Выделение и пролиферация стволовых клеток, полученных из жиров, производит большое количество стволовых клеток, которые могут быть использованы для нескольких последующих применений и экспериментальных методов. Основным предполагаемым использованием дифференцированных адипоцитов в этом протоколе являются метаболические анализы, такие как инсулин, стимулируемый поглощением глюкозы, липогенез и стимулированный липолиз. Для начала создайте стерильную рабочую среду, продезинфицировав вытяжку биобезопасности и все инструменты.
Пипетка примерно 10 миллилитров из пяти буферов PBS в четыре 100-миллиметровые чашки для культивирования клеток. Переложите 50-граммовый образец жировой массы в одну из посуд и вымойте его четыре раза, последовательно переместив его через другие блюда, содержащие пять PBS. Затем переложите промытую жировую ткань в чистую 100-миллиметровую культуральную посуду и тщательно измельчите ее ножницами или стерильными щипцами.
Переложите от одного до трех сантиметров измельченной ткани в коническую трубку объемом 50 миллилитров, содержащую 13 миллилитров коллагеназного буфера. Смойте оставшуюся ткань из чашки для культивирования двумя миллилитрами коллагеназного буфера, чтобы обеспечить общий объем 15 миллилитров. Тщательно перемешайте образец, используя 25-миллилитровую серологическую пипетку, и высиживайте трубку при 37 градусах Цельсия на коромысле в течение 30-60 минут.
Чтобы нейтрализовать активность фермента, добавьте 10 миллилитров питательной среды ADSC в трубку после инкубации и хорошо смешайте ее с пипеткой для разделения любых тканевых агрегатов. Переложите жидкую часть в новую стерильную коническую трубку объемом 50 миллилитров, оставив твердую ткань. Промыть ткань три раза, используя семь миллилитров двух PBS и перенести жидкость в новую трубку.
Затем центрифугируйте трубку в 500 раз G в течение пяти минут и осторожно удалите как можно больше супернатанта, не нарушая гранулу. Повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре 1X эритроцита или буфера лизиса эритроцитов и инкубируют его при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем промыть клетки дважды, добавив пять миллилитров питательной среды ADSC в трубку и центрифугируя, чтобы удалить супернатант.
После последней промывки повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах питательной среды ADSC и отфильтруйте ее через 70-микронный клеточный сетчатый фильтр в стерильную коническую трубку размером 50 миллилитров. Смойте ситечко дополнительными двумя миллилитрами среды и переложите четыре миллилитра суспензии в стерильную 100-миллилитровую культуральную чашку. Промыть коническую трубку дважды тремя миллилитрами среды, чтобы собрать общий объем 10 миллилитров в чашке для культуры.
Понаблюдайте за собранными клетками под перевернутым микроскопом при 10-кратном увеличении, чтобы проверить наличие плавающих клеток. Инкубируйте клетки в течение 24 часов в инкубаторе углекислого газа при 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа и 100% относительной влажности. Чтобы обеспечить стерильность питательных сред, включите тарелку только со средой.
Через 24 часа просмотрите клетки под инвертированным микроскопом, чтобы проверить сцепление клеток. Удаляйте и заменяйте среду теплой средой каждые 48 часов, пока клетки не станут сливающимися на 80-90%. Для пролиферации удаляют питательную среду из сливающихся клеток ADSC и дважды промывают их двумя миллилитрами стерильной PBS комнатной температуры.
Аспирируйте PBS и добавьте два миллилитра 0,25% трипсина ЭДТА в каждую культуральную пластину, покрывая всю площадь поверхности пластины. Инкубируйте пластину в течение семи минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, затем механически вытесняйте трипсинизированные клетки путем принудительного пипетирования. Добавьте два миллилитра питательной среды ADSC и аккуратно перемешайте клетки.
Переложите ячейки в коническую трубку объемом 50 миллилитров, промыв посуду дополнительными двумя миллилитрами среды, чтобы обеспечить максимальное извлечение клеток из пластины. Затем центрифугируют трубку в 500 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре и декантируют супернатант для получения гранулы ячейки. Повторное суспендирование клеточной гранулы в пяти-шести миллилитрах среды роста ADSC на миллион клеток.
Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и нанесите на них пластины, как описано в текстовой рукописи. Как только клетки достигнут 80-90% сливаемости, аспирируют питательную среду и промывают клетки стерильной комнатной температурой PBS, затем добавляют 10 миллилитров среды дифференцировки ADSC. Заменяйте среду каждые три дня в течение примерно 14-21 дня.
Наблюдайте за клетками на наличие капель липидов под инвертированным микроскопом при 40-кратном увеличении. Зрелые адипоциты обычно наблюдаются через 14 дней. В день нанесения покрытий ADSC не соблюдались и плавали в культуре.
Клетки стали на 80% сливающимися через 72 часа и были готовы к дифференцировке адипоцитов. После 14 дней дифференцировки ADSC зрелые адипоциты проявляли сильные адипогенные характеристики, которые наблюдались при 40-кратном увеличении. На 14-й день клетки окрашивали и фиксировали маслом Red O и BODIPY для визуализации липидных капель.
Дифференцированные адипоциты могут наблюдаться при 20-кратном увеличении. При попытке этого протокола важно помнить, что стерильная рабочая среда имеет решающее значение для здоровой изоляции, адекватного расширения и эффективной дифференцировки стволовых клеток, полученных из жировой ткани. После этой процедуры эти клетки могут быть использованы для нескольких метаболических анализов, таких как поглощение глюкозы, липогенез и липолиз, который является основным направлением наших исследований.
Этот метод позволяет исследовать, как хронический алкоголь и SIV влияют на метаболическую способность адипоцитов.
