Этот метод предоставляет решения для сегодняшних сложных биологических вопросов. В ходе эксперимента по FPOP в клетках мы можем изучать взаимодействия белково-лиганда, сайты взаимодействия белково-белков и области конформации. Преимуществом этой технологии является использование автоматизированной платформы IC-FPOP на основе шести хорошо, которая позволяет выращивать клетки и проводить исследования FPOP в клетках прямо на лазере.
Этот метод может быть использован в фармацевтической и биотехнологической промышленности, а также крупных академических и клинических научно-исследовательских институтов, особенно биологических исследователей в университетах, изучающих динамику белка. Для начала отвинтить инкубатор платформы от стадии позиционирования и отключить температуру, газ и увлажнители линий. Спрей инкубатор с 70%этанола и поместить его в капюшон культуры клеток.
Удалите шести-хорошо пластины из платформы инкубатора, обеспечить оригинальную крышку пластины, и подтвердить слияние клеток с помощью микроскопа, а затем поместить шесть хорошо пластины с слиянием клеток обратно в платформу инкубатора внутри ячейки культуры капот. Вставьте три предварительно вырезать Tygon труб в каждом хорошо через встроенные порты, промывка труб к стенам хорошо и обеспечить их пользовательских 3D печатных колец. Подготовь сценарий интеграционного программного обеспечения для вывода насоса.
Используйте один перистальтический насос, чтобы полностью удалить клеточные средства массовой информации из всех шести скважин. Премьер растворителей в каждом канале из трех других перистальтических насосов, а затем наполнить перекиси водорода и буфера утоления в своих соответствующих переменных труб, пока реагенты не достигнут инкубатора портов. Подтвердите, что лазерный луч был правильно под углом и достигает инкубатора раскованным.
Проверьте лазерную энергию с помощью внешнего датчика. Подготовь сценарий интеграционного программного обеспечения для инфузии насоса после подтверждения выравнивания пучка. Настоять 200 миллимолярный перекись водорода на 35 миллилитров в минуту в первую колодец.
Нажмите кнопку запуска на лазерном программном обеспечении на пяти секундной отметке, чтобы вызвать импульс на 11-секундной отметке на таймере. Настоять 125 миллимолярный раствор утоления при 35 миллилитров в минуту в первую колодец сразу после лазерного импульса. Вручную переместив этап позиционирования, чтобы выровнять следующую скважину с лазерным лучом и повторить процесс для всех скважин.
В капюшоне культуры клетки, используйте скребок клетки для того чтобы перенести клетки от каждого наилучшим образом в индивидуальные 15 миллилитров конических пробок. Центрифуг клетки на 1200 раз G в течение пяти минут. Отбросьте супернатант и повторно посовелите клетки в 100 микролитров буфера лиза RIPA.
Передача клеток в отдельные 1,2 миллилитровые полипропилевые трубки. Flash заморозить все образцы в жидком азоте и поместить их в морозильную камеру минус 80 градусов до использования. Чтобы локализовать модификации FPOP, проанализируйте лизат переваренной клетки с помощью жидкого хроматографического тандемного анализа масс-спектрометрии, а затем вычислите степень модификации.
Чтобы подтвердить, что условия инкубатора платформы достаточны для клеточной культуры на лазерной платформе, GCaMP2 был временно трансфицирован в HEK293T, и эффективность трансфекции для обеих пластин была оценена с помощью флуоресценции. Анализ люциферазы был выполнен для количественной оценки эффективности трансфекции. Модификации FPOP в ячейках HEK293T, помеченных в системе потока, сравнивались с изменениями, обозначенными в инкубаторе платформы.
Инкубатор платформы превзошел систему потока как по количеству модифицированных белков, так и по общей охвату FPOP в этих белках. В системе потока были обнаружены два модифицированных пептида, обеспечивающих ограниченную структурную информацию. Тем не менее, пять модифицированных пептидов, охватывающих актин последовательность были обнаружены в платформе инкубатора.
Тандем MS спектр актина с модифицированной пролин в обеих системах и неизмененных актин пептид показаны здесь. Модифицированные остатки FPOP в образцах инкубатора платформы содержали 12 модифицированных остатков, три модифицированных остатка в системе потока и один перекрывающийся модифицированный остаток. Анализ LC-MS MS показал, что 792 белка были модифицированы in vivo FPOP в инкубаторе платформы по сравнению с 545 белками, модифицированными с системой потока.
Крайне важно держать клетки в стерильных условиях. Всегда принесите инкубатор платформы в стерильный капюшон культуры клетки для того чтобы вставить все необходимые плиты six-well, трубки, и кольца. Это обеспечивает целостность эксперимента.
