию. Предсердные миоциты, выделенные путем каннуляции в восходящей аорте, имели более высокие показатели выживаемости, чем те, которые были выделены путем каннуляции в корне аорты как до, так и после реинтродукции кальция.
Напротив, не было различий в показателях выживаемости желудочковых миоцитов, выделенных путем каннуляции ни в восходящей аорте, ни в корне аорты как до, так и после реинтродукции кальция. Запись зажимом цельноклеточного пластыря напряжения тока натрия в изолированных предсердных и желудочковых миоцитах, а также плотности тока подтверждают, что качество изолированных клеток соответствует требованиям электрофизиологических экспериментов. При трансекции аорты убедитесь, что в ней достаточно железы для перевязки.
В противном случае канюля может проникнуть в аортальный клапан после перевязки.
