Этот микроскопический протокол расширения позволяет исследователю визуализировать гломерулярные белки с наномасштабным разрешением на обычном микроскопе. Основным преимуществом микроскопии расширения является то, что она доступна для большого научного сообщества. Начните с создания спейсеров для гелеобразной камеры.
Стеклянная крышка номер один и номер 1,5 скользит в пятимиллиметровые полосы, используя алмазный нож. Поместите стеклянную горку в окрашивание камеры и распоистить номер 1,5 крышки скольжения полосы на стеклянной слайд, так что они образуют 2,5 сантиметра площади. Pipette капли двойной дистиллированной воды в углах площади придерживаться стеклянной крышкой скольжения полос друг к другу и к стеклянной горке.
Подождите около 20 минут, чтобы число 1,5 крышки скользит ножом прилагается. Pipette капли воды на каждом номере 1.5 крышка скольжения полосы. Поместите четыре полосы стеклянной крышки номер один на квитанции крышки номер 1.5.
Для крышки гелеобразной камеры оберните крышку стеклом с парафиновой пленкой, избегая каких-либо складок или грязи на пленке. Для крепления лечения, удалить PBS из иммунных окрашенных клеток и добавить 250 микролитров якорного буфера на хорошо непосредственно на стеклянной крышке скольжения. Инкубировать тарелку в течение трех часов при комнатной температуре.
Держите субстрат в темноте с помощью коробки. После инкубации снимите якорный буфер и вымойте крышку скольжения один раз с 1,5 миллилитров PBS на колодец. Чтобы испачкать актиновые волокна, оттаивать раствор фаллоидин, совместимый с EXM, и инкубировать его в течение 45 минут при комнатной температуре.
Между тем, растворить акрилат натрия в двойной дистиллированной воде с помощью перемешивания устройства и подготовить раствор мономера на льду. Удалить фаллоидин из клеток и мыть их с 1,5 миллилитров PBS, в два раза, при комнатной температуре. Оставьте 1,5 миллилитров PBS в колодец после последней стирки.
Используйте типсы и канюлю, чтобы поднять крышку стекла скольжения из шести пластины хорошо и поместить его в камеру геля. Добавьте APS к раствору для гелеобразования и вихрю кратко. Пипетка 200 микролитров гелеобразного раствора на образце и осторожно закрыть камеру, избегая пузырьков воздуха в гель.
Добавить воду в окрашивание камеры, и инкубировать окрашивание камеры, по крайней мере один час при 37 градусов по Цельсию для полимеризации геля. Вывеми окрашивание камеры из инкубатора. Чтобы открыть крышку гелеобразной камеры, ввемите лезвие бритвы между крышкой и спейсером и осторожно снимите крышку.
Удалите проемы с лезвием бритвы и отрезать все дополнительные гель. Используйте кисть краски, чтобы отделить края геля. Положите слайд с гелем и крышка стекла в блюдо, наполненное PBS.
Затем снимите отдельно стоящее стекло крышки с геля, встряхивая его мягко. Положите слайд ниже геля, чтобы прикрепить гель к слайду. С гелем на слайде, разделить гель на мелкие кусочки с помощью лезвия бритвы.
Аккуратно нажмите один кусок геля в колодец из шести хорошо пластины со стеклянным дном и развернуть его с кистью. Используйте кисть, чтобы сохранить гель увлажненным с небольшим количеством PBS. Используя перевернутый микроскоп, сделайте обзорные снимки с низкой численной диафрагмой для изображений, сделанных до расширения.
Разбавить Proteinase K до четырех единиц на миллилитр в буфер пищеварения, чтобы сделать пищеварение решение. Добавьте 500 микролитров раствора пищеварения к каждой хорошо, и погрузите гель в раствор. Пусть он переваривается на ночь при комнатной температуре с закрытой крышкой, чтобы держать образцы в темноте.
Удалите раствор пищеварения с помощью пипетки и отбросьте его. Добавьте один миллилитр двойной дистиллированной воды и инкубировать погруженный гель в течение 10 минут при комнатной температуре. Удалите воду и добавьте один миллилитр свежей, двойной дистиллированной воды.
Продолжайте обмениваться водой каждые 10 минут, пока плато расширения не будет достигнуто, в результате чего гель станет оптически ясным. Снимите воду с геля и немедленно начните микроскопию. Используя перевернутый микроскоп, используйте воздушную цель при низком увеличении, чтобы найти клетки в состоянии предварительного расширения.
Переключитесь на 40 X и 63 X целей для лучшего разрешения. Возбуждайте с длиной волны интереса и возьмите изображение через камеру. Этот протокол EXM позволяет расширить до четырех раз.
Для определения фактора расширения необходимо изображение ячеек до и после расширения. Недостаточное закрепления и гомогенизация может привести к искажениям и разрывам клеток. Здесь показаны репрезентативные примеры разорванных ячеек.
Этот метод может быть использован для исследования колокализации F-актина и белка адаптера актина, таких как подоцин и нефрит. Подоцин изображен зеленым цветом, актин - синим, нефрин - красным. Белые области указывают на колокализацию.
Флуоресцентные интенсивности сигнала и изобилия являются ключевыми для успешного EXM. Эффективная закрепления флуоресцентных красителей через ACX имеет решающее значение для этого протокола. В наших руках solubilized ACX хорошо на срок до трех-четырех месяцев.
